病证结合骨质疏松模型大鼠骨骼的生物力学性能分析

doi:10.12307/2024.420

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (23): 3636-3641.doi: 10.12307/2024.420

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病证结合骨质疏松模型大鼠骨骼的生物力学性能分析

林楚彬1，何兴鹏2，丘育辉1，吴文瑾1，常雨1，叶涛3，李鹏飞4，5，杨建1

1五邑大学智能制造学部，广东省江门市 529020；2广州中医药大学，广东省广州市 510006；3南方科技大学电子与电气工程系，广东省深圳市 518055；4暨南大学附属江门市中医院，广东省江门市 529000；5江门市中心医院，广东省江门市 529020

收稿日期:2023-05-04 接受日期:2023-07-20 出版日期:2024-08-18 发布日期:2023-09-13
通讯作者: 李鹏飞，副研究员，暨南大学附属江门市中医院，广东省江门市 529000；江门市中心医院，广东省江门市 529020 杨建，副教授，硕士生导师，五邑大学智能制造学部，广东省江门市 529020
作者简介:林楚彬，男，1997年生，广东省汕尾市人，汉族，2022年五邑大学毕业，硕士，主要从事新型机械与机电设备设计与开发研究。何兴鹏，男，1994年生，河南省平顶山市人，汉族，医师，主要从事中医骨伤科研究。
基金资助:
广东省重点领域研发计划项目(2020B101030002)，项目负责人：叶涛；五邑大学粤港澳联合研发基金(2019WGALH19)，项目负责人：杨建；国家自然科学基金(81904220)，项目负责人：李鹏飞

Biomechanical analysis of the bones in a rat model of osteoporosis based on the combination of disease and syndrome

Lin Chubin1, He Xingpeng2, Qiu Yuhui1, Wu Wenjin1, Chang Yu1, Ye Tao3, Li Pengfei4, 5, Yang Jian1

1Faculty of Intelligent Manufacturing, Wuyi University, Jiangmen 529020, China; 2Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China; 3Department of Electrical and Electronics Engineering, Southern University of Science and Technology, Shenzhen 518055, China; 4Affiliated Jiangmen Hospital of Traditional Chinese Medicine, Jinan University, Jiangmen 529000, China; 5Jiangmen Central Hospital, Jiangmen 529020, China

Received:2023-05-04 Accepted:2023-07-20 Online:2024-08-18 Published:2023-09-13
Contact: Li Pengfei, Associate researcher, Affiliated Jiangmen Hospital of Traditional Chinese Medicine, Jinan University, Jiangmen 529000, Guangdong Province, China; Jiangmen Central Hospital, Jiangmen 529020, Guangdong Province, China Yang Jian, Associate professor, Master’s supervisor, Faculty of Intelligent Manufacturing, Wuyi University, Jiangmen 529020, Guangdong Province, China
About author:Lin Chubin, Master, Faculty of Intelligent Manufacturing, Wuyi University, Jiangmen 529020, Guangdong Province, China He Xingpeng, Physician, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China
Supported by:
Key-Area Research and Development Program of Guangdong Province, No. 2020B101030002 (to YT); Wuyi University & Hong Kong & Macao Joint Research Funds, No. 2019WGALH19 (to YJ); National Natural Science Foundation of China, No. 81904220 (to LPF)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

病证结合：是指利用西医辨病与中医辨证的论治相结合的理论，从不同医学体系与角度对疾病进行认识，将西医的病与中医的症相结合，开展中医药界和中西医结合界最为普遍应用的临床诊疗模式。
生物力学性能分析：通过生物学与力学原理方法有机结合，应用力学原理和方法对生物体中的力学问题进行定量研究，探究生物体在生命过程中的规律，是解决生命与健康领域问题的重要手段。

背景：肾虚是骨质疏松症的最主要病机，对肾阳虚、肾阴虚与骨质疏松的关系研究有利于病证结合临床诊疗模式的发展。

目的：评价右归丸对肾阳虚、肾阴虚大鼠股骨生物力学性能的影响差异，从生物力学角度论证骨质疏松症病证结合、因证施药的科学性。
方法：手术摘除60只雌性SD大鼠双侧卵巢建立骨质疏松模型，10周后将大鼠随机分为肾阴虚组(n=30)和肾阳虚组(n=30)，肾阳虚组臀部肌肉注射氢化可的松注射液，肾阴虚组灌胃甲状腺片混悬药液，1次/d，连续14 d。造模结束后，每组取20只灌胃右归丸混悬液，1次/d，连续12周，剩余10只作为对照不灌胃。灌胃结束后使用Micro-CT扫描测量股骨微结构参数，在力学试验机上对股骨分别进行三点弯曲、有限元仿真、股骨头压缩及表面压痕分布实验。

结果与结论：①Micro-CT扫描显示，与肾阴虚组比较，肾阴虚+右归丸组股骨骨密度、骨体积分数、骨表面密度、骨小梁数量、骨小梁分离度升高(P < 0.05)；与肾阳虚组比较，肾阳虚+右归丸组股骨骨体积分数、骨表面密度、骨小梁数量及骨小梁厚度升高(P < 0.05)；②三点弯曲实验显示，与肾阳虚组相比，肾阳虚+右归丸组股骨弹性模量、最大抗弯强度和弯曲断裂强度均降低(P < 0.05)，韧性提高(P < 0.05)；③有限元仿真显示，右归丸能显著提高肾阳虚组大鼠股骨抗骨折能力，对肾阴虚组大鼠不产生明显作用；股骨头压缩实验显示，右归丸可增强肾阳虚组大鼠股骨头抵抗形变的能力，但右归丸对肾阴虚组和肾阳虚组大鼠股骨头表面性能的影响无显著区别；④结果表明，右归丸可增强肾阳虚骨质疏松骨骼生物力学性能，但对肾阴虚骨质疏松骨骼无显著影响。

https://orcid.org/0000-0002-7346-5891(林楚彬)；https://orcid.org/0000-0001-1363-9962(何兴鹏)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 病证结合, 骨质疏松症, 右归丸, 肾阳虚, 肾阴虚, 生物力学

Abstract: BACKGROUND: Kidney deficiency is the main pathogenesis of osteoporosis. To study the relationship between the two major syndrome types of kidney deficiency, Kidney-Yang deficiency and Kidney-Yin deficiency, is beneficial for the development of clinical diagnosis and treatments based on the combination of disease and syndrome.
OBJECTIVE: To evaluate the biomechanical differences of the rat femurs with Kidney-Yang deficiency and Kidney-Yin deficiency caused by Yougui pills, and to demonstrate the scientific efficacy of medication based on the combination of disease and syndrome in osteoporosis from a biomechanical perspective.
METHODS: The bilateral ovaries of 60 female Sprague-Dawley rats were surgically removed to establish an ovariectomized osteoporosis model. At 10 weeks after modeling, all the rats were randomly divided into a Kidney-Yang deficiency group (n=30) and a Kidney-Yin deficiency group (n=30). Rats with Kidney-Yang deficiency were given gluteal intramuscular injection of hydrocortisone, while rats with Kidney-Yin deficiency were orally administered with thyroid tablet suspension, once a day, for 14 consecutive days. After successful modeling, 20 rats in each group were given a suspension of Yougui pills by gavage once a day for 12 consecutive weeks and the remaining 10 rats were used as the control group without intervention. After gavage, the microstructural parameters of the bone were measured using Micro-CT scanning. Three-point bending, finite element simulation, femoral head compression, and surface indentation distribution experiments of the femurs were performed on a mechanical testing machine.
RESULTS AND CONCLUSION: Micro-CT revealed that the femoral bone density, bone volume fraction, bone surface density, trabecular number, and trabecular separation were improved in the Kidney-Yin deficiency+Yougui pills group compared with the Kidney-Yin deficiency group (P < 0.05); the femoral bone volume fraction, bone surface density, trabecular number, and trabecular thickness were improved in the Kidney-Yang deficiency+Yougui pills group compared with the Kidney-Yang deficiency group (P < 0.05). The three-point bending experiment showed that the femur elastic modulus, maximum bending strength and bending fracture strength were decreased (P < 0.05) and toughness was increased (P < 0.05) in the Kidney-Yang deficiency+Yougui pills group compared with the Kidney-Yang deficiency group. Finite element simulation showed that Yougui pills could significantly improve the bending resistance of the femurs in the Kidney-Yang deficiency group, but had no significant effect on the Kidney-Yin deficiency group. The femoral head compression experiments showed that Yougui pills could enhance the ability of the femoral head to resist deformation in the Kidney-Yang deficiency group, but there was no significant difference in the effect of Yougui pills on the surface properties of the femoral head in the Kidney-Yin deficiency group and the Kidney-Yang deficiency group. To conclude, Yougui pills can significantly enhance the biomechanical properties of the osteoporotic bones with Kidney-Yang deficiency, but have no significant effect on the osteoporotic bone with Kidney-Yin deficiency.

Key words: the combination of disease and syndrome, osteoporosis, Yougui pills, Kidney-Yang deficiency, Kidney-Yin deficiency, biomechanics

中图分类号:

林楚彬, 何兴鹏, 丘育辉, 吴文瑾, 常雨, 叶涛, 李鹏飞, 杨建. 病证结合骨质疏松模型大鼠骨骼的生物力学性能分析[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(23): 3636-3641.

Lin Chubin, He Xingpeng, Qiu Yuhui, Wu Wenjin, Chang Yu, Ye Tao, Li Pengfei, Yang Jian. Biomechanical analysis of the bones in a rat model of osteoporosis based on the combination of disease and syndrome[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(23): 3636-3641.

图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量分析 60只大鼠全部进入结果分析。
2.2 各组大鼠股骨微细结构参数的比较图1展示了4组大鼠的股骨Micro-CT扫描图像和股骨微细结构参数。与肾阴虚组相比，肾阴虚+右归丸组大鼠股骨骨密度、骨体积分数、骨表面密度、骨小梁数量与骨小梁分离度升高(P < 0.01)。与肾阳虚组相比，肾阳虚+右归丸组大鼠股骨骨体积分数、骨表面密度、骨小梁数量及骨小梁厚度升高(P < 0.05，P < 0.001，P < 0.000 1)。与肾阳虚组相比，右归丸对肾阴虚组大鼠股骨骨密度的影响更为显著，肾阴虚+右归丸组的平均骨密度从0.188 g/cm3增加到0.204 g/cm3，与肾阳虚组(0.202 g/cm3)和肾阳虚+右归丸组(0.206 g/cm3)的骨密度几乎相同。这些参数表明在肾阴虚组和肾阳虚组中，右归丸对股骨的骨微观结构具有不同影响。

2.3 各组大鼠股骨干生物力学性能使用三点弯曲法测量大鼠股骨干的生物力学性能(图2A)。将三维模型文件导入ABAQUS进行有限元模拟，对股骨干的中间部分进行进一步的网格划分，以获得更准确的结果。当弯曲挠度为0.4 mm时，股骨干的应力主要集中在支撑端和中间区域(图2B)。通过测试所得的载荷-挠度数据，经过换算可得到应力-应变曲线(图2C)。通过该曲线读取及计算得到股骨的弹性模量、最大应变、弯曲断裂强度、最大弯曲强度、刚度、弯曲韧性等力学性能参数，并使用t检验统计学方法对力学性能参数进行统计学分析：与肾阳虚组相比，肾阳虚+右归丸组大鼠股骨的弹性模量、最大抗弯强度和弯曲断裂强度均降低(P < 0.05)，韧性提高(P < 0.05)；与肾阴虚组比较，肾阴虚+右归丸组大鼠股骨的力学参数无显著变化(P > 0.05)(图2D)。

2.4 各组大鼠股骨干断裂裂纹扩展情况为观测弯曲断裂时裂纹发生的位置和扩展情况，通过300帧每秒的速度拍摄采集股骨干三点弯曲时的断裂图像(图3A)可知，股骨在达到最大弯曲挠度时，股骨干中部下端拉伸应变首先到达到极限值并开始产生裂纹，并迅速扩展使得股骨瞬间断裂。使用ABAQUS进行显式分析，获得股骨断裂应力云图(图3B)，其模拟断裂位置与实际测试拍摄的断裂图像股骨裂纹发生位置一致，4组有限元分析模型断裂位置均发生在中部，应力主要集中于中部及断裂处的延展位置。导出断裂处附近结点的应力应变数据(图3C)进行比较，右归丸对肾阴虚组大鼠股骨的弯曲应力应变曲线几乎没有影响；与肾阳虚组相比，肾阳虚+右归丸组大鼠股骨最大断裂应力明显减弱，且断裂应变从0.023 0%增长到0.024 2%，有限元分析拟合结果表明右归丸增强了肾阳虚大鼠股骨的抗骨折能力。

2.5 各组股骨头压缩破坏测试结果以0.1 mm/s的加载速度对股骨头进行压缩破坏测试，采集其载荷和位移数据绘制载荷-位移曲线(图4A)，在曲线上读取及计算得到股骨头的压缩弹性载荷、最大压缩形变、能量吸收、最大压缩载荷等力学参数(图4B)，使用t检验进行统计学分析，右归丸对肾阴虚大鼠股骨头力学参数的影响均未表现出明显差异(P > 0.05)；与肾阳虚组相比，肾阳虚+右归丸组大鼠股骨头压缩弹性载荷、最大压缩载荷均不同程度增加，最大压缩形变率、能量吸收较小，但差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.6 各组大鼠股骨头表面压痕分布使用尖端直径为0.3 mm的探针进行股骨头表面应力测试(图5A)，经过测量统计，大鼠股骨头直径约为4 mm。确定以9×9共81个点，点距为0.3 mm方形阵列测试股骨头的表面应力(图5B)，将每个点的载荷峰值进行换算得到应力云图(图5C)。每组股骨头共测试了3个样品，并对该应力云图中100 MPa以下应力值进行一个区域划分(图5D)，由图中可以看出，肾阳虚组和肾阴虚组在右归丸灌胃后其表面100 MPa以下区域均有明显的增加，但增长差异不明显。

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引言

中国骨质疏松症的平均患病率约为15.7%，呈现地区、性别和骨骼部位等多方面差异，老龄化社会使得骨质疏松症成为中国医疗健康事业的严峻挑战[1-2]。中医药是治疗骨质疏松症的重要手段[3-5]，大量研究发现中药具有抗骨质疏松作用，可显著增加腰椎骨密度，长期使用中药(> 12个月)治疗可更有效增加髋关节骨密度[6]。右归丸是《景岳全书》中首次记载的中医经典方剂，因其疗效确切在中国临床上被广泛应用于肾阳虚证的调理已有400多年[7]。右归丸能改善骨密度、缓解疼痛、缓解肾虚证、改善骨质疏松症患者的生活质量、抑制骨转化、调节骨形成与骨吸收的耦合平衡[8]，具有治疗骨质疏松症的潜力[9]。需要了解右归丸是否只对骨质疏松肾阳虚证有效，以及右归丸治疗肾阴虚症的差异和机制。
生物力学的测试方法有很多，如压缩[10-11]、拉伸[12]、扭转[13]、四点弯曲和三点弯曲测试等[14-20]，其中最为常用压缩和三点弯曲测试。压缩测试常用于对股骨头、骨小梁等骨强度的表征，而骨骼三点弯曲测试方法有2种[21]：一种是在没有任何预裂纹或缺口的情况下进行测试，另一种是通过在皮质上创建一个微小缺口并对骨骼进行三点弯曲实验，前者试样制备简单，常用于评定试样的强度、弹性模量等，其韧性基本上等量于断裂强度的能量；后者需在每个实验上复制同样缺陷以提供一致性，常用于评估试样断裂韧性，表征骨骼的抗断裂能力。在既往研究中，三点弯曲测试多用于测试股骨[15-18]、肱骨[16]、胫骨[17]、尺骨等骨骼的力学性能[20]，因为这类管状骨具有较大的长宽比，有利于减小弯曲实验时的剪切变形，使所得的弹性模量更为准确。
因此，此次研究以大鼠作为动物模型，切除其双侧卵巢以建立骨质疏松动物模型[22]，以t检验为主要统计学方法，采用三点弯曲实验、股骨干有限元分析、股骨头压缩实验和股骨头表面压痕实验共四类生物力学分析手段[23]，旨在分析右归丸对骨质疏松症模型大鼠股骨力学性能的影响，此外还与骨微细结构参数结合分析，从生物力学角度论证骨质疏松症的病证结合、因证施药的科学性。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计通过评价右归丸对肾阳虚、肾阴虚大鼠股骨生物力学性能的差异，从生物力学角度论证骨质疏松症病证结合、因证施药的科学性。组间比较进行t检验(双尾，不等方差)。
1.2 时间及地点实验于2020年12月至2022年6月在广州中医药大学实验动物中心、岭南医学研究中心及五邑大学智能制造学部进行。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 SPF级雌性SD大鼠60只，4月龄，体质量250-300 g，由广东省医学实验动物中心提供，实验动物质量合格证编号：SCXK(粤)2018-0034，饲养于广州中医药大学三元里校区SPF 级动物实验室，自由摄水饮食。实验获得广州中医药大学动物实验伦理委员会批准，批准申请号：20191129002。

1.3.2 实验药物氢化可的松注射液(20 mL∶100 mg)，天津金耀氨基酸有限公司生产，批号：H12020887；甲状腺片(40 mg×100片)，山东省惠诺药业有限公司生产，批号：H37020075；右归丸(每10粒1.8 g)，河南万喜制药有限公司生产，批号：Z41022170。右归丸由10种中药组成，见表1。

1.3.3 实验仪器 Micro-CT机(Skyscan1172，Bruker公司，比利时)，馥勒电子动静疲劳试验系统(FL-30kN，馥勒仪器科技有限公司，上海)，ABAQUS(Dassault公司，美国)。
1.4 方法
1.4.1 肾阴虚和肾阳虚大鼠模型的建立摘除60只大鼠双侧卵巢建立骨质疏松症模型[24]。去势大鼠的骨骼生理特征与早期绝经后妇女骨骼生理特征相似，已成为成熟可靠、使用最广泛的动物模型[25]，采用手术摘除大鼠双侧卵巢的方法，术后10周成功建立去势骨质疏松动物模型。
10周后，采用随机数字表法将60只大鼠分为肾阳虚组和肾阴虚组，每组30只。肾阳虚组大鼠臀肌注射氢化可的松(20 mg/kg)，肾阴虚组大鼠灌胃甲状腺激素片(150 mg/kg)，1次/d，连续14 d。造模成功后，肾阳虚组大鼠出现精神倦怠、活动减少、体质量显著下降、蜷曲拱背、喜扎堆、皮毛无光泽、饮食减少、尿量增多、大便稀溏等症状；肾阴虚大鼠出现烦躁多动、易激惹不易抓取、毛发枯槁易脱落、大便干结、饮水及饮食量增多等症状，提示造模成功[26]。每组处死10只大鼠进行模型实验，标记为肾阳虚组和肾阴虚组；右归丸打磨成粉后用纯水配置成悬浮液(0.241 g/mL)，对每组另20只大鼠进行灌胃(10 mL/kg)，1次/d，连续12周，标记为肾阳虚+右归丸组和肾阴虚+右归丸组。灌胃结束后禁食1 d，腹腔注射3%戊巴比妥钠(45 mg/kg)全麻后处死大鼠，迅速去除股骨周围的软组织，分离双侧股骨，左侧股骨置于40 g/L多聚甲醛固定液保存，右侧股骨置于-20 ℃保存。
1.4.2 Micro-CT扫描采用Skyscan1172 Micro-CT机对上述左侧股骨进行Micro-CT扫描，层距为15 μm，图像像素大小为14.91 μm，能量/强度为80 kVp，100 μA，扫描范围设置为股骨中上部和中下部，获得大鼠股骨远端感兴趣区域骨小梁三维模型stl文件。接着导入Geomagic studio 2013(Geomagic公司，美国)优化处理。调整分析区域股骨方向为股骨颈与水平方向垂直，选取生长板远端100 层、厚度为100 层的松质骨为感兴趣区域进行三维重建，设定灰度阈值127，获得大鼠股骨感兴趣区域骨微细结构参数：骨密度、骨体积分数、骨表面密度、骨小梁数量、骨小梁厚度和骨小梁分离度。
1.4.3 生物力学测试
股骨三点弯曲实验：测试前右侧股骨常温解冻，生理盐水复湿。量取股骨干正中的长、短外径，分别测量3次，取平均值，将股骨置于馥勒FL-30kN材料试验机上进行三点弯曲实验，采用DBSL-3t传感器采集其力学数据，设置加载速度为0.01 mm/s、跨距为15 mm。断裂后，测量断裂处股骨内部的长、短半径测量3次，取平均值；由载荷-桡度换算并绘制应力-应变曲线，从曲线上读取及计算最大弯曲强度、弯曲断裂强度、最大应变、弹性模量、刚度及韧性等骨材料学评价指标。同时采用高精度视频引伸计以3 ms每帧的图像采集速度记录股骨干的断裂情况。
股骨头压缩实验：将断裂后的股骨头切下并用砂纸将断面磨平，用游标卡尺测量股骨头下缘到软骨面最远处记为股骨头的高度，并测量股骨头直径。将润湿的股骨头标本置于材料试验机上，加载速度为0.01 mm/min，记录实验数据，绘制载荷-变形曲线，并从曲线上读取及计算弹性载荷、最大载荷、最大变形、压缩能量等参数。
股骨头表面压痕分布实验：将断裂后带有股骨头的一端用专用夹具固定在实验室搭建的微力学测试装置上，调整股骨角度使得股骨头正面朝上。使用尖端直径为0.3 mm的探针进行股骨表面应力测试，加载速度为0.01 mm/s，设定0.05 N为探测表面初始力值，之后向下探测0.1 mm，使用NI9205采集卡采集载荷大小。共测试股骨表面9×9共81个点的表面应力，通过Origin处理获取每个点位的载荷峰值，换算为应力云图。

1.4.4 股骨干三点弯曲有限元分析使用ABAQUS 2016 (SIMULIA公司，美国)对股骨模型进行简化，只留下中部股骨干部分，并建立股骨三点弯曲夹具模型，其三点弯曲的跨距为15 mm。采用ABAQUS中的显式分析以研究股骨干骨折情况，使用六面体对模型进行网格划分。设定股骨干模型的网格近似全局尺寸为0.1，最大偏离因子为0.1，占全局尺寸比例为0.1。设定夹具模型网格全局尺寸为0.5，最大偏离因子为0.1，占全局尺寸比例为0.1。材料属性则设定股骨泊松比为0.3，并对同一个模型分别输入肾阴虚组、肾阴虚+右归丸组、肾阳虚组、肾阳虚+右归丸组股骨对应的骨密度、最大应力、弹性模量等参数的平均值，并设定弯曲挠度为0.6 mm。为能分析断裂过程，材料属性中还增加了脆性裂纹这一参数，其中直接开裂破坏值为最大应变值与断裂时应变值之差。具体设定参数如表2所示。

1.5 主要观察指标各组大鼠股骨Micro-CT扫描、三点弯曲、股骨头压缩及表面压痕分布实验结果。
1.6 统计学分析使用Microsoft Excel软件和Origin 2019b (OriginLab公司，美国)进行统计分析。对来自独立实验的数据进行量化，并对每个变量进行分析。采用t检验(双尾，不等方差)对右归丸治疗前和治疗后两组之间进行比较。P < 0.05被认为差异有显著性意义。该文统计学方法已经暨南大学生物统计学专家审核。

讨论

骨质疏松症的特点是骨量减少、骨微结构退化，导致骨脆性及骨折风险增加[27-28]。治疗骨质疏松症的首要目标是预防骨折[29]。目前西医对骨质疏松症的治疗主要采用维生素D[30]、钙[31]、地诺单抗[32-33]、双膦酸盐等方法来增加骨密度[34-35]，但长期使用可能会引起严重不良反应[36]。骨质疏松患者还存在中医证候，如疼痛、四肢躯干萎缩无力、关节不灵活、脊柱变形、骨折等，因此中医治疗骨质疏松症不仅以增加骨密度为目的，而且还以缓解骨质疏松症患者的中医证候为目标，即将中医证候与西医危险因素相结合，中医将其称为“病证结合”[37]。根据中医“肾主骨”的理论，中医药治疗骨质疏松症多从补肾入手，将骨质疏松分为肾阳虚和肾阴虚两大主要类型。右归丸是经典的补肾名方，研究发现右归丸能有效改善骨丢失、防治骨质疏松[8]，但并未有相关研究表明右归丸对肾阳虚和肾阴虚骨质疏松患者有着不同的治疗效果。因此，此次研究采用摘除大鼠双侧卵巢的方法建立骨质疏松症模型[24]，并在此基础上将大鼠分成肾阳虚、肾阴虚、肾阳虚+右归丸和肾阴虚+右归丸4组，处死大鼠后分离两侧股骨，旨在研究右归丸对肾阳虚和肾阴虚症状大鼠股骨骨微结构参数和力学性能参数的影响，以评价中医“病证结合”这一理论的可靠性。
首先，研究对股骨进行了Micro-CT扫描，评价4组大鼠左腿股骨的骨微结构参数。虽在此前有研究显示右归丸可提高骨质疏松模型骨密度[38]，但并未建立阴虚模型和阳虚模型去研究右归丸对骨微参数的影响。此次研究通过对比4组大鼠股骨的骨微参数发现，经过右归丸治疗后大鼠股骨骨微结构参数均有不同程度的增长，除了骨小梁分离度外，骨密度、骨小梁数量、骨小梁厚度等参数的增长均有利于预防骨质疏松症状。其中，使用右归丸治疗后，肾阳虚组骨体积分数、骨小梁厚度的增长程度均明显高于肾阴虚组。有趣的是，骨密度则是肾阴虚组增长更加明显，且其平均值增长到了0.204 g/cm3，与肾阳虚组(0.202 g/cm3)和肾阳虚+右归丸组(0.206 g/cm3)几乎持平，作者认为这可能是骨密度有阈值，且肾阳虚大鼠股骨骨密度并没有减少，使得右归丸对肾阴虚组的影响明显高于肾阳虚组。这些参数说明，右归丸对肾阴虚和肾阳虚大鼠股骨骨微结构的影响具有明显区别。
接着，研究采用无预置裂纹的三点弯曲实验评估右归丸对肾虚大鼠股骨力学性能的影响，测试所得的骨的韧性、强度、刚度和弹性模量都与骨的脆性相关。实验结果表明：右归丸对肾阴虚和肾阳虚大鼠股骨力学参数的影响有着明显区别，右归丸对肾阴虚股骨力学性能的影响不明显，但能显著增加肾阳虚大鼠股骨干的弯曲韧性，降低其弹性模量。弹性模量是评价股骨产生弹性变形难易程度的指标，其值越大，使发生股骨产生变形的应力也就越大，使得股骨不易变形，脆性越强。这也使得图2D中阳虚大鼠股骨的弹性模量经过右归丸干预后减小，其最大弯曲应力和弯曲断裂强度随之减小。但是，这只能说明右归丸改善了股骨的脆性，并不能完全反映股骨的抗骨折能力增强。骨骼的韧性是抵抗骨质疏松和年龄相关性骨折的关键机制[21]，其韧性越好，那么发生脆性断裂的可能性就越小。肾阳虚大鼠股骨在经过右归丸干预后弯曲韧性显著增强，这说明股骨的抗骨折能力增强。另外，此次研究还将4组大鼠股骨干的弯曲力学参数进行有限元拟合分析，发现右归丸对肾阳虚大鼠股骨断裂曲线影响更加明显，在同样的断裂条件下其断裂应变从0.023 0%增长到0.024 2%。这些数据说明右归丸能够提高肾阳虚大鼠股骨抗骨折能力，且比对肾阴虚大鼠股骨的影响更加显著。
此外，右归丸对肾阴虚和肾阳虚股骨头的抗压缩性能影响也有明显的区别：右归丸对肾阴虚股骨头影响依旧不明显，但右归丸提高阳虚股骨头的弹性模量和压缩载荷、减小了形变率、增强了股骨头抵抗形变的能力。上述数据均表明右归丸对肾阳虚骨质疏松具有治疗作用，但对肾阴虚的治疗效果不明显。此外还引入了股骨头表面力学性能测试，即对股骨头表面进行点阵压痕测试，右归丸对肾阳虚和肾阴虚大鼠股骨头100 MPa以下区域的应力均有增长，右归丸对肾阴虚和肾阳虚股骨头表面性能的影响并没有显著区别。考虑到生物力学测量的局限性，表面压痕测试方法可以在未来用于检测股骨头坏死。
综上所述，研究采用三点弯曲实验、股骨干有限元分析、股骨头压缩实验和股骨头表面压痕实验对4组肾虚大鼠股骨进行了研究，结果表明与肾阴虚大鼠股骨相比，右归丸能显著增强肾阳虚大鼠股骨的骨微观结构，并提高其抗骨折和抗变形能力。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

病证结合骨质疏松模型大鼠骨骼的生物力学性能分析

Biomechanical analysis of the bones in a rat model of osteoporosis based on the combination of disease and syndrome

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