2.1   Ad.HGF修饰提高DPSC-Exo中HGF表达   提取的DPSC-Exo粒径均一，集中在30-150 nm之间，符合外泌体大小特征，见图1A。CD9、CD63和TSG101产生于细胞中，定位于膜结构附近，参与外泌体囊泡的形成和分泌过程[17]，是外泌体表面特异性标记蛋白。Western blot结果显示，DPSC-Exo 中CD9、CD63、TSG101表达均呈阳性，见图1B。DPSCs用携带人HGF的重组腺病毒(Ad.HGF)进行感染，感染后48 h用qRT-PCR检测细胞中HGF的mRNA表达水平，结果显示，与未感染的DPSCs相比，感染后的DPSCs中HGF mRNA表达水平显著上调(P < 0.001)，见图1C。Western blot检测结果显示，未感染的DPSCs及其外泌体中HGF基本没有表达，而Ad.HGF DPSCs以及Ad.HGF DPSC-Exo中HGF表达水平显著上调，见图1D，E。



2.2   HGF修饰的DPSC-Exo联合丙二醇减轻放射诱导的HaCaT细胞增殖抑制和凋亡，促进细胞迁移   通过流式细胞术检测各组HaCaT细胞凋亡情况，见图2A，B，在暴露于10 Gy的X射线下，HGF. DPSC-Exo组、丙二醇组、HGF.DPSC-Exo+丙二醇组细胞凋亡率均显著降低，而HGF.DPSC-Exo+丙二醇组降低最为明显，细胞凋亡减少了19%。细胞增殖结果显示，HGF. DPSC-Exo组、丙二醇组、HGF.DPSC-Exo+丙二醇组对于HaCaT细胞的增殖有显著保护作用(P < 0.01)。但是3个处理组之间没有显著性差异，见图2C。迁移实验结果显示，照射后HaCaT细胞迁移能力明显受到抑制，而HGF. DPSC-Exo组、丙二醇组、HGF.DPSC-Exo+丙二醇组HaCaT细胞的迁移能力显著改善，其中HGF.DPSC-Exo+丙二醇组最为显著，恢复到接近未受照水平，见图2D。



2.3   HGF修饰的DPSC-Exo联合丙二醇减轻HaCaT细胞的G2/M阻滞，降低细胞周期基因表达    研究表明，受到电离辐射的细胞会通过启动G2/M期阻滞信号通路等途径来修复辐射对细胞造成的损伤。细胞周期分析结果见图3A，B，照射后48 h，单纯照射组G2/M期细胞比例显著升高(P < 0.001)，丙二醇组、HGF.DPSC-Exo组以及HGF.DPSC-Exo+丙二醇组的G2/M期细胞比例显著低于单纯照射组(P < 0.01)，表明放射能够诱导HaCaT发生细胞周期的G2/M期阻滞，而HGF.DPSC-Exo、丙二醇以及二者联合处理都能减轻放射诱导的细胞G2/M期阻滞，其中联合处理作用效果最为显著。
研究表明，上调P21和P53基因表达会导致细胞周期阻滞，从而影响细胞增殖等过程。PCR和Western blot结果显示，照射后48 h，HaCaT细胞中P21、P53基因表达均明显上调(P < 0.001)，而丙二醇组、HGF.DPSC-Exo组以及HGF.DPSC-Exo+丙二醇组的P21、P53基因表达显著低于单纯照射组(P < 0.01)，表明放射能诱导HaCaT细胞P21、P53的表达上调，从而阻滞细胞于G2/M期，以进行DNA的损伤修复，而HGF.DPSC-Exo、丙二醇以及二者联合处理细胞P21、P53基因表达均处于正常水平，说明处理后细胞的DNA等大分子没有受到严重损伤，不需要启动P53和P21的上调表达，以阻止细胞分裂，进行修复，见图3C-G。



2.4   HGF修饰的DPSC-Exo与丙二醇联合处理降低HaCaT细胞炎性因子的表达   在照射后48 h，用qRT-PCR检测HaCaT细胞炎症因子表达水平，结果显示，与对照组相比，照射后HaCaT细胞中促炎因子白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α表达均显著上调。3个不同处理组肿瘤坏死因子α表达均恢复到正常水平，丙二醇组和HGF.DPSC-Exo+丙二醇组的白细胞介素6也恢复到正常水平。但白细胞介素1β在HGF.DPSC-Exo组中表达水平显著增加，高于其他组(P < 0.001)，而HGF.DPSC-Exo+丙二醇组明显降低，并恢复到正常水平。实验结果表明，丙二醇与HGF.DPSC-Exo联合作用抑制炎症的效果优于二者单独应用，见图4。

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放射性皮肤损伤又称放射性皮炎，是放疗中常见的并发症[1]。约有95%的患者在接受放疗后会出现不同程度的皮肤损伤，且当照射剂量到达一定程度时甚至会诱发皮肤恶变。放射性皮肤损伤不仅会影响患者的生活质量，限制放射治疗的剂量，在皮肤受损严重时甚至要终止放疗，影响治疗效果[2-3]。此外，职业暴露、核事故等也可引起放射性皮肤损伤[4]。目前，临床上对于放射性皮肤损伤的管理和治疗并无统一的标准，虽有许多局部或全身药物用于治疗和预防，但是各种临床试验的结论往往相互矛盾，缺乏普遍性[5-6]。
1，2-丙二醇(1，2-Propanediol，PPD)是一种低毒的小分子化合物，可以用作药物溶剂、食品添加剂、医药、化妆品和电子香烟中的保湿剂[7-8]。同时，丙二醇还可作为助溶剂，增强药物在皮肤中的渗透[9]。课题组先前的研究证明，丙二醇于照射前预处理可以减轻放射诱导的HaCaT细胞损伤，可以用作一种辐射保护剂。但只通过放射前给药，其防护作用效果有限，将辐射防护和辐射治疗联合应用，可发挥更佳的辐射保护作用。
间充质干细胞来源外泌体被认为是间充质干细胞的主要分泌产物，可以通过将包含的mRNAs、miRNAs和蛋白质转移到靶细胞来调节细胞间的通讯，促进伤口愈合[10]。外泌体外壳能很好地维持有效成分的活性，同时其包裹作用又降低了蛋白的免疫原性，可以作为普通间充质干细胞治疗的有效替代方案[11]。与普通间充质干细胞外泌体相比，经过基因修饰的普通间充质干细胞分泌的外泌体功能显著增强，治疗疾病的效果也更佳。肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)是一种重要的多功能细胞因子，具有强大的促细胞有丝分裂作用，能够促进细胞增殖[12]，对细胞的促增殖作用强于血管内皮生长因子和成纤维细胞生长因子[13]，同时，HGF高表达载体的构建不受细胞来源及修饰方法的影响[14-16]，可以作为间充质干细胞功能修饰的理想选择。因此，HGF修饰的间充质干细胞来源外泌体可能更有效地治疗放射性皮肤损伤。
该研究使用HGF修饰的人牙髓干细胞来源外泌体(dental pulp stem cells derived exosome，DPSC-Exo)联合丙二醇分别处理放射损伤的HaCaT细胞，通过细胞凋亡、细胞增殖、细胞迁移、细胞周期来评估对放射性皮肤损伤的保护作用，为研究放射性皮肤损伤治疗方法提供可靠的实验依据，为临床治疗放射性皮肤损伤开创新的思路。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1    设计   细胞学实验观察。
1.2   时间及地点   实验于2022年1月至2023年1月在中国人民解放军军事科学院军事医学研究院辐射医学院研究所完成。
1.3   材料
1.3.1   细胞株   DPSCs为军事医学研究院辐射医学研究室保存，人永生化角质细胞系HaCaT由军事医学研究院周文霞教授实验室惠赠。该研究的实施符合军事医学研究院的相关伦理要求。
1.3.2   药品、试剂及仪器   DMEM/F12培养基，货号：D8437，购自Sigma公司；α-MEM培养基，货号：C12571500BT，购自Gibco公司；胎牛血清，货号：FND500，购自依科赛科技有限公司；1，2-丙二醇，货号：30157018，购自中国国药集团化学试剂有限公司；细胞凋亡试剂盒，货号：559763，购自美国BD公司；细胞周期与细胞凋亡试剂盒，货号：C1052，购自上海碧云天生物有限公司；RNA快速提取试剂盒，货号：RN001，购自上海奕杉生物科技公司；快速反转录试剂盒，货号：RT001，购自上海奕杉生物科技公司；Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix，货号：11201ES08，购自上海翌圣生物科技股份有限公司；山羊抗人HGF多抗，货号：MAB694-100，购自美国R＆D公司；兔抗人CD9，货号：ab307085，购自英国Abcam公司；TSG101，货号：ab133586，购自英国Abcam公司；CD63多抗，货号：ab216130，购自英国Abcam公司；兔抗人p53，货号：ab32049，购自英国Abcam公司；兔抗人p21，货号：ab109520，购自英国Abcam公司；兔抗人β肌动蛋白(β-actin)多抗，货号：81115-1-RR，购自美国Proteintech公司；辣根酶标记山羊抗兔IgG，货号：ZB5301，购自北京中杉金桥生物科技有限公司；辣根酶标记兔抗山羊IgG，货号：S0010，购自江苏亲科生物研究中心有限公司；PCR引物由北京天一辉远生物科技有限公司合成；CCK-8试剂盒，货号：C6005M，购自上海Bimake公司；Varioskan Flash光谱扫描多功能酶标仪购自美国Thermo公司；Power Pac164-5050电泳仪购自美国Bio-Rad公司；Tanon5200全自动化学发光成像仪购自上海天能公司；BD FACS Calibur流式细胞仪购自美国BD公司；7500 Fas实时荧光定量PCR系统购自美国ABI公司；紫外分光光度计购自美国Thermo公司；Rad Source R2000 X-射线仪器购自美国Rad Source公司；细胞培养耗材购自Corning公司。Ad.HGF由军事医学研究院辐射医学研究室构建。
1.4   实验方法   
1.4.1   实验分组
(1)观察Ad.HGF感染效率的实验分组：生长状态良好的第6代DPSCs分为DPSCs组以及Ad.HGF DPSCs组。按照分组加入Ad-HGF进行感染，继续培养48 h检测HGF的mRNA及蛋白表达水平。
(2)观察丙二醇联合Ad.HGF DPSC-Exo对细胞保护作用的实验分组：将生长状态良好的HaCaT细胞用胰酶消化，分别以5×103/孔和3×105/孔种植于96孔板和6孔板中，过夜培养。细胞分为以下5组：对照组、单纯照射组、照射+250 mmol/L丙二醇组(丙二醇组)、照射+Ad.HGF DPSC-Exo组(HGF.DPSC-Exo组)、照射+250 mmol/L丙二醇+Ad.HGF DPSC-Exo组(HGF.DPSC-Exo+丙二醇组)。细胞于照射前2 h按分组需要加入丙二醇进行处理，然后进行X射线照射10 Gy，细胞照射后立即更换新鲜的DMEM/F12完全培养基，并向培养基中按分组加入相应的外泌体(5×109颗粒/mL)，每孔2 mL。所有处理组继续培养0，24，48，72 h检测细胞增殖情况；培养48 h检测细胞凋亡、细胞周期以及P53、P21的mRNA及蛋白表达水平。
1.4.2  细胞培养和传代  HaCaT细胞培养于含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12完全培养液中，每两三天传代1次。DPSCs培养于含体积分数10%胎牛血清的α-MEM完全培养基中，待细胞生长至80%-90%融合度时传代，细胞置于37 ℃，体积分数5%CO2恒温培养箱中培养。
1.4.3  细胞感染  待传代至第6代的DPSCs融合度为60%-80%时，均匀加入感染复数为150的Ad.HGF，继续培养6-8 h，PBS清洗2遍，加入无血清α-MEM培养基继续培养48 h，收取细胞上清于50 mL离心管中，冻存于-80 ℃中待用。
1.4.4  DPSC-Exo提取  将冻存于-80 ℃冰箱的DPSCs、Ad.HGF-DPSCs的培养上清取出融化，分装于离心管中，于4 ℃，300×g低速离心30 min，去除死细胞，收集上清；将上一步收集的上清液于4 ℃，10 000×g离心30 min，进一步去除细胞碎片，收集上清液，在超净台内，用0.2 μm滤器过滤上清液除菌；过滤除菌后的上清液转移到贝克曼离心管中，在4 ℃，100 000×g 超速离心70 min后丢弃上清；用预冷PBS重悬离心管底部外泌体，并转移到新的超离管中，在4 ℃，100 000×g 条件下再次超速离心70 min 后丢弃上清；200 μL预冷的PBS反复吹洗离心管壁和管底，充分重悬后分装至EP管中，在-80 ℃保存。
1.4.5  DPSC-Exo鉴定
(1) Western印迹法检测DPSC-Exo中CD9、CD63、TSG101的表达：BCA法测定DPSC-Exo蛋白质浓度后，取10 μg样本，加入5×上样缓冲液(4∶1)后混匀，于100 ℃金属浴加热10 min，于电泳仪上电泳，待蛋白条带分离后转至PVDF膜，加入快速封闭液封闭30 min，之后剪切条带加入相应一抗(抗CD9 抗体，1∶1 000稀释；抗CD63抗体，1∶1 000稀释；抗TSG101抗体，1∶1 000稀释；抗β-actin抗体，1∶1 000稀释)，4 ℃摇床上孵育过夜，次日取出后TBST清洗，加入二抗(1∶5 000稀释)，室温孵育1 h，TBST清洗，在膜表面滴加发光液，曝光显影，根据蛋白条带显色对待测蛋白进行定性分析。
(2) NTA法分析DPSC-Exo粒径：将标准品用PBS稀释200 000倍，用5 mL注射器吸取标准品2.0-3.0 mL注入样品室中，校准；再用5 mL注射器吸取2.0-3.0 mL PBS注入样品室中，清洗2遍；将DPSC-Exo样品用PBS稀释5 000-20 000倍，用5 mL注射器吸取样品2.0-3.0 mL注入样品室中，检测样本颗粒数目和粒径大小分布。
1.4.6  HGF表达鉴定
(1) qRT-PCR检测HGF mRNA表达水平：收集DPSCs及Ad.HGF DPSCs，吸除上清，PBS清洗2遍，按照试剂盒说明书提取细胞总RNA，然后反转录成cDNA。将获得的cDNA作为模板，配制20 μL的cDNA qPCR 反应体系：0.2 μL cDNA，0.8 μL的上游引物和下游引物，10 μL Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix，无RNA酶水补至20 μL。在ABI Prism7500 Fast 仪器上设置如下反应程序：预变性95 ℃ 30 s，变性95 ℃ 5 s；退火、延伸各60 ℃ 30 s，40个循环，根据仪器设置熔解曲线程序。人磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)基因作为内参，目的基因表达水平用2-ΔΔCt值表示，引物序列见表1。

(2) Western印迹法检测HGF蛋白表达水平：收集DPSCs、DPSC-Exo、Ad.HGF DPSCs、Ad.HGF DPSC-Exo，PBS洗涤2次，每孔分别加入120 μL RIPA+1.2 μL蛋白酶抑制剂+1.2 μL磷酸酶抑制剂裂解细胞，在冰上放置30 min后12 000×g、4 ℃离心15 min，吸去上清，取样品10 μg，Western印迹法检测HGF表达，具体方法参照1.4.5(1)，抗HGF抗体，1∶1 000稀释；二抗1∶5 000稀释。
1.4.7   CCK-8检测HaCaT细胞增殖情况   据CCK-8试剂盒说明书，收集各组处理过的96孔板细胞，吸除培养基，然后每孔加入100 μL CCK-8反应液(配制体系为10 μL CCK-8试剂+90 μL DMEM/F12完全培养基)；置细胞培养箱内继续孵育2 h后，用酶标仪测450 nm处吸光度值，绘制各组细胞生长曲线。细胞增殖活力=实验组A450 nm-空白对照组A450 nm。
1.4.8   流式细胞术检测HaCaT细胞凋亡率   使用不含EDTA的胰酶消化收集6孔板各组细胞悬液于流式管中，4 ℃、400×g离心5 min；PBS清洗细胞2次，4 ℃、300×g离心5 min；每管加入结合缓冲液100 μL+PE-Annexin-Ⅴ 5 μL+7-AAD 5 μL，室温避光孵育15 min，每管补充结合缓冲液400 μL，使用流式细胞仪检测细胞凋亡率。
1.4.9   流式细胞术检测HaCaT细胞周期   胰酶消化收集6孔板各组细胞悬液于流式管中，4 ℃、400×g离心5 min；PBS清洗细胞2次，4 ℃、400×g离心5 min；每管加入1 mL预冷体积分数70%乙醇，轻轻吹打混匀，4 ℃固定过夜；4 ℃、1 700 r/min离心5 min去除上清；PBS清洗细胞2次，4 ℃、400×g离心5 min；配制碘化丙啶染色液[每管：500 μL染色缓冲液+25 μL碘化丙啶染色液(20X)+10 μL RNase(50X)]。每管加入配制好的碘化丙啶染色液500 μL，缓慢并充分重悬细胞沉淀，37 ℃避光温浴30 min，使用流式细胞仪检测细胞周期。
1.4.10  qRT-PCR检测细胞周期调控基因、炎症因子mRNA表达  收集各组处理过的6孔板细胞，吸除上清，PBS清洗2遍，按照试剂盒说明书提取细胞总RNA，然后反转录成cDNA。qRT-PCR法检测HaCaT细胞中白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、P53、P21 mRNA表达。引物序列见表1。具体方法参照1.4.6(1)，抗HGF抗体，1∶1 000稀释；二抗1∶5 000稀释。
1.4.11   细胞划痕实验   收集各组处理过的6孔板细胞，用无菌的10 μL一次性吸头在孔中央的单层细胞上划出一道划痕后，吸除上清，用PBS清洗2遍，加入适量新的培养基，分别于0，48 h在显微镜下观察、拍摄照片。
1.5   主要观察指标   ①各组HaCaT细胞增殖、迁移、凋亡情况；②各组HaCaT细胞 P53、P21 mRNA及蛋白表达；③各组HaCaT细胞炎症因子 mRNA的表达。
1.6   统计学分析   实验结果数据以x±s表示，使用GraphPad Prism 8进行统计学分析，多组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，两组间比较采用非配对t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已通过军事医学研究院生物统计学专家审核。

放射疗法是治疗恶性肿瘤的有效方法，放射线不仅可以杀伤肿瘤细胞，且对于受照范围内的正常组织和细胞同样具有杀伤作用[18]。皮肤作为身体的第一道屏障，在放疗过程中不可避免的会受到辐射损伤。目前关于放射性皮肤损伤治疗的临床研究中，许多治疗方法及药物的效果差异较大，仍没有一种达成共识的标准方法。因此，寻找出一种同时具有预防与治疗作用的新的放射性皮肤损伤的防治方法非常必要。
丙二醇作为医药、化妆品和食品中常用的添加剂，对人体毒性非常小[19-21]。YI等[7]研究发现照射前1 h给小鼠丙二醇预处理，可以抑制骨髓造血干细胞凋亡，促进骨髓干细胞增殖，有效促进照射后小鼠造血细胞恢复。研究发现通过腹腔注射丙二醇可以减轻小鼠肠道隐窝放射损伤[22]，提高放射后小鼠的存活率。此外，二醇类物质聚乙二醇也被发现对照射引起头颈部损伤有一定的防护作用[23]；经过聚乙二醇修饰的超氧化物歧化酶和过氧化氢酶能够通过调节Bax/P21等凋亡基因的表达水平，减轻放射诱导的肺纤维化[24]。课题组前期研究结果显示丙二醇预处理对放射诱导的HaCaT细胞损伤有较好的防护作用。在此基础上，该研究进一步观察丙二醇联合HGF修饰的DPSC-Exo对皮肤细胞放射损伤的防治效果。研究结果显示，照射前给予丙二醇处理，可以明显减轻受照表皮细胞HaCaT的损伤，而且与HGF.DPSC-Exo联合防护作用更明显。
许多研究已经证明，间充质干细胞可以保护和逆转辐射对于细胞的损伤。课题组之前的工作也揭示了DPSCs可以减轻放射诱导的肺损伤[25]。越来越多的研究者们认识到间充质干细胞对辐射损伤的治疗作用并不是依赖于间充质干细胞定植到受损组织，因为在静脉注射间充质干细胞后，受损区域仅发现少量的间充质干细胞，但是照射后该区域的损伤修复明显增加。SUN等[26]发现使用间充质干细胞培养上清可以加速辐射导致的大鼠皮肤创面愈合。WEN等[27]发现间充质干细胞外泌体可以挽救小鼠骨髓造血细胞的辐射损伤。此外，PIRYANI等[28]证明内皮细胞来源外泌体可减轻辐射诱导的造血损伤。因此，外泌体是间充质干细胞发挥效用的主要方式之一[29-30]，作为间充质干细胞的有效替代物治疗放射性皮肤损伤是可行的，而且与细胞相比，外泌体更易于保存、运输和应用，且不存在免疫排斥和肿瘤发生的风险[31-33]。
HGF是一种多功能细胞因子，在胚胎发生和器官发育中起着至关重要的作用[34]，研究表明HGF具有抗凋亡、抗炎和促进组织再生以及预防纤维化等功能[35-36]。CHEN等[37]通过气管内给予间充质干细胞外泌体处理，可以抑制博来霉素诱导的肺部炎症，改善肺纤维化；而当使用HGF sh-RNA降低间充质干细胞中HGF的表达水平后，其对于小鼠肺部炎症和纤维化的保护作用消失了。但是到目前为止，HGF修饰的DPSC-Exo对放射皮肤损伤的治疗作用还未见相关报道。
该实验首先用重组腺病毒Ad.HGF感染DPSCs，通过HGF表达分析，证明HGF基因修饰不但可以增加DPSCs中HGF的表达量，而且增加DPSC-Exo中HGF的表达量，说明可以通过HGF基因修饰DPSCs获得高表达HGF的DPSC-Exo，用于治疗放射性细胞损伤。
细胞周期阻滞、生长受抑、出现细胞凋亡等是细胞受到射线照射后普遍的现象[38]。该实验中HaCaT细胞在照射后也出现细胞周期阻滞在G2/M期、生长明显受到抑制、凋亡细胞明显增多、细胞的迁移能力下降等现象。3个处理组受照细胞的上述受损现象明显减轻，其中HGF.DPSC-Exo+丙二醇组效果最为明显，甚至细胞的迁移能力几乎恢复到未受照水平，促细胞迁移是HGF最明显的生物学作用之一[35]。许多研究表明，HGF基因修饰可以增强间充质干细胞对疾病的治疗效果[39-40]，包括放射性损伤[41-42]。USUNIER等[43]发现，当沉默HGF基因后，间充质干细胞对辐射致大鼠肠道纤维化的抑制作用明显消弱。此外，照射后细胞损伤还常常引起细胞炎性因子的分泌增加。CUI等[44]发现皮肤损伤小鼠尾静脉注射骨髓间充质干细胞后可以下调肿瘤坏死因子α的表达，促进损伤皮肤的再上皮化。该实验中受照细胞的肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素6表达明显升高，而经过丙二醇、Ad.HGF DPSC-Exo及二者联合处理后，细胞高表达的肿瘤坏死因子α和白细胞介素6基本恢复到正常水平。HGF.DPSC-Exo组细胞的白细胞介素1β表达较照射组细胞进一步增高，但却没有引起细胞的进一步损伤，其可能作用机制还需要进一步研究。HGF.DPSC-Exo组与丙二醇联合处理后，白细胞介素1β表达明显降低，恢复到未受照水平，可能是由于丙二醇处理抑制了白细胞介素1β的表达。
射线产生的自由基常造成细胞DNA等大分子损伤，诱导细胞周期调控蛋白发生改变，阻止细胞分裂，启动细胞损伤修复机制，如果修复好则恢复细胞周期和细胞分裂，如果修复不好则启动细胞凋亡[45]。细胞周期是指细胞从一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，分为间期与分裂期2个过程，照射会导致细胞发生G2/M期阻滞，抑制细胞分裂和增殖，甚至会导致一些细胞发生凋亡[46]。P21作为细胞周期进展G1和S期的抑制因子，是一种有效的周期蛋白依赖性激酶抑制剂，它通过结合并抑制周期激酶CDK2、CDK1和CDK4/6复合物的活性，介导细胞生长停滞和细胞衰老[47]。P21的表达受到肿瘤抑制蛋白P53的严格转录控制，而P53很容易在如紫外线、辐照以及H2O2等各种刺激下被激活。研究表明，间充质干细胞以及间充质干细胞来源外泌体可通过减轻放射诱导的损伤，而解除放射诱导的细胞周期阻滞[48-50]。该研究结果也显示，细胞受照射后，P53和P21表达上调，细胞周期阻滞于G2/M期，细胞凋亡明显增加。而在丙二醇、Ad.HGF DPSC-Exo以及二者联合处理之后，受照细胞内的P53和P21表达均显著下调，同时细胞周期阻滞缓解，细胞凋亡减少，其中又以联合处理组作用最为明显。这些结果都表明丙二醇、Ad.HGF DPSC-Exo以及联合处理能减轻细胞内的氧化应激和DNA损伤，不需要上调细胞P21和P53的表达，以阻滞细胞周期进行大分子损伤修复。
综上，此部分结果证明了丙二醇、Ad.HGF DPSC-Exo都能够有效保护放射诱导的HaCaT细胞损伤。丙二醇和Ad.HGF DPSC-Exo的辐射损伤保护作用表现出细胞周期抑制蛋白没有上调，细胞周期阻滞减轻，细胞凋亡减少，细胞增殖恢复，同时炎症因子分泌减少。同时，相较于二者单独作用，联合处理表现了更好的保护效果。丙二醇联合Ad.HGF DPSC-Exo辐射保护作用为放射性皮肤损伤的防治提供了一种新的思路和有效方法。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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文题释义：

放射性皮肤损伤：又称放射性皮炎，是由于电离辐射导致的皮肤黏膜炎症性损坏，分为急性放射性皮肤损伤和慢性放射性皮肤损伤。除放疗之外，其他各种形式的环境因素也会引起放射性皮肤损伤，如核事故、职业暴露以及核战争等。
间充质干细胞来源外泌体：是具有双层膜的囊泡结构，几乎存在于所有生物液体中，如血液、尿液及细胞培养上清。研究表明外泌体是间充质干细胞主要的有效旁分泌成分，其生物学作用类似于间充质干细胞，可以促进组织损伤修复和组织再生。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

本研究结果证明了丙二醇、携带人肝细胞生长因子的重组腺病毒感染人牙髓干细胞分泌的外泌体(Ad.HGF DPSC-Exo)都能够有效保护放射诱导的HaCaT细胞损伤。丙二醇和Ad.HGF DPSC-Exo的辐射损伤保护作用表现出细胞周期抑制蛋白没有上调，细胞周期阻滞减轻，细胞凋亡减少，细胞增殖恢复，同时炎症因子分泌减少。同时，相较于二者单独作用，联合处理表现了更好的保护效果。丙二醇联合Ad.HGF DPSC-Exo辐射保护作用为放射性皮肤损伤的防治提供了一种新的思路和有效方法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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