甲基丙烯酸酐改性明胶/经处理牙本质基质生物活性支架的制备及性能

doi:10.12307/2024.537

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (22): 3555-3560.doi: 10.12307/2024.537

• 组织工程口腔材料 tissue-engineered oral materials • 上一篇下一篇

甲基丙烯酸酐改性明胶/经处理牙本质基质生物活性支架的制备及性能

程梦可1，杨杜娟1，刘佳1，2

1新疆医科大学第一附属医院(附属口腔医院)儿童口腔科-口腔预防科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054；2新疆维吾尔自治区口腔医学研究所，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054

收稿日期:2023-10-18 接受日期:2023-11-25 出版日期:2024-08-08 发布日期:2024-01-20
通讯作者: 刘佳，博士，副主任医师，副教授，硕士生导师，新疆医科大学第一附属医院(附属口腔医院)儿童口腔科-口腔预防科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054；新疆维吾尔自治区口腔医学研究所，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054
作者简介:程梦可，女，1998年生，新疆维吾尔自治区石河子市人，汉族，新疆医科大学在读硕士，主要从事儿童口腔学及牙齿再生方向的研究。
基金资助:
新疆维吾尔自治区研究生实践创新项目(XJ2023G176)，项目负责人：程梦可

Preparation and performance of gelatin modified by methacrylic anhydride/treated dentin matrix bioactive scaffolds

Cheng Mengke1, Yang Dujuan1, Liu Jia1, 2

1Department of Children’s Stomatology -Department of Stomatological Prevention, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University (Affiliated Stomatological Hospital), Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 2Xinjiang Uyghur Autonomous Region Institute of Stomatology, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Received:2023-10-18 Accepted:2023-11-25 Online:2024-08-08 Published:2024-01-20
Contact: Liu Jia, MD, Associate chief physician, Associate professor, Master’s supervisor, Department of Children’s Stomatology -Department of Stomatological Prevention, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University (Affiliated Stomatological Hospital), Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; Xinjiang Uyghur Autonomous Region Institute of Stomatology, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Cheng Mengke, Master candidate, Department of Children’s Stomatology -Department of Stomatological Prevention, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University (Affiliated Stomatological Hospital), Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
Graduate Practice Innovation Project of Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. XJ2023G176 (to CMK)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

甲基丙烯酸酐改性明胶：是一种由明胶和甲基丙烯酸酐反应得到的光交联水凝胶，通过引入甲基丙烯酸酐的酸酐官能团增加了明胶的功能化修饰并提高了明胶性能，使其具有更好的生物相容性，可用于组织工程、二维/三维细胞培养。
经处理牙本质基质：是将牙本质通过脱矿、冲洗、冻干和磨碎等工序制备出的一种天然生物材料，具有疏松多孔的结构及良好的生物相容性，可以促进牙髓干细胞的增殖分化。

背景：牙髓-牙本质再生一直是近几年研究的热点及难点，构建复合生物支架材料为牙髓-牙本质再生提供了新的思路与方法。

目的：观察甲基丙烯酸酐改性明胶/经处理牙本质基质支架对人牙髓干细胞增殖、迁移与成骨分化的影响。
方法：将不同质量的经处理牙本质基质分散至甲基丙烯酸酐改性明胶溶液中，使甲基丙烯酸酐改性明胶与经处理牙本质基质的质量比分别为2∶1、1∶1、1∶2，采用冷冻干燥法制备甲基丙烯酸酐改性明胶/经处理牙本质基质支架，检测支架的微观形貌、吸水率及机械性能。采用不同质量比的支架浸提液、DMEM培养基(对照组)分别培养人牙髓干细胞，检测细胞增殖与迁移情况。采用不同质量比的支架浸提液+成骨诱导液、DMEM培养基+成骨诱导液(对照组)分别培养人牙髓干细胞，碱性磷酸酶染色分析成骨能力。

结果与结论：①扫描电镜下可见3组支架均具有多孔结构，随着支架中经处理牙本质基质质量的增加，支架的孔隙率升高，组间两两比较差异有显著性意义(P < 0.05)；随着支架中经处理牙本质基质质量的增加，支架的吸水率升高，组间两两比较差异有显著性意义(P < 0.05)；随着支架中经处理牙本质基质质量的增加，支架的抗压强度、剪切强度增大。②CCK-8检测显示培养3，5，7 d，2∶1、1∶1、1∶2支架组细胞增殖吸光度值均高于对照组(P < 0.05)，并且随着支架中经处理牙本质基质质量的增加，细胞增殖吸光度值升高(P < 0.05)；细胞划痕实验显示2∶1、1∶1、1∶2支架组细胞迁移率均大于对照组(P < 0.05)，并且随着支架中经处理牙本质基质质量的增加，细胞迁移率增大(P < 0.05)。③碱性磷酸酶染色显示，2∶1、1∶1、1∶2支架组细胞成骨分化能力均强于对照组，并且随着支架中经处理牙本质基质质量的增加，细胞成骨能力增强。④结果表明，甲基丙烯酸酐改性明胶与经处理牙本质基质质量比为1∶2的支架最适合牙髓干细胞的增殖与分化。

https://orcid.org/0009-0007-6830-2063(程梦可)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 牙髓-牙本质再生, 组织工程, 复合生物材料, 经处理牙本质基质, 水凝胶, 甲基丙烯酸酐明胶, 人牙髓干细胞, 细胞增殖分化

Abstract: BACKGROUND: Pulp regeneration has been a hot and difficult research topic in recent years, and the construction of composite bio-scaffolding materials provides new ideas and methods for pulp regeneration.
OBJECTIVE: To observe the effect of freeze-dried gelatin modified by methacrylic anhydride/treated dentin matrix bioactive scaffolds on proliferation, migration, and osteogenic differentiation of human dental pulp stem cells.
METHODS: The mass ratios of gelatin modified by methacrylic anhydride and treated dentin matrix at 2:1, 1:1 and 1:2 were obtained by dispersing different masses of treated dentin matrix into gelatin modified by methacrylic anhydride solution. The gelatin modified by methacrylic anhydride/treated dentin matrix bioactive scaffolds were prepared by vacuum freeze-drying. The microstructure, water absorption, and mechanical properties of the scaffolds were measured. Human dental pulp stem cells were cultured with different mass ratios of scaffold extract and DMEM (control group) to detect cell proliferation and migration. Human dental pulp stem cells were cultured with different mass ratios of scaffold extract + osteogenic induction solution and DMEM + osteogenic induction solution (control group), and their osteogenic ability was analyzed by alkaline phosphatase staining.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Under scanning electron microscopy, the scaffolds of the three groups all had porous structures. The porosity of the scaffolds increased with the increase of treated dentin matrix quality, and there was significant difference between the two groups (P < 0.05). The water absorption of scaffolds increased with the increase of treated dentin matrix mass, and there was significant difference between groups (P < 0.05). The compressive strength and shear strength of the scaffold increased with the increase of the mass of treated dentin matrix. (2) CCK-8 assay showed that after 3, 5, and 7 days of culture, the cell proliferation absorbance values in the 2:1, 1:1, and 1:2 scaffold groups were higher than those in the control group (P < 0.05). The cell proliferation absorbance values increased with the increase of treated dentin matrix mass in the scaffold (P < 0.05). The cell scratch test showed that the cell migration rate in the 2:1, 1:1, and 1:2 scaffold groups was higher than that in the control group (P < 0.05), and the cell migration rate increased with the increase of treated dentin matrix mass in the scaffold (P < 0.05). (3) Alkaline phosphatase staining showed that the osteogenic differentiation ability of cells in the 2:1, 1:1, and 1:2 scaffold groups was stronger than that in the control group, and the osteogenic ability of cells was enhanced with the increase of treated dentin matrix mass in the scaffold. (4) The results showed that the scaffold with a mass ratio of 1:2 between gelatin modified by methacrylic anhydride and treated dentin matrix was the most suitable for the proliferation and differentiation of dental pulp stem cells.

Key words: pulp-dentin regeneration, tissue engineering, composite bio-materials, treated dentin matrix, hydrogel, gelatin modified by methacrylic anhydride, human dental pulp stem cell, cell proliferation and differentiation

中图分类号:

程梦可, 杨杜娟, 刘佳. 甲基丙烯酸酐改性明胶/经处理牙本质基质生物活性支架的制备及性能[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(22): 3555-3560.

Cheng Mengke, Yang Dujuan, Liu Jia. Preparation and performance of gelatin modified by methacrylic anhydride/treated dentin matrix bioactive scaffolds[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(22): 3555-3560.

图/表（结果） 10

2.1 各组支架大体形态观察结果冷冻干燥后不同质量比支架的大体图像，见图1。随着支架中TDM质量的增加，支架的颜色逐渐发黄。

2.2 各组支架微观形貌观察结果扫描电镜下可见3组支架横截面呈多孔结构，见图2A。利用ImageJ软件测量支架的孔隙率，1∶2、1∶1、2∶1支架组的孔隙率分别为(41.06±0.76)%，(31.66±0.41)%，(28.52±0.41)%，3组支架孔隙率两两比较差异均有显著性意义(P < 0.05)，见图2B。

2.3 各组支架吸水率检测结果在相同时间点下，随着支架中TDM质量的增加，支架的吸水率升高，3组间两两比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见图3。

2.4 各组支架的机械性能检测结果在应变同为20%时比较3组支架的抗压性能，压缩应力-应变曲线结果显示，1∶2、1∶1、2∶1支架组所需的压缩强度分别为0.105，0.075，0.045 MPa，提示随着支架中TDM质量的增加，支架的抗压能力增大，见图4。

剪切应力-应变曲线显示，1∶2、1∶1、2∶1支架组断裂时所需的压力分别为0.032，0.017，0.012 MPa，提示随着支架中TDM质量的增加，材料抗压能力增大，见图5。

2.5 人牙髓干细胞培养与鉴定结果原代与第4代人牙髓干细胞的形态，见图6。第4代人牙髓干细胞高表达CD29 (99.98%)、CD105(70.27%)，低表达CD14(1.83%)、CD45 (5.33%)，见图7。

2.6 各组细胞增殖测定结果 CCK-8检测显示随着培养时间的延长，各组细胞增殖吸光度值均增加；培养1 d，4组细胞增殖吸光度值比较差异无显著性意义(P > 0.05)；培养3，5，7 d，1∶2、1∶1、2∶1支架组细胞增殖吸光度值均高于对照组(P < 0.05)，并且随着支架中TDM质量的增加，细胞增殖吸光度值升高，3支架组间两两比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见图8。

2.7 各组细胞划痕实验结果各组细胞划痕实验结果见图9。24 h后，对照组、1∶2支架组、1∶1支架组、2∶1支架组细胞迁移率分别为(38.20±0.36)%，(61.97±0.15)%，(51.20±0.20)%，(42.40±0.264 6)%，4组间两两比较差异均有显著性意义(P < 0.05)。

2.8 各组细胞碱性磷酸酶染色结果碱性磷酸酶染色程度能反映成骨分化水平，染色程度越深细胞成骨分化水平越高。随着诱导时间的延长，各组细胞染色程度加深；在相同诱导时间下，3支架组染色程度均比对照组深，并且随着支架中TDM质量的增加，细胞染色程度加深，见图10。

参考文献

[1] LEE HN, LIANG C, LIAO L, et al. Advances in Research on Stem Cell-Based Pulp Regeneration. Tissue Eng Regen Med. 2021;18(6):931-940.
[2] MARTIN-IGLESIAS S, MILIAN L, SANCHO-TELLO M, et al. BMP-2 Enhances Osteogenic Differentiation of Human Adipose-Derived and Dental Pulp Stem Cells in 2D and 3D In Vitro Models. Stem Cells Int. 2022;2022:4910399.
[3] VIMALRAJ S, SARAVANAN S. Tooth-derived stem cells integrated biomaterials for bone and dental tissue engineering. Cell Tissue Res. 2023;394(2):245-255.
[4] CABAÑA-MUÑOZ ME, PELAZ FERNÁNDEZ MJ, PARMIGIANI-CABAÑA JM, et al. Adult Mesenchymal Stem Cells from Oral Cavity and Surrounding Areas: Types and Biomedical Applications. Pharmaceutics. 2023;15(8):2109.
[5] ALARCÓN-APABLAZA J, PRIETO R, ROJAS M, et al. Potential of Oral Cavity Stem Cells for Bone Regeneration: A Scoping Review. Cells. 2023;12(10):1392.
[6] DELLE MONACHE S, MARTELLUCCI S, CLEMENTI L, et al. In Vitro Conditioning Determines the Capacity of Dental Pulp Stem Cells to Function as Pericyte-Like Cells. Stem Cells Dev. 2019;28(10):695-706.
[7] DAS M, SLOAN AJ. Stem cell sources from human biological waste material: a role for the umbilical cord and dental pulp stem cells for regenerative medicine. Hum Cell. 2023; 36(4): 1312-1325.
[8] ZHOU T, RONG M, WANG Z, et al. Conditioned medium derived from 3D tooth germs: A novel cocktail for stem cell priming and early in vivo pulp regeneration. Cell Prolif. 2021;54(11):e13129.
[9] XU K, XIAO J, ZHENG K, et al. MiR-21/STAT3 Signal Is Involved in Odontoblast Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Mediated by TNF-α. Cell Reprogram. 2018;20(2):107-116.
[10] BAKHTIAR H, MOUSAVI MR, RAJABI S, et al. Fabrication and characterization of a novel injectable human amniotic membrane hydrogel for dentin-pulp complex regeneration. Dent Mater. 2023; 39(8):718.
[11] ATKINSON I, SECIU-GRAMA AM, SERAFIM A, et al. Bioinspired 3D scaffolds with antimicrobial, drug delivery, and osteogenic functions for bone regeneration. Drug Deliv Transl Res. 2023. doi: 10.1007/s13346-023-01448-y
[12] 焦俊杰,李永丽,齐远征,等.脱矿牙本质基质在骨组织工程中应用的研究进展[J].现代口腔医学杂志,2021,35(2):120-123.
[13] HOLIEL AA, MUSTAFA HM, SEDEK EM. Biodegradation of an injectable treated dentin matrix hydrogel as a novel pulp capping agent for dentin regeneration. BMC Oral Health. 2023;23(1):126.
[14] CHANG CC, LIN TA, WU SY, et al. Regeneration of Tooth with Allogenous, Autoclaved Treated Dentin Matrix with Dental Pulpal Stem Cells: An In Vivo Study. J Endod. 2020;46(9):1256-1264.
[15] LIU S, SUN J, YUAN S, et al. Treated dentin matrix induces odontogenic differentiation of dental pulp stem cells via regulation of Wnt/β-catenin signaling. Bioact Mater. 2022;7:85-97.
[16] ATILA D, KUMARAVEL V. Advances in antimicrobial hydrogels for dental tissue engineering: regenerative strategies for endodontics and periodontics. Biomater Sci. 2023;11(20):6711-6747.
[17] HAO M, WANG D, DUAN M, et al. Functional drug-delivery hydrogels for oral and maxillofacial wound healing. Front Bioeng Biotechnol. 2023;11:1241660.
[18] STUBBE B, MIGNON A, VAN DAMME L, et al. Photo-Crosslinked Gelatin-Based Hydrogel Films to Support Wound Healing. Macromol Biosci. 2021;21(12):e2100246.
[19] CHOI D, QIU M, HWANG YC, et al. The Effects of 3-Dimensional Bioprinting Calcium Silicate Cement/Methacrylated Gelatin Scaffold on the Proliferation and Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells. Materials (Basel). 2022;15(6):2170.
[20] SEDEK EM, KAMOUN EA, EL-DEEB NM, et al. Photocrosslinkable gelatin-treated dentin matrix hydrogel as a novel pulp capping agent for dentin regeneration: I. synthesis, characterizations and grafting optimization. BMC Oral Health. 2023;23(1):536.
[21] CUNHA D, SOUZA N, MOREIRA M, et al. 3D-printed microgels supplemented with dentin matrix molecules as a novel biomaterial for direct pulp capping. Clin Oral Investig. 2023;27(3):1215-1225.
[22] LAMPIASI N. The Migration and the Fate of Dental Pulp Stem Cells. Biology (Basel). 2023;12(5):742.
[23] 牛卫东,刘润园.3D干细胞培养在牙髓再生研究中的应用[J].口腔医学研究,2021,37(11):961-965.
[24] 陈有荣,颜昕,叶景,等.不同水凝胶支架材料用于软骨损伤修复研究进展[J].中国运动医学杂志,2021,40(5):385-392.
[25] HOLIEL AA, MAHMOUD EM, ABDEL-FATTAH WM, et al. Histological evaluation of the regenerative potential of a novel treated dentin matrix hydrogel in direct pulp capping. Clin Oral Investig. 2021;25(4): 2101-2112.
[26] ABBASS MMS, EL-RASHIDY AA, SADEK KM, et al. Hydrogels and Dentin-Pulp Complex Regeneration: From the Benchtop to Clinical Translation. Polymers (Basel). 2020;12(12):2935.
[27] 曹春玲,韩冰,王晓燕.水凝胶用于牙髓再生的研究进展[J].国际口腔医学杂志,2021,48(2):192-197.
[28] MONTEIRO JL, TAKUSAGAWA T, SAMPAIO GC, et al. Gelatin methacryloyl hydrogel with and without dental pulp stem cells for TMJ regeneration: An in vivo study in rabbits. J Oral Rehabil. 2023. doi: 10.1111/joor.13608.
[29] BUPPHATHONG S, QUIROZ C, HUANG W, et al. Gelatin Methacrylate Hydrogel for Tissue Engineering Applications-A Review on Material Modifications. Pharmaceuticals (Basel). 2022;15(2):171.
[30] 李泓,张静,陈可,等.羟基磷灰石纳米纤维增强甲基丙烯酸酐改性明胶复合水凝胶的制备及性能 [J].复合材料学报,2020,37(10): 2572-2581.
[31] WANG L, FU H, WANG W, et al. Notoginsenoside R1 functionalized gelatin hydrogels to promote reparative dentinogenesis. Acta Biomater. 2021;122:160-171.
[32] 李锐,付昊杰,孙晶晶,等.处理牙本质基质浸提液对牙髓干细胞成牙分化的影响[J].郑州大学学报(医学版),2023,58(3):310-315.
[33] WEN B, HUANG Y, QIU T, et al. Reparative Dentin Formation by Dentin Matrix Proteins and Small Extracellular Vesicles. J Endod. 2021;47(2): 253-262.
[34] HUANG Y, ZHANG Z, BI F, et al. Personalized 3D-Printed Scaffolds with Multiple Bioactivities for Bioroot Regeneration. Adv Healthc Mater. 2023;12(28):e2300625.
[35] LI H, MA B, YANG H, et al. Xenogeneic dentin matrix as a scaffold for biomineralization and induced odontogenesis. Biomed Mater. 2021;16(4):5020.
[36] 孔祥宇,王兴,裴志伟,等.生物支架材料及打印技术修复骨缺损[J].中国组织工程研究,2024,28(3):479-485.
[37] 王晓龙,黄浩然,张忠欣,等.肌腱组织工程支架生物材料与孔隙特征[J].中国组织工程研究,2024,28(15):2398-2403.

引言

牙髓炎是牙齿根管内的感染性疾病，治疗方法主要是根管治疗，但治疗后的牙齿因缺乏神经血管的营养供给而存在一些术后并发症(如牙根纵裂)，远期效果有待商榷。随着材料学和细胞生物学的迅速发展，利用组织工程技术进行牙髓-牙本质再生已成为一种新的趋势[1]，该技术将干细胞、支架材料和生物活性分子结合起来模拟出细胞外间质结构，从而促进组织修复和再生[2]。越来越多的证据证明，牙源性干细胞在牙髓-牙本质再生中有广阔的应用前景[3-5]。牙髓干细胞作为一种牙源性干细胞不仅具有修复牙本质、维持牙齿血管和神经稳态的功能[6]，还拥有自我更新、免疫调节等优势[7-8]；另外在含不同生长因子的培养基中，牙髓干细胞可转化为不同细胞类型，例如成牙本质细胞、成骨细胞、神经细胞、软骨细胞和脂肪细胞[9]，因此它是牙髓-牙本质再生的重要来源。
支架材料在牙髓-牙本质再生中发挥着重要的桥梁作用，可显著增强牙源性干细胞的增殖分化能力[10-11]。经处理牙本质基质(treated dentin matrix，TDM)是以自体牙本质为基础去除牙釉质、牙骨质和牙髓后，将剩余的牙本质通过完全脱矿或梯度脱矿、冲洗、冻干和磨碎等工序产生的脱细胞基质材料[12-14]，主要成分包括多种牙源性蛋白和生长因子(如转化生长因子β1、重组人牙本质基质蛋白1和人牙本质涎磷蛋白等[15])，是制备支架材料的原料。随着研究的深入，越来越多的学者专注于制备复合支架材料，以求发挥材料更好的性能。当前，国内外对制备复合支架材料的研究大多集中于天然高分子水凝胶[16-17]，甲基丙烯酸酐改性明胶(gelatin modified by methacrylic anhydride，Gel-MA)是由明胶和甲基丙烯酸酐反应得到的光交联水凝胶，结构与细胞外基质相
似[18]，具有良好的生物降解性和生物相容性[19-20]。有研究发现，利用光交联制备的Gel-MA与TDM复合支架具有良好的生物活性和生物相容性，可作为盖髓材料促进犬牙本质再生[20]。另外，CUNHA等[21]利用3D打印技术将Gel-MA与TDM结合在大鼠实验性牙髓炎中进行盖髓，结果显示有组织性牙髓组织、第三期牙本质、新形成的管状牙本质及新血管形成。此次实验将Gel-MA与TDM制备成复合生物支架材料，观察其物理性能及对人牙髓干细胞增殖、分化的影响。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计分组对照观察实验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用独立样本t检验。
1.2 时间及地点实验于2023年3-8月在新疆医科大学第一附属医院医学研究中心完成。
1.3 材料
1.3.1 牙齿材料 2023年3-5月于新疆医科大学附属口腔医院牙槽外科收集无龋坏、无根管治疗的阻生齿或因正畸需要拔除的牙齿。供者对实验知情同意并签署了知情同意书。实验方案已通过新疆医科大学第一附属医院医学伦理委员会批准，伦理审批号：K202308-24。
1.3.2 实验试剂 DMEM培养基、PBS(cytiva，美国)；双抗(青-链霉素)、胎牛血清、胰蛋白酶(BI，以色列)；甲基丙烯酸酐明胶(阿拉丁，美国)；EDTA、胶原酶Ⅰ(索莱宝，中国)，细胞增殖毒性检测试剂盒CCK-8(Proteintech，美国)；人相关干细胞成骨诱导分化试剂盒(Cyagen，美国)；碱性磷酸酶染色试剂盒(碧云天生物技术有限公司，中国)。
1.4 实验方法
1.4.1 TDM的制备去除牙齿的牙周组织、牙冠、根尖部分2 mm牙根、表面牙釉质、牙骨质及髓腔侧前期牙本质，蒸馏水超声清洗后依次置于不同浓度EDTA溶液中梯度脱矿(17 mol/L、10 min；10 mol/L、5 min；5 mol/L、10 min)，然后研磨筛取粒径200 μm左右的颗粒，经高压蒸汽灭菌(121 ℃，30 min)、紫外线消毒30 min后，4 ℃保存使用。
1.4.2 Gel-MA溶液的制备将Gel-MA以质量浓度为100 g/L溶解于PBS中，70 ℃水浴加热并持续搅拌至完全溶解，滤器过滤后4 ℃保存。
1.4.3 Gel-MA/TDM支架的合成将无菌TDM分散至Gel-MA溶液中得到Gel-MA/TDM混合溶液，使Gel-MA与TDM的质量比分别为1∶2、1∶1、2∶1，超声下混匀，然后取1 mL转移至6孔板中，放入-80 ℃冰箱中冷冻24 h，真空冷冻干燥(-20 ℃)24 h后于-20 ℃保存备用。
1.4.4 Gel-MA/TDM支架的材料表征
支架大体外观观察：将3组Gel-MA/TDM支架从6孔板中取出，放在一起进行比较和摄影。
支架微观形貌：使用液氮将每个支架样品切成厚度约为3 mm的正方体，常规涂覆金膜后通过扫描电镜观察支架的内部结构，每种支架选取4块样品，采用 Image J 图像可视化软件对样品进行孔隙率测量，孔隙率=孔隙面积之和/图片像素面积。
支架吸水率的测定：通过称重法计算支架吸水率，将3组支架冷冻干燥后称质量，记为m0，然后将3组支架置于37 ℃的PBS中，在预定的时间点(0.5，2，4，12 h)取样，用纱布擦拭支架表面的水分后再次称质量，记为m1。每组3个重复样。支架吸水率=(m1-m0)/m0。
支架机械性能测定：选取3组支架样品中形态标准者(直径约为1 cm的圆柱体)，使用通用万能试验机对样品进行压缩和剪切实验，加载速度设定为 2 mm/min，绘制压缩应力、剪切应力-应变实时曲线图，以评估支架的抗压强度与剪切强度。
1.4.5 人牙髓干细胞的分离与培养[22] 将收集的健康智齿或前磨牙置于预冷的PBS中，2 h内送至超净台内，用含有体积分数为1%双抗(青-链霉素)的DMEM培养基自根尖至冠部反复轻柔冲洗，无菌条件下劈开牙齿，去除根尖1/3牙髓组织及冠髓，取出剩余牙髓组织，剪碎，以3 g/L Ⅰ型胶原酶消化(37 ℃)30 min，内容物呈絮状后终止消化，1 000 r/min离心5 min，弃去上清，加入完全培养基(含体积分数89% DMEM培养基、体积分数10%胎牛血清、体积分数1%双抗)轻柔吹打后均匀接种于培养瓶中，置于体积分数5%CO2、37 ℃培养箱中培养，两三天换一次液。取4代人牙髓干细胞用于后续实验。
取第4代人牙髓干细胞，采用流式细胞仪检测细胞表面标志物CD14、CD45、CD29、CD105的表达。
1.4.6 支架对人牙髓干细胞增殖、迁移与成骨分化的影响
支架浸提液的制备：将冷冻干燥后的支架以1%的浓度溶于DMEM培养基中，37 ℃培养箱中放置3 d，过筛(0.22 μm)收集浸提液，保存于4 ℃冰箱。
细胞增殖测定：将第4代人牙髓干细胞悬液以1×103/孔的密度接种于96孔板中，待细胞贴壁后吸去培养基，分4组处理，分别加入2∶1、1∶1、1∶2支架浸提液与DMEM培养基，每孔100 μL。每组4个复孔。培养1，3，5，7 d后，每孔加入10 μL CCK-8试剂37 ℃下孵育 2 h，在450 nm波长处测定吸光度值。
细胞划痕实验：将第4代人牙髓干细胞悬液以1×105/孔的密度接种于6孔板中，待细胞贴壁后吸去培养基，分4组处理，分别更换为2∶1、1∶1、1∶2支架浸提液与DMEM培养基，每孔2 mL，用100 µL枪头的尖端刮擦划一道划痕，并将细胞再培养24 h。每组3个复孔。0 h和24 h在同一位置用倒置显微镜拍照，计算细胞迁移率。细胞迁移率=(0 h划痕宽度-24 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%。
碱性磷酸酶染色：将第4代人牙髓干细胞悬液以1×105/孔的密度接种于6孔板中，培养24 h后分4组处理：分别更换为2∶1支架浸提液1 mL+人相关干细胞成骨诱导液1 mL、1∶1支架浸提液1 mL+人相关干细胞成骨诱导液1 mL、1∶2支架浸提液1 mL+人相关干细胞成骨诱导液1 mL、DMEM培养基1 mL+成骨诱导液1 mL，隔天换液。每组3个复孔。诱导培养7，14 d后，以PBS清洗3次，加入40 g/L多聚甲醛固定30 min，使用碱性磷酸酯酶染色试剂盒进行染色，倒置显微镜下观察并拍照。
1.5 主要观察指标 3组支架的微观形貌、吸水率及机械性能，3组支架对人牙髓干细胞增殖、迁移与成骨分化的影响。
1.6 统计学分析采用Graphpad 9.4.0统计软件进行数据分析。数据以x±s表示。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用独立样本t检验。检验水准 α=0.05，P < 0.05为差异有显著性意义。该文统计学方法已经新疆医科大学生物统计学专家审核。

讨论

支架作为组织工程中必不可少的一个因素有利于细胞内基因的表达和信号转导，可促进干细胞的活性与特异性分化的能力[23]。水凝胶基支架材料是一类以水为液体成分的3D聚合物[24]，它们的亲水性使之能够保持高含水量与黏弹性，与细胞外基质极为类似，有利于细胞的增殖和分化[25-26]，因此在组织工程领域被广泛应用。天然高分子水凝胶材料包括胶原、纤维蛋白、壳聚糖、海藻酸钠及明胶等[27]，目前已被应用于皮肤、肝脏、血管、软骨、骨和口腔组织再生的研究。明胶是一种天然高分子水凝胶材料，是细胞黏附成分，具有良好的生物降解性和生物相容性[19，28]。Gel-MA由天然高分子明胶和甲基丙烯酸基团合成[29]，为网络状多孔结构，可促进细胞生长和组织再生，且两者经紫外光引发交联后制备的水凝胶更加稳定[30-31]。TDM作为从人牙齿中提取的材料具有良好的生物相容性，同时具有疏松多孔的结构[32]，为干细胞附着、增殖和分化建立了有利的微环境[33-34]；此还可为咀嚼力提供支持强度，是具有生物力学特性的理想支架材料[35]。为了更好地模拟出细胞外基质结构，此次实验以Gel-MA、TDM为原材料，采用冷冻干燥法制备了Gel-MA与TDM质量比分别为1∶2、1∶1、2∶1的支架，通过对支架表征及生物学性能研究挑选出合适质量比的支架材料，便于后期研究。
支架孔隙形状及面积对细胞生长、黏附、转移以及物质传递的速率都有影响[36]，研究表明合适孔隙率的支架既能促进细胞黏附又可改善营养物质的传输[37]。此次实验通过扫描电镜发现3种质量比的Gel-MA/TDM支架都具有多孔结构，1∶2支架组孔隙率最大，为(41.06±0.76)%。理想的支架材料不仅需要合适的孔隙率，还要有一定的机械性能，可以起到支撑与支持的作用，根据压缩应力-应变实验结果，在应变同为20%时，1∶2支架组所需的压缩强度最大，为0.105 MPa；剪切应力-应变实验结果显示，1∶2、1∶1、2∶1支架组断裂时所需压力分为0.032，0.017，0.012 MPa，提示随着TDM质量的增加，Gel-MA/TDM支架的抗压及抗剪切性能均增加，1∶2质量比支架在强度与孔隙率方面都表现出了优势。
实验将人牙髓干细胞接种于不同质量比的Gel-MA/TDM支架浸提液中，CCK-8检测结果显示，Gel-MA/TDM支架能促进人牙髓干细胞的增殖，1∶2质量比Gel-MA/TDM支架浸提液对细胞的促增殖作用更优。细胞划痕实验结果提示，Gel-MA/TDM支架浸提液可促进人牙髓干细胞的迁移，其中1∶2质量比Gel-MA/TDM支架浸提液的促细胞迁移作用更强。碱性磷酸酶染色结果提示，Gel-MA/TDM支架浸提液可促进人牙髓干细胞的成骨分化，其中1∶2质量比Gel-MA/TDM支架浸提液的促细胞成骨分化作用更强。因此，Gel-MA/TDM支架可促进人牙髓干细胞的增殖和成骨分化，这为后续此支架材料对人牙髓干细胞的多向分化及牙髓-牙本质再生的影响提供了实验基础。
综上所述，1∶2 质量比Gel-MA/TDM支架具有更优的孔隙率、机械强度及生物学性能，可促进牙髓干细胞的增殖及分化，由此说明该支架在基于牙髓干细胞的牙髓-牙本质再生方面可能具有很好的应用价值。但仍需要进一步的实验来探究Gel-MA/TDM支架的免疫原性，其促进人牙髓干细胞成骨分化的具体机制也有待进一步研究。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

甲基丙烯酸酐改性明胶/经处理牙本质基质生物活性支架的制备及性能

Preparation and performance of gelatin modified by methacrylic anhydride/treated dentin matrix bioactive scaffolds

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 10

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	杨玉芳, 杨芷姗, 段棉棉, 刘毅恒, 唐正龙, 王宇. 促红细胞生成素在骨组织工程中的应用及前景[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(9): 1443-1449.
[2]	陈凯佳, 刘景云, 曹宁, 孙建波, 周燕, 梅建国, 任强. 组织工程技术在股骨头坏死治疗中的应用及前景[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(9): 1450-1456.
[3]	梅静怡, 刘江, 肖聪, 刘鹏, 周浩浩, 林展翼. 组织工程血管构建过程中平滑肌细胞增殖变化及代谢模式[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(7): 1043-1049.
[4]	王姗姗, 舒晴, 田峻. 物理因子促进干细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(7): 1083-1090.
[5]	王武, 樊晓磊, 谢杰, 胡懿郃, 曾敏. 羟基磷灰石-聚乙烯醇/胶原-壳聚糖-明胶复合水凝胶修复兔骨软骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(5): 682-689.
[6]	张娅, 牟秋菊, 王自林, 刘宏杰, 祝丽丽. 负载富血小板血浆的水凝胶促进糖尿病大鼠创面愈合[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(5): 690-696.
[7]	沈子青, 夏天, 单一波, 朱睿君, 万昊鑫, 丁浩, 潘枢, 赵军. 负载外泌体水凝胶修饰3D打印支架构建血管化的气道替代物[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(5): 697-705.
[8]	朱礼威, 王江玥, 白丁. 纳米复合甲基丙烯酰明胶水凝胶在不同骨缺损环境中应用的价值[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(5): 753-758.
[9]	陈小芳, 郑国爽, 李茂源, 于炜婷. 可注射海藻酸钠水凝胶的制备及应用[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(5): 789-794.
[10]	王嘉旎, 陈俊宇. 金属离子促血管生成机制及在骨组织工程中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(5): 804-812.
[11]	杨雨晴, 陈志宇. 早期短暂M1巨噬细胞在骨组织工程中的作用及应用[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 594-601.
[12]	戴京, 刘沙沙, 沈明敬. 负载外泌体的可注射水凝胶修复种植体周围骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(3): 347-354.
[13]	谷明西, 王常成, 田丰德, 安宁, 郝瑞胡, 郭林. 丝素蛋白/明胶/壳聚糖三维多孔软骨组织支架的制备及体外评价[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(3): 366-372.
[14]	曹胜, 孔令伟, 徐昆, 孙志杰. 负载丹酚酸B甲基丙烯酰化明胶水凝胶对椎间盘退变的作用[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(3): 380-386.
[15]	王新民, 闫文凯, 宋亚辉, 刘飞. 自体富白细胞-血小板纤维蛋白凝胶与腘绳肌腱修复创伤性髌骨脱位[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(3): 404-410.