彝药斯赤列甲醇提取物对骨关节炎模型大鼠的治疗作用及靶点预测

doi:10.12307/2023.968

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (23): 3627-3635.doi: 10.12307/2023.968

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彝药斯赤列甲醇提取物对骨关节炎模型大鼠的治疗作用及靶点预测

郑俭彬1，陆玉春1，江自鲜1，李秀芳1，王涛2，王文静1

1云南中医药大学，云南省昆明市 650500；2昆明市中医医院骨伤科，云南省昆明市 650051

收稿日期:2022-11-29 接受日期:2023-01-16 出版日期:2024-08-18 发布日期:2023-09-13
通讯作者: 王文静，博士，教授，硕士生导师，云南中医药大学，云南省昆明市 650500 王涛，硕士，副主任医师，昆明市中医医院骨伤科，云南省昆明市 650051
作者简介:郑俭彬，男，海南省海口市人，云南中医药大学在读硕士，主要从事中药药理与应用研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(82160744)，项目负责人：王文静

Yi medicine Sambucus adnata Wall methanol extract in a rat osteoarthritis model: therapeutic effect and target prediction

Zheng Jianbin1, Lu Yuchun1, Jiang Zixian1, Li Xiufang1, Wang Tao2, Wang Wenjing1

1Yunnan University of Chinese Medicine, Kunming 650500, Yunnan Province, China; 2Department of Orthopedics, Kunming Municipal Hospital of Traditional Chinese Medicine, Kunming 650051, Yunnan Province, China

Received:2022-11-29 Accepted:2023-01-16 Online:2024-08-18 Published:2023-09-13
Contact: Wang Wenjing, MD, Professor, Master’s supervisor, Yunnan University of Chinese Medicine, Kunming 650500, Yunnan Province, China Wang Tao, Master, Associate chief physician, Department of Orthopedics, Kunming Municipal Hospital of Traditional Chinese Medicine, Kunming 650051, Yunnan Province, China
About author:Zheng Jianbin, Master candidate, Yunnan University of Chinese Medicine, Kunming 650500, Yunnan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 82160744 (to WWJ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

斯赤列：彝药“斯赤列”，植物学名血满草(Sambucus adnata Wall.)，为忍冬科(Caprifoliaceae)接骨木属(Sambucus Linn.)植物，又名接骨药、接骨丹、血管草、血蛮草等，地上部分或全草入药，该植物在云南分布广泛，彝医长期将其用于治疗骨折、跌打劳伤、关节炎、风湿疼痛等，疗效确切。

骨关节炎：是临床常见病，多发于膝关节、踝关节等承重关节，其中膝骨关节炎是骨关节炎中最常见的类型，病理学改变多见关节软骨退化、滑膜炎、软骨下骨硬化等，临床表现为关节腔炎症、关节肿胀、疼痛、僵硬等，甚至发生瘫痪，是导致老年人残疾的主要原因之一。

背景：彝族人民将斯赤列用于治疗骨折、跌打劳伤、关节炎等。作者所在课题组前期研究发现斯赤列活性部位水提取物(SAW-A)和二氯甲烷提取物(SAW-B)可通过促进成骨细胞增殖、分化和成熟相关基因的表达发挥促进骨折愈合作用，但其活性部位甲醇提取物(SAW-C)对骨关节炎的治疗作用尚不清楚。
目的：探讨斯赤列甲醇提取物对骨关节炎的治疗作用，并通过网络药理学技术筛选斯赤列甲醇提取物治疗骨关节炎的有效靶点。
方法：通过大鼠前交叉韧带切断手术复制大鼠骨关节炎模型，术后连续灌胃斯赤列甲醇总提物21 d，于造模第21天进行X射线影像学观察，测量膝关节宽度，检测血清中氧化应激指标和关节腔灌洗液中炎症因子水平，苏木精-伊红染色病理学观察，测量全层软骨厚度和透明软骨厚度，番红-固绿染色观察关节软骨蛋白聚糖含量。构建“药物-成分-疾病-靶点”网络，对有效靶点进行GO富集分析和KEGG富集分析，运用cytoscape软件构建蛋白互作网络图。

结果与结论：①斯赤列甲醇提取物可降低骨关节炎大鼠关节腔灌洗液中肿瘤坏死因子α与血清中前列腺素E2、丙二醛水平，提高超氧化物歧化酶水平；缓解由骨关节炎所致的关节肿胀；改善关节软骨组织病理状态，维持关节全层软骨、透明软骨厚度以及软骨下骨中骨小梁面积；防止关节软骨中蛋白聚糖的流失，对软骨有保护作用；②网络药理学结果表明，斯赤列甲醇提取物的作用靶点可能与抑制TNF、AKT1、IL-6、MAPK3、SRC等因子释放，以及抑制EGFR信号通路和AGE-RAGE信号通路的过度激活有关。

https://orcid.org/0000-0002-2958-9029(郑俭彬)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 斯赤列, 甲醇提取物, 骨关节炎, 关节软骨, 软骨细胞, 炎症, 氧化应激, 网络药理学

Abstract: BACKGROUND: The Yi people have used Sambucus adnata Wall to treat fractures, bruises, arthritis, etc. The author’s group found that the active site aqueous extract (SAW-A) and dichloromethane extract (SAW-B) can promote fracture healing by promoting the expression of genes related to osteoblast proliferation, differentiation and maturation, differentiation and maturation. However, the therapeutic effect of methanol extract (SAW-C) at its active site on osteoarthritis is unclear.
OBJECTIVE: To investigate the therapeutic effect of Sambucus adnata Wall extract on osteoarthritis, and to identify the effective targets of Sambucus adnata Wall extract in the treatment of osteoarthritis by network pharmacology technology.
METHODS: A rat osteoarthritis model was replicated by anterior cruciate ligamentectomy and model rats were then treated with methanol extract of Sambucus adnata Wall by gavage for 21 days. On the 21st day after modeling, the knee joint of rats was detected by X-ray, the width of the knee joint was measured, oxidative stress indexes and inflammatory factors levels in serum and joint lavage fluid were detected, the morphology of the knee joint was observed by hematoxylin-eosin staining, full-thickness cartilage and hyaline cartilage thickness were measured, and the content of articular cartilage proteoglycan was observed by safranin O-fast green staining. The "drug-component-disease-target" network was constructed. Gene ontology enrichment analysis and Kyoto encyclopedia of genes and genomes enrichment analysis of effective targets were performed, and protein-protein interaction network maps were constructed using cytoscape software.
RESULTS AND CONCLUSION: Sambucus adnata Wall extract could reduce tumor necrosis factor-α level in joint lavage fluid and serum levels of prostaglandin E2 and malondialdehyde, while increase the level of superoxide dismutase; relieve joint swelling caused by osteoarthritis; improve the histopathological state of articular cartilage, maintain the thickness of full-thickness articular cartilage, hyaline cartilage and the area of bone trabeculae in subchondral bone; and effectively prevent the loss of proteoglycans in articular cartilage and have a chondroprotective effect. Network pharmacological results showed that the methanol extract of Sambucus adnata Wall may have some targets related to inhibition of tumor necrosis factor, AKT1, interleukin-6, MAPK3, and SRC as well as inhibition of over-activation of EGFR signaling pathway and AGE-RAGE signaling pathway.

Key words: Sambucus adnata Wall, methanol extract, osteoarthritis, articular cartilage, chondrocyte, inflammation, oxidative stress, network pharmacology

中图分类号:

郑俭彬, 陆玉春, 江自鲜, 李秀芳, 王涛, 王文静. 彝药斯赤列甲醇提取物对骨关节炎模型大鼠的治疗作用及靶点预测[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(23): 3627-3635.

Zheng Jianbin, Lu Yuchun, Jiang Zixian, Li Xiufang, Wang Tao, Wang Wenjing. Yi medicine Sambucus adnata Wall methanol extract in a rat osteoarthritis model: therapeutic effect and target prediction[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(23): 3627-3635.

图/表（结果） 17

2.1 实验动物数量分析参加此次实验样本量为50只大鼠，最后进入结果分析样本量为41只大鼠。在实验过程中共有9只大鼠死亡，其中3只大鼠死于术后感染，6只大鼠死于肠梗阻，见表2。

2.2 SAW-C对骨关节炎大鼠关节X射线成像的影响与假手术组相比，模型组大鼠关节间隙模糊，炎症严重。与模型组相比，SAW-C高、低剂量组大鼠关节间隙以及炎症情况得到改善，见图2。

2.3 SAW-C对骨关节炎模型大鼠关节宽度的影响自造模第11天起，与假手术组相比，模型组大鼠的关节宽度显著扩大(P < 0.001)；与模型组相比，SAW-C高、低剂量组大鼠的关节宽度均显缩小(P < 0.001)，见图3。

2.4 SAW-C对骨关节炎模型大鼠关节腔灌洗液中肿瘤坏死因子α水平的影响与假手术组相比，模型组关节腔灌洗液中肿瘤坏死因子α水平明显升高(P < 0.01)，与模型组相比，SAW-C高剂量组大鼠关节腔灌洗液中肿瘤坏死因子α水平均明显降低(P < 0.05)，见图4。

2.5 SAW-C对骨关节炎模型大鼠血清氧化应激指标的影响与假手术组相比，模型组血清中前列腺素E2水平明显升高(P < 0.05)，与模型组相比，SAW-C高剂量组(P < 0.05)与低剂量组(P < 0.01)大鼠血清中前列腺素E2水平均明显降低，见图5A。与假手术组相比，模型组血清中超氧化物歧化酶水平明显降低(P < 0.05)，与模型组相比，SAW-C高、低剂量组大鼠血清中超氧化物歧化酶水平均显著升高(P < 0.01)，见图5B。与假手术组相比，模型组血清中丙二醛水平明显升高(P < 0.05)，与模型组相比，SAW-C高剂量组大鼠血清中丙二醛水平显著降低(P < 0.01)，低剂量组大鼠血清中丙二醛水平仅具有下降趋势但无显著差异，见图5C。

2.6 苏木精-伊红染色结果假手术组大鼠关节腔结构完整，软骨表面光滑平整，胫骨平台软骨层厚薄均一，潮线清晰结构完整，软骨细胞排列整齐，层次分明；模型组大鼠关节胫骨平台软骨磨损严重，软骨被大面积结缔组织所取代(蓝色箭头)，可见大量炎症细胞浸润(红色箭头)，软骨全层破坏，软骨细胞排列紊乱，大量集簇于软骨组织表面并且数量明显减少，潮线结构消失；与模型组相比，布洛芬组大鼠关节胫骨平台软骨表面相对平滑，但仍然有轻微磨损，软骨层厚度稍不均一，潮线结构相对完整，软骨细胞排列稍显紊乱；SAW-C低剂量组大鼠关节胫骨平台软骨磨损情况得到改善，表面相对完整光滑，潮线相对结构完整但不清晰，软骨细胞排列与数量如常；SAW-C高剂量组大鼠关节胫骨平台软骨表面平滑，产生微小裂隙，潮线结构不清晰，软骨细胞排列与数量如常，提示SAW-C能够维持骨关节炎大鼠膝关节软骨形态，缓解骨关节炎的发展，见图6。

2.7 Mankin’s评分结果与假手术组相比，模型组Mankin’s评分显著升高(P < 0.001)，与模型组相比，SAW-C高、低剂量组Mankin’s评分均显著降低(P < 0.05)，见图7。

2.8 SAW-C对全层软骨厚度的影响与假手术组相比，模型组全层软骨厚度显著降低(P < 0.001)，与模型组相比，SAW-C高剂量组(P < 0.01)与低剂量组(P < 0.05)大鼠全层软骨厚度均显著升高，见图8。

2.9 SAW-C对透明软骨厚度的影响与假手术组相比，模型组透明软骨厚度显著降低(P < 0.001)，与模型组相比，SAW-C高、低剂量组透明软骨厚度均显著升高(P < 0.001)，见图8。
2.10 SAW-C对膝关节软骨矿质化程度的影响与假手术组相比，模型组大鼠膝关节软骨矿质化程度显著升高(P < 0.001)，与模型组相比，SAW-C高、低剂量组大鼠膝关节软骨矿质化程度均显著下降(P < 0.001)，见图8。
2.11 SAW-C对软骨下骨骨小梁面积的影响与假手术组相比，模型组大鼠膝关节软骨下骨骨小梁面积显著减小(P < 0.001)，与模型组相比，SAW-C高、低剂量组大鼠膝关节软骨下骨骨小梁面积均显著上升(P < 0.05)，见图9。

2.12 番红-固绿染色结果与假手术组相比，模型组软骨层厚度减少，染色不均，蛋白聚糖大量丢失；SAW-C高、低剂量组软骨损伤减轻，蛋白聚糖增加，提示SAW-C能够维持骨关节炎大鼠膝关节软骨中蛋白聚糖的含量，见图10。

2.13 网络药理学预测结果
2.13.1 SAW-C活性成分筛选结果一共查找到40个化学成分，满足筛选要求的成分共20个，有2个无相关靶点，见表3。

2.13.2 骨关节炎疾病相关靶点基于GeneCards、OMIM以及TTD疾病数据库获得骨关节炎相关基因靶点，GeneCards数据库共3 647个基因靶点、OMIM数据库共36个基因靶点、TTD数据库共33个。经过筛选，合并3个疾病数据库结果，删除重复项，共获得骨性关节炎相关基因靶点3 692个。
2.13.3 SAW-C与骨关节炎共同作用靶点基因通过比对化合物潜在靶点与疾病相关基因，得到二者的交集，最终得到188个与斯赤列治疗骨关节炎作用相关的靶点，见图11，表4。

2.13.4 构建“药物-成分-疾病靶点”网络共有208个节点和711条边，其中左侧圆形代表SAW-C及其活性成分，中间3个圆形代表共同靶点，右侧圆形代表骨关节炎，见图12。

2.13.5 GO与KEGG富集分析在GO功能富集分析中，生物过程主要参与对有机的反应、对含氧化合物的反应、细胞对化学刺激的反应、对化学物质的反应等。细胞成分主要富集于膜筏、膜微域、质膜、膜区域以及细胞外周等。分子功能主要与蛋白激酶活性、磷酸转移酶活性、醇基作为受体、激酶活性、转移酶活性以及转移含磷基团等有关，见图13。此外，在KEGG通路富集结果中，SAW-C治疗骨关节炎过程中主要涉及EGFR、C型凝集素受体、AGE-RAGE等信号通路，见图14。

2.13.6 构建蛋白互作网络(PPI) 通过degree值的中位数逐步筛选，得到重要靶点。结果显示，节点数21，196条边，见图15。

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引言

骨关节炎是临床常见病，多发于膝关节、踝关节等承重关节，其中膝骨关节炎是骨关节炎中最常见的类型，病理学改变多见关节软骨退化、滑膜炎、软骨下骨硬化等，临床表现为关节腔炎症、关节肿胀、疼痛、僵硬等，甚至发生瘫痪，是导致老年人残疾的主要原因之一[1-2]。目前对骨关节炎发病机制的认识还不够清楚，普遍研究认为炎症、软骨退行性病变为其主要原因[3-4]，尤其是关节软骨相关的炎症反应及细胞衰老在骨关节炎发生、发展中的关键作用受到了广泛关注，大量研究围绕关节软骨进行性丧失的机制展开，但至今尚无一个独立的关节软骨保护剂获得临床认可，骨关节炎作为一个涉及复杂病理机制的疾病，单一环节的干预措施无法阻止疾病进一步发展。随着研究的深入，越来越多的证据表明骨关节炎是一个动态发展过程，其病理过程涉及骨关节组织微环境复杂的时间和空间级联反应，骨关节炎的病理生理改变并不仅仅局限于软骨细胞，还包括位于关节组织微环境中的所有功能结构——软骨细胞、成骨细胞、骨细胞、软骨下骨、细胞外基质及机体免疫系统[5-8]。因此，骨关节炎的治疗策略应从单一环节的关节软骨保护拓展为对关节组织微环境中的各关节组成及细胞成分的全面调控，这可能是控制骨关节炎进行性发展及降低致残率的重要途径。
彝药“斯赤列”，植物学名血满草(Sambucus adnata Wall.)，为忍冬科(Caprifoliaceae)接骨木属(Sambucus Linn.)植物，又名接骨药、接骨丹、血管草、血蛮草等，地上部分或全草入药，该植物在云南分布广泛，资源丰富，彝医长期将其用于治疗骨折、跌打劳伤、关节炎、风湿疼痛等，疗效确切[9]。课题组前期研究显示，斯赤列具有促进大鼠骨折愈合、减轻炎症及缓解疼痛的作用，其活性部位水提取物(SAW-A)和二氯甲烷提取物(SAW-B)可通过促进成骨细胞增殖、分化和成熟相关基因的表达发挥促进骨折愈合作用[10]。此次实验通过给予斯赤列甲醇提取物(SAW-C)干预骨关节炎模型大鼠，探究SAW-C对骨关节炎的治疗作用，并运用网络药理学方法预测SAW-C和骨关节炎之间的相关靶点及通路。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计对比观察实验及网络药理学分析。
1.2 时间及地点实验于2020年10月至2021年1月在云南中医药大学国家中医药管理局科研三级实验室中药药理实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 SD大鼠50只，SPF级，雌性，体质量180-200 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK(湘)2019-0004，在云南中医药大学动物实验室[许可证号：SYXK(滇)K2022-0004]饲养，实验操作符合云南中医药大学动物伦理学要求，审批号：R-062022099。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。
1.3.2 主要试剂与仪器斯赤列植物2020年8月采于云南省曲靖市马龙区，经云南中医药大学普春霞副教授鉴定为斯赤列，由云南中医药大学分析化学实验室进行提取、备用。布洛芬片(华中药业股份有限公司，批号：20220203)；注射用青霉素钠(江西金康佳生化药业，批号：202110001)；40 g/L多聚甲醛(Biosharp公司，批号：20220603)；二甲苯(天津市风船化学试剂科技有限公司，批号：20220801)；无水乙醇(天津市致远化学试剂有限公司，批号：2021060902)；苏木精染色液(无锡市江原实业技茂总公司，批号：20210508)；伊红染色液(无锡市江原实业技茂总公司，批号：20210401)；改良番红O-固绿软骨染色试剂盒(索莱宝生物科技有限公司)；中性树胶(南昌雨露实验器材有限公司，批号：220221)；肿瘤坏死因子α测试盒(南京建成生物工程研究所，货号：H052-1-1)；前列腺素E2测试盒(南京建成生物工程研究所，货号：H099-1-2)；总超氧化物歧化酶测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，货号：A001-3-2)；丙二醛测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，货号：A003-1-2)；低温高速离心机(Hitachi Koki公司)；-80 ℃超低温冰箱(美国Thermo Fishe公司)；漩涡混合器(其林贝尔仪器制造有限公司)；石蜡包埋机(美国Thermo Fisher公司)；轮转式病理切片机(美国Thermo Fisher公司)；酶标仪(瑞士Tecan公司)；摄影生物显微镜(日本OLYMPUS公司)。
1.4 方法
1.4.1 受试物SAW-C的制备新鲜斯赤列叶与茎皮100 g，用甲醇浸提2次，每次48 h，过滤，得到浸提液，经石油醚萃取后得到的甲醇提取物部分，通过45 ℃减压浓缩得到浸膏，最后通过50 ℃烘箱干燥即得SAW-C样品(4.5 g，提取率为4.5%)。得到的干燥粉末经超高效液相色谱仪检测，能够从色谱图中找到熊果酸、齐墩果酸、胡萝卜苷、β-香树脂、α-香树脂以及β-谷甾醇6个化学成分所对应的峰。
1.4.2 动物分组及给药将50只SD大鼠适应性喂养3 d，随机分为5组，假手术组、模型组、布洛芬组、SAW-C低剂量组、SAW-C高剂量组各10只。根据文献[9]得到人内服斯赤列给药量后，通过公式以及SAW-C提取率，计算得到SAW-C最终给药剂量。造模后，布洛芬组灌胃18 mg/kg的布洛芬，SAW-C低剂量组灌胃303.75 mg/kg的SAW-C，SAW-C高剂量组灌胃607.5 mg/kg的SAW-C，均1次/d，持续21 d，正常组、模型组同期给予同体积生理盐水灌胃。
1.4.3 前交叉韧带切断制备大鼠骨关节炎模型、SAW-C干预及取材采用戊巴比妥钠(400 mg/kg)麻醉大鼠，仰卧位固定，于两侧膝关节偏内侧做一个纵向约3 cm的切口。膝关节由白色韧带组织(髌骨韧带)沿着内侧偏上轻轻划开一个小口，剪开大约1 cm切口后屈膝，将髌骨外翻暴露膝关节，剪断与髁间窝相连的髌下皱襞，即可看到其下方的前交叉韧带；剪断前交叉韧带，进行抽屉实验验证前交叉韧带是否完全剪断；缝合切口。术后连续皮下注射青霉素钠3-5 d，防止术后感染，并于造模第22天麻醉后处死动物，腹主动脉取血，常规方法制备血清-80 ℃保存；用眼科剪暴露关节腔，用1 mL注射器抽取0.1 mL生理盐水冲洗关节腔得到关节腔灌洗液，所得关节腔灌洗液分装后-80 ℃保存；取膝关节置40 g/L多聚甲醛固定液中保存，用于制作石蜡切片。

1.4.4 膝关节X射线片病理检查造模第21天，戊巴比妥钠麻醉大鼠后，仰卧位固定，采用小动物成像X光机拍摄膝关节，摄片条件为50 kVP，曝光时间为40 ms。X射线片拍摄在云南农业大学附属兽医院完成。

1.4.5 关节宽度测量造模前1 d、造模后第1，11，21天，使用游标卡尺测量大鼠两侧膝关节最宽处，左右两侧关节宽度取平均值用于统计。
1.4.6 试剂盒检测肿瘤坏死因子α水平根据试剂盒说明书检测大鼠关节腔灌洗液中肿瘤坏死因子α水平。
1.4.7 试剂盒检测氧化应激指标水平根据试剂盒说明书检测大鼠血清中前列腺素E2、超氧化物歧化酶、丙二醛水平。
1.4.8 膝关节石蜡标本的制作新鲜的膝关节在37 ℃脱钙液中脱钙三四周(以1 mL注射器针头能够扎入样本为标准)，随后经过脱水、透明、浸蜡、包埋等过程制成组织蜡块，最后使用转轮式石蜡切片机切片(厚度为5 μm)。

1.4.9 苏木精-伊红染色病理检查切好的石蜡切片经过二甲苯以及梯度乙醇脱蜡后，分别使用苏木精和伊红染色液进行染色，随后依次放入体积分数为95%乙醇Ⅰ、体积分数为95%乙醇Ⅱ、无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ中进行脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，生物显微镜下拍照观察。

1.4.10 膝关节苏木精-伊红染色Mankin’s评分根据表1的评分标准，给每只鼠膝关节苏木精-伊红染色切片打分，取两侧膝关节所得分数的平均值进行统计。

1.4.11 膝关节全层软骨厚度、透明软骨层厚度的测量膝关节软骨全层厚度可分为透明软骨层与钙化软骨层，其中膝关节全层软骨厚度与透明软骨层厚度都能够直观反映出各组样本之间软骨损伤程度。此次实验通过CaseViewer软件测量功能对各层软骨的厚度进行测量。

1.4.12 膝关节软骨矿质化程度计算通过膝关节软骨全层厚度减去透明软骨层厚度得到钙化层厚度，最后根据公式得到软骨矿质化程度，矿质化程度(%)=钙化层厚度/软骨全层厚度，作为评价软骨内部损伤程度的指标。见图1。

1.4.13 膝关节软骨下骨小梁面积测量通过Image J软件测量膝关节软骨下骨的骨小梁面积。
1.4.14 番红O-固绿染色病理检查石蜡切片经过二甲苯脱蜡以及梯度乙醇水化后，置于新鲜配制的Weigert染色液中浸染，用蒸馏水冲洗掉多余的染色液后在分化液中分化，随后依次在固绿和番红O染色液中浸染，待片子晾干，二甲苯透明，中性树胶封固，摄影生物显微镜下拍照观察。
1.5 网络药理学预测
1.5.1 SAW-C活性成分的筛选通过相关文献查找斯赤列的化学成分，并绘制其化学结构。按SwissADME分析平台筛选要求“胃肠吸收高，类药性满足≥2个yes”的成分，符合筛选条件的成分于SwissTargetPrediction分析平台预测靶点，除去probability为0的靶点。
1.5.2 骨关节炎疾病相关靶点的获取以“Osteoarthritis”为关键词，通过GeneCards(https://www.genecards.org/)、OMIM (http://www.omim. org/)、TTD (http://db.idrblab.net/ttd/)数据库寻找骨关节炎相关的靶点。筛除重复靶点基因，最终获得骨关节炎的相关靶点基因。
1.5.3 SAW-C与骨关节炎共同作用靶点基因的获取使用venny 2.1软件，输入斯赤列的靶点基因和骨关节炎的靶点基因进行对比，筛选出交集靶点，得到斯赤列和骨关节炎共有靶点。
1.5.4 构建“药物-成分-疾病-靶点”网络将斯赤列和骨关节炎共有关靶点导入cytoscape软件，构建斯赤列治疗骨性关节炎的“活性成分-疾病-靶点”网络模型。
1.5.5 绘制生物学过程与通路富集分析图将斯赤列和骨关节炎共有关靶点导入omicShare(https://www. omicshare.com/)，进行京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedoa of Genesand Genomes，KEGG)富集分析，物种选择“人”，筛选P≤0.01和基因占比综合比较排名前20的通路绘图。KEGG通路选取删除癌症通路后的前20条通路。
1.5.6 构建蛋白互作网络(PPI) 将斯赤列与骨关节炎共有靶点数据输入STRING数据库中进行多种蛋白质(multiple proteins)分析，预测蛋白质之间的相互作用，物种选用“人”(homo sapiens)，下载其tsv文件，导入cytoscape软件进行网络分析。
1.6 主要观察指标各组大鼠膝关节X射线片观察膝关节整体形态；膝关节宽度；氧化应激指标、炎症因子水平；苏木精-伊红染色观察膝关节软骨形态、潮线结构以及软骨细胞数量及形态；Mankin’s评分；全层软骨厚度；透明软骨厚度；软骨矿质化程度；骨小梁面积；番红-固绿染色观察关节软骨中蛋白聚糖的含量；蛋白网络互做PPI图；GO功能富集分析；KEGG信号通路分析。
1.7 统计学分析采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析，计量数据以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析法(One-way analysis of variance，ANOVA)，方差齐者采用LSD法检验，方差不齐者采用Tamhanes法检验。文章统计学方法已经云南中医药大学生物统计学专家审核。

讨论

骨关节炎是一种与年龄相关并且具有致残性的疾病。据统计全球60岁以上人群中有35%患有症状性骨关节炎[11]。目前在临床上常使用非类固醇抗炎药和曲马多治疗骨关节炎，但非类固醇抗炎药具有肠胃和心血管不良反应，临床上常用于短效治疗[12]。因此当前仍然缺乏用于预防或逆转骨关节炎发展的安全有效的药物。
彝族为中国西南地区民族历史悠久和人口数量最多的少数民族之一，彝族人民在长期的医疗实践活动中创立独具民族和地域特色的民族医药体系。彝药斯赤列长期被彝医用于治疗骨折、跌打劳伤、关节炎、风湿疼痛等，据目前研究显示，斯赤列所含的活性化学成分具有血管紧张素转换酶抑制、抗炎以及镇痛等活性[13-15]。此次研究采用前交叉韧带切断法来复制大鼠骨关节炎模型作为研究对象。交叉韧带是防止胫骨移位、维持膝关节稳定性的重要结构之一，与膝关节屈曲伸直位、肌肉收缩状态、负重或非负重区都有关系。单纯前交叉韧带离断术可以改变关节前向稳定，增大关节间活动度，增加骨摩擦，从而造成骨关节炎[16]。由于关节软骨缺乏血管、神经以及淋巴，导致其在衰老或者是关节损伤过程中难以自我修复。受伤的软骨不仅会加速细胞外基质的降解，还能使线粒体结构与功能发生改变产生大量活性氧，介导炎症[17-18]，推动骨关节炎进程，因此减轻软骨损伤对阻止骨关节炎的进一步发展具有重要意义。实验结果显示，经过SAW-C干预后能够明显抑制骨关节炎大鼠血清中丙二醛的产生，提高超氧化物歧化酶水平，同时显著降低骨关节炎大鼠关节腔灌洗液中肿瘤坏死因子α水平，提示SAW-C具有较好的抗氧化损伤及减轻骨关节炎模型关节腔局部炎症反应的作用。前列腺素E2是多种疾病的主要炎症递质，同时也被认为是骨代谢局部调节因子之一[19]。有大量研究证明，前列腺素E2能够激活软骨下骨中破骨细胞EP4受体促进软骨下骨中H型血管的生成，进一步促进骨关节炎的发展与疼痛[20-21]，在此次实验中，经过SAW-C干预后能够明显抑制骨关节炎大鼠血清中前列腺素E2水平。
关节软骨主要由胶原纤维与蛋白多糖构成，覆盖于关节相连骨的表面，发挥吸收振荡与缓冲应力等重要作用，是支撑身体的关键。关节软骨损伤、退化是骨关节炎最明显的症状之一[22]，因此减轻关节软骨损伤程度是判断SAW-C药效的重要指标。X射线影像学结果显示，经过SAW-C干预后，骨关节炎大鼠膝关节损伤得到改善，毛玻璃阴影面积显著减少，骨赘减少。自造模后第11天，SAW-C高、低剂量组关节宽度均明显下降。苏木精-伊红染色是当前够判断病理进程的一种简单、高效、准确的病理染色手段，结果可见经SAW-C干预后骨关节炎大鼠膝关节软骨组织表面都较为光滑平整，未见大面积炎症细胞浸润，软骨细胞排列以及数量正常。Mankin’s评分是学术界公认的对骨性关节炎软骨退变程度进行评价的通用标准，该标准分别从软骨结构、软骨细胞以及潮线3个方面对软骨进行评分，所得分数越高则表明软骨损伤愈加严重。SAW-C高、低剂量组Mankin’s评分较模型组均显著降低，提示SAW-C可减轻骨关节炎关节软骨损伤，减缓其病变程度。膝关节软骨由浅至深依次分为浅表层、过渡层、辐射层和钙化层，前3层并称为透明软骨，钙化层是与软骨下骨紧密连接的部分，并与其合称为软骨下矿化组织[23]。运用CaseViewer软件测量全层软骨厚度与透明软骨层厚度，结果显示，SAW-C高、低剂量组全层软骨厚度与透明软骨层厚度较模型组厚，软骨矿质化程度较模型组显著降低。随着骨关节炎的发展，关节软骨损伤程度加重，使关节出现畸变，导致软骨应力发生改变，为了发挥吸收振荡缓冲应力等功能，软骨下骨产生了代偿性密度的改变[24-25]。软骨下骨包括软骨下骨板与骨小梁结构，有研究发现在骨关节炎发展早期，软骨下骨厚度变薄，骨小梁面积减少，晚期虽然产生骨赘，但骨小梁仍进一步变薄，面积变小[26-27]。运用ImageJ软件测量膝关节软骨下骨的骨小梁面积，以此判断骨密度的大小，结果显示，SAW-C高、低剂量组膝关节骨小梁面积均较模型组增大。番红O-固绿染色原理在于嗜碱性的软骨与碱性染料番红O结合呈现红色，嗜酸性的骨和酸性染料结合而呈绿色或蓝色，与呈现红的软骨对比鲜明，从而将软骨组织和骨组织区分开。蛋白聚糖是一类由核心蛋白与1条或多条共价连接的氨基聚糖所组成的糖复合物，是细胞膜、基底膜以及细胞外基质的重要组成成分，与组织细胞的结构和功能息息相关[28]。番红O着色与阴离子的浓度近似呈正比关系，间接反映了基质中蛋白聚糖的含量和分布。当软骨受到损伤时，软骨中的蛋白聚糖会释放出来，使基质成分分布不均，从而导致番红O淡染或不着色。从染色结果能够看出，与模型组相比，SAW-C高、低剂量组膝关节软骨蛋白聚糖流失情况均得到明显改善。以上结果提示，SAW-C可从减轻关节软骨损伤、降低关节宽度、改变膝关节病理状态、维持软骨蛋白聚糖含量等多个角度发挥治疗作用。
为了预测SAW-C治疗骨关节炎的作用机制，该研究采用网络药理学分析的方法，对SAW-C中所含的主要化学成分与骨关节炎的疾病靶点进行了相关性分析。通过网络药理学成分筛选得到SAW-C治疗骨关节炎的活性成分共20个，核心成分有咖啡酸乙酯、木犀草素、山柰酚、洋芹素、2α，23-二羟基-熊果酸等。咖啡酸乙酯、木犀草素、山柰酚、洋芹素均属于黄酮类化合物，2α，23-二羟基-熊果酸为三萜类化合物。黄酮类化合物在自然界中广泛存在，具有抗炎、抗氧化以及抗肿瘤等生物学特性[29]，研究表明木犀草素能够通过激活AMPK/Nrf2信号通路，对过氧化氢刺激后的原代小鼠软骨细胞具有明确的抗炎抗氧化和防止细胞外基质降解的保护作用[30]。熊果酸为三萜类化合物，同样具有显著的抗炎、抗氧化生物学特性，熊果酸能通过抑制肿瘤坏死因子α诱导软骨细胞中NLPR3、ASC和P20的上调，从而发挥抗炎作用，减缓骨关节炎的发展[31]。PPI网络分析结果显示，TNF、AKT1、IL-6、MAPK3、SRC等靶点可能是SAW-C治疗骨关节炎的核心靶点。有研究表明，肿瘤坏死因子、白细胞介素6、白细胞介素1α、白细胞介素1β等炎症因子水平提高能够诱导软骨细胞凋亡，导致骨关节炎[32]。KAT1调控细胞的增殖和生长，有研究报道，miR-495能够通过AKT1和AKT/mTOR信号通路促进软骨细胞的凋亡和衰老，促进骨关节炎发展[33]。MAPK3为MAPK蛋白激酶家族中的一员，常与MAPK1组成MAPK1/3。MAPK1/3不仅调节细胞的增殖生长、凋亡、迁移、分化和稳态等，也与多种细胞病变有着密不可分的关系[34]。SRC是非受体酪氨酸激酶，能够被多条信号传导途径所激活，与细胞的增殖、凋亡以及血管生成等相关。有研究报道，白细胞介素1β诱导后软骨细胞中SRC同源2结构域蛋白酪氨酸激酶(SHP2)表达显著上升[35]，这是由于SHP2能够激活MAPK、NF-κB以及β-Catenin等信号通路上调基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶13等因子水平，促进骨关节炎发展。SAW-C治疗骨关节炎涉及EGFR信号通路、C型凝集素受体信号通路、AGE-RAGE信号通路、内分泌障碍等。EGRF是一种位于细胞膜表面的糖蛋白，属于酪氨酸激酶型受体。EGRF信号通路在关节软骨的发育、代谢和病变中发挥重要作用[36-37]，有大量文献报道，EGRF信号通路能够激活关节软骨prg4的表达，维持软骨稳态，缓解骨关节炎[38-40]。
RAGE为晚期糖基化终产物受体，广泛参与众多疾病的病理过程，与炎症疾病相关[41]。AGE-RAGE信号通路能够激活下游信号传导通路，包括p38MAPK、NF-κB、磷脂酰肌醇3-激酶等，共同参与氧化应激、炎症和促进细胞凋亡[42]。因此抑制AGE-RAGE信号通路及其下游信号传导通路，就能够有效地缓解骨关节炎的发展。
综上所述，实验研究结果显示SAW-C具有显著的抗炎、抗氧化作用，并且能够改善膝关节的病理状态，有效缓解了骨关节炎的发展进程。网络药理学分析提示其作用靶点可能与抑制肿瘤坏死因子、AKT1、白细胞介素6等因子释放及抑制EGFR信号通路和AGE-RAGE信号通路的过度激活有关，深入的机制有待进一步验证。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

彝药斯赤列甲醇提取物对骨关节炎模型大鼠的治疗作用及靶点预测

Yi medicine Sambucus adnata Wall methanol extract in a rat osteoarthritis model: therapeutic effect and target prediction

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