Wnt信号通路与自身免疫调节因子共同参与胚胎干细胞向胸腺上皮祖细胞的分化

doi:10.12307/2024.132

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (13): 1996-2001.doi: 10.12307/2024.132

• 胚胎干细胞 embryonic stem cells • 上一篇下一篇

Wnt信号通路与自身免疫调节因子共同参与胚胎干细胞向胸腺上皮祖细胞的分化

文廷浩1，李远迪1，何可可1，宋雯茜1，王先斌1，高杰1，2，苏敏1，3，胡蓉1，3

贵州医科大学，1基础医学院组织学与胚胎学教研室，2转化医学研究中心，3细胞工程生物医药技术国家地方联合工程实验室，贵州省再生医学重点实验室，中国医学科学院成体干细胞转化研究重点实验室，贵州省贵阳市 550025

收稿日期:2023-02-17 接受日期:2023-04-07 出版日期:2024-05-08 发布日期:2023-08-28
通讯作者: 胡蓉，博士，教授，贵州医科大学，基础医学院组织学与胚胎学教研室，细胞工程生物医药技术国家地方联合工程实验室，贵州省再生医学重点实验室，中国医学科学院成体干细胞转化研究重点实验室，贵州省贵阳市 550025
作者简介:文廷浩，男，1994年生，贵州省贵阳市人，汉族，2023年贵州医科大学毕业，硕士，主要从事干细胞基础与自身免疫病研究。
基金资助:
国家自然科学基金(82171343，82060151)，项目负责人：苏敏；贵州省科技计划项目(黔科合支撑[2020]4Y230号)，项目负责人：苏敏；贵州省科技计划项目(黔科合平台人才[2020]4103号)，项目负责人：苏敏；贵州省研究生科研基金(黔教合YJSKYJJ[2021]150)，项目负责人：王先斌

Wnt signaling pathway is involved in differentiation of embryonic stem cells into thymic epithelial progenitor cells together with autoimmune regulators

Wen Tinghao1, Li Yuandi1, He Keke1, Song Wenqian1, Wang Xianbin1, Gao Jie1, 2, Su Min1, 3, Hu Rong1, 3

1Department of Histology and Embryology, Basic Medical College, Guizhou Medical University, Guiyang 550025, Guizhou Province, China; 2Translational Medicine Research Center, Guizhou Medical University, Guiyang 550025, Guizhou Province, China; 3National Joint Local Engineering Laboratory for Cell Engineering and Biomedicine Technique, Guizhou Province Key Laboratory of Regenerative Medicine, Key Laboratory of Adult Stem Cell Translational Research (Chinese Academy of Medical Sciences), Guizhou Medical University, Guiyang 550025, Guizhou Province, China

Received:2023-02-17 Accepted:2023-04-07 Online:2024-05-08 Published:2023-08-28
Contact: Hu Rong, MD, Professor, Department of Histology and Embryology, Basic Medical College, Guizhou Medical University, Guiyang 550025, Guizhou Province, China; National Joint Local Engineering Laboratory for Cell Engineering and Biomedicine Technique, Guizhou Province Key Laboratory of Regenerative Medicine, Key Laboratory of Adult Stem Cell Translational Research (Chinese Academy of Medical Sciences), Guizhou Medical University, Guiyang 550025, Guizhou Province, China
About author:Wen Tinghao, Master, Department of Histology and Embryology, Basic Medical College, Guizhou Medical University, Guiyang 550025, Guizhou Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 82171343 (to SM); National Natural Science Foundation of China, No. 82060151 (to SM); Guizhou Provincial Science and Technology Plan Project, No. [2020]4Y230 (to SM); Guizhou Provincial Science and Technology Plan Project, No. [2020]4103 (to SM); Guizhou Provincial Graduate Research Fund, No. YJSKYJJ[2021]150 (to WXB)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

自身免疫调节因子(Aire)：首次在自身免疫性多内分泌疾病-念珠菌-外胚层营养不良综合征(APECED)中发现，研究证实，Aire基因在免疫耐受中发挥着至关重要的作用，其在胸腺上皮细胞中大量表达。
胸腺上皮祖细胞：是胸腺上皮细胞的前体细胞，可在体外由胚胎干细胞定向诱导分化而来，该实验方法也将为相关实验研究提供细胞来源。

背景：自身免疫调节因子(autoimmune regulator gene，Aire)及Wnt信号通路在小鼠胚胎干细胞多能性的维持及分化中都发挥着重要作用，但Wnt信号与Aire是否参与了小鼠胚胎干细胞向胸腺上皮祖细胞的分化尚未可知。

目的：探讨Wnt信号通路和自身免疫调节因子与胚胎干细胞分化的关系。
方法：采用两步分化方法定向诱导小鼠胚胎干细胞分化为内胚层再分化为胸腺上皮祖细胞，然后用Aire shRNA慢病毒感染小鼠胚胎干细胞，嘌呤霉素筛选单克隆稳定株，再采用两步分化方法进行诱导分化，分别于定向诱导分化第0，3，10天，采用细胞免疫荧光、流式细胞术、Western blot、Real-Time qPCR检测相关基因及蛋白的表达变化。

结果与结论：①定向诱导分化第0天，免疫荧光染色显示SSEA1、OCT4表达呈阳性；②定向诱导分化第3天，免疫荧光染色显示SOX17、FOXA2表达呈双阳性；③定向诱导分化第10天，流式细胞术结果显示EPCAM1、K5、K8表达呈阳性；④与未分化的小鼠胚胎干细胞相比，诱导分化的胸腺上皮祖细胞中Wnt7a、β-catenin、Gsk-3β蛋白表达升高，Aire蛋白表达降低；⑤与未分化的小鼠胚胎干细胞相比，诱导分化的胸腺上皮祖细胞中Wnt7a、β-catenin、Gsk-3β及Aire mRNA表达升高；⑥与正常培养的小鼠胚胎干细胞及其最终分化的胸腺上皮祖细胞相比，敲低Aire基因的小鼠胚胎干细胞及其最终分化的胸腺上皮祖细胞中Wnt7a、β-catenin、Gsk-3β蛋白表达水平降低。综上所述，Wnt信号通路和Aire共同参与了小鼠胚胎干细胞定向诱导分化为小鼠胸腺上皮祖细胞的过程。

https://orcid.org/0000-0001-5253-3085 (胡蓉)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: Wnt信号通路, 自身免疫调节因子, 胚胎干细胞, 胸腺上皮祖细胞, 内胚层细胞

Abstract: BACKGROUND: Autoimmune regulator gene (Aire) and Wnt signaling pathway play an important role in the maintenance and differentiation of mouse embryonic stem cell pluripotency. However, whether the Wnt signal and Aire are involved in the differentiation of embryonic stem cells to thymic epithelial progenitor cells remains poorly understood.
OBJECTIVE: To investigate the relationship of the Wnt signaling pathway and Aire with the differentiation of embryonic stem cells.
METHODS: A two-step differentiation method was used to induce mouse embryonic stem cells to differentiate into endoderm and then into thymic epithelial progenitor cells. Mouse embryonic stem cells were infected with Aire shRNA lentivirus, and monoclonal stable strains were screened by puromycin. Mouse embryonic stem cells were collected on days 0, 3 and 10 of the directed induction of differentiation after the induced differentiation by the two-step differentiation method. Cellular immunofluorescence, flow cytometry, western blot assay, and real-time qPCR were used to detect the expression changes of related genes and proteins.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Immunofluorescence staining showed positive expression of SSEA1 and OCT4 on day 0 of targeted induction of differentiation. (2) Immunofluorescence staining showed double-positive expression of SOX17 and FOXA2 on day 3 of targeted induction of differentiation. (3) Flow cytometry results showed positive expression of EPCAM1, K5 and K8 on day 10 of targeted induction of differentiation. (4) Compared with undifferentiated mouse embryonic stem cells, the expressions of Wnt7a, β-catenin, and Gsk-3β proteins were elevated, and the expression level of Aire protein was decreased in induced differentiated thymic epithelial progenitor cells. (5) Compared with undifferentiated mouse embryonic stem cells, the expressions of Wnt7a, β-catenin, Gsk-3β and Aire mRNA were elevated in thymic epithelial progenitor cells. (6) Compared with normal cultured mouse embryonic stem cells and their ultimately differentiated thymic epithelial progenitor cells, the expression levels of Wnt7a, β-catenin and Gsk-3β proteins were reduced in mouse embryonic stem cells with knockdown of Aire genes and their final differentiated thymic epithelial progenitor cells. In conclusion, the Wnt signaling pathway and Aire are jointly involved in the process of targeted induction of differentiation of mouse embryonic stem cells into mouse thymic epithelial progenitor cells.

Key words: Wnt signaling pathway, autoimmune regulator, embryonic stem cell, thymic epithelial progenitor cell, endoderm cell

中图分类号:

文廷浩, 李远迪, 何可可, 宋雯茜, 王先斌, 高杰, 苏敏, 胡蓉. Wnt信号通路与自身免疫调节因子共同参与胚胎干细胞向胸腺上皮祖细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(13): 1996-2001.

Wen Tinghao, Li Yuandi, He Keke, Song Wenqian, Wang Xianbin, Gao Jie, Su Min, Hu Rong. Wnt signaling pathway is involved in differentiation of embryonic stem cells into thymic epithelial progenitor cells together with autoimmune regulators[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(13): 1996-2001.

图/表（结果） 6

2.1 胚胎干细胞的鉴定结果光学显微镜下观察C57BL/6来源小鼠胚胎干细胞贴壁生长，细胞克隆型生长，呈球形，大小不一，边界清晰，见图1A。细胞免疫荧光结果显示，激光共聚焦显微镜观察到SSEA1(红色)表达于细胞膜上，OCT4(绿色)表达在细胞质中，见图1B-E。

2.2 内胚层细胞的鉴定结果定向诱导分化第3天，光学显微镜下观察可见细胞突破原有界限，像四周扩散生长，体积变大，诱导分化为内胚层，见图2A。细胞免疫荧光结果显示，激光共聚焦显微镜观察内胚层标志物FOXA2(红色)和SOX17(绿色)共表达于细胞质中，证明将小鼠胚胎干细胞诱导分化为内胚层细胞，见图2B-E。

2.3 胸腺上皮祖细胞的鉴定结果定向诱导分化第10天，内胚层细胞彼此相互连接，并向四周继续生长，形成片状，见图3A。流式细胞术检测结果显示，EPCAM1阳性细胞的比例为30.1%，在EPCAM1阳性细胞中K5+K8+双阳性比例高达92%，见图3B。

2.4 小鼠胚胎干细胞分化过程中Wnt7a、β-catenin、Gsk-3β、Aire蛋白表达变化收集定向诱导分化第0，3，10天的细胞进行检测，与小鼠胚胎干细胞相比，定向诱导分化后的胸腺上皮祖细胞中Wnt7a、β-catenin、Gsk-3β蛋白表达水平呈上升趋势，Aire蛋白表达呈下降趋势。与小鼠胚胎干细胞相比，定向诱导分化后的内胚层细胞中Wnt7a、β-catenin、Gsk-3β蛋白表达水平呈上升趋势，Aire蛋白表达呈下降趋势，见图4。

2.5 小鼠胚胎干细胞分化过程中Wnt7a、β-catenin、Gsk-3β、Aire mRNA表达变化与小鼠胚胎干细胞相比，定向诱导分化后内胚层细胞和胸腺上皮祖细胞中的Wnt7a、β-catenin、Gsk-3β及Aire mRNA表达水平均呈上升趋势，见图5。

2.6 Aire shRNA小鼠胚胎干细胞分化过程中Wnt7a、β-catenin、Gsk-3β及Aire蛋白表达变化与正常胚胎干细胞相比，Aire shRNA小鼠胚胎干细胞与Aire shRNA胸腺上皮祖细胞中Wnt7a、β-catenin、Gsk-3β及Aire蛋白的表达都降低，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图6。

参考文献

[1] HUR YH, FENG S, WILSON KF, et al. Embryonic Stem Cell-Derived Extracellular Vesicles Maintain ESC Stemness by Activating FAK. Dev Cell. 2021;56(3):277-291.e6.
[2] KALTSCHMIDT C, GREINER JFW, KALTSCHMIDT B. The Transcription Factor NF-κB in Stem Cells and Development. Cells. 2021;10(8):2042.
[3] NAGAMINE K, PETERSON P, SCOTT HS, et al. Positional cloning of the APECED gene. Nat Genet. 1997;17(4):393-398.
[4] HUBERT FX, KINKEL SA, CREWTHER PE, et al. Aire-deficient C57BL/6 mice mimicking the common human 13-base pair deletion mutation present with only a mild autoimmune phenotype. J Immunol. 2009; 182(6):3902-3918.
[5] NISHIKAWA Y, HIROTA F, YANO M, et al. Biphasic Aire expression in early embryos and in medullary thymic epithelial cells before end-stage terminal differentiation. J Exp Med. 2010;207(5):963-971.
[6] LAAN M, PETERSON P. The many faces of aire in central tolerance. Front Immunol. 2013;4:326.
[7] ABRAMSON J, GIRAUD M, BENOIST C, et al. Aire’s partners in the molecular control of immunological tolerance. Cell. 2010;140(1): 123-135.
[8] FIERABRACCI A. Recent insights into the role and molecular mechanisms of the autoimmune regulator (AIRE) gene in autoimmunity. Autoimmun Rev. 2011;10(3):137-143.
[9] ŽUMER K, PLEMENITAŠ A, SAKSELA K, et al. Patient mutation in AIRE disrupts P-TEFb binding and target gene transcription. Nucleic Acids Res. 2011;39(18):7908-7919.
[10] ANDERSON MS, VENANZI ES, CHEN Z, et al. The cellular mechanism of Aire control of T cell tolerance. Immunity. 2005;23(2):227-239.
[11] DANSO-ABEAM D, HUMBLET-BARON S, DOOLEY J, et al. Models of aire-dependent gene regulation for thymic negative selection. Front Immunol. 2011;2:14.
[12] LI D, ZHAO B, LUO Y, et al. Transplantation of Aire-overexpressing bone marrow-derived dendritic cells delays the onset of type 1 diabetes. Int Immunopharmacol. 2017;49:13-20.
[13] SIDRAT T, REHMAN ZU, JOO MD, et al. Wnt/β-catenin Pathway-Mediated PPARδ Expression during Embryonic Development Differentiation and Disease. Int J Mol Sci. 2021;22(4):1854.
[14] LIANG W, HAN P, KIM EH, et al. Canonical Wnt signaling promotes pacemaker cell specification of cardiac mesodermal cells derived from mouse and human embryonic stem cells. Stem Cells. 2020;38(3): 352-368.
[15] DENG Y, LAO Y, RUAN Q, et al. Activation of Wnt/β-Catenin Signaling Pathway Enhances the Derivation of Buffalo (Bubalus bubalis) Embryonic Stem Cell-Like Cells. Cell Reprogram. 2020;22(4):217-225.
[16] NAITO AT, SHIOJIMA I, AKAZAWA H, et al. Developmental stage-specific biphasic roles of Wnt/beta-catenin signaling in cardiomyogenesis and hematopoiesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006;103(52):19812-19817.
[17] UENO S, WEIDINGER G, OSUGI T, et al. Biphasic role for Wnt/beta-catenin signaling in cardiac specification in zebrafish and embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104(23):9685-9690.
[18] GORDON J, WILSON VA, BLAIR NF, et al. Functional evidence for a single endodermal origin for the thymic epithelium. Nat Immunol. 2004; 5(5):546-553.
[19] SU M, HU R, JIN J, et al. Efficient in vitro generation of functional thymic epithelial progenitors from human embryonic stem cells. Sci Rep. 2015;5:9882.
[20] SU M, SONG Y, HE Z, et al. Administration of embryonic stem cell-derived thymic epithelial progenitors expressing MOG induces antigen-specific tolerance and ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis. J Autoimmun. 2015;58:36-47.
[21] GILL J, MALIN M, HOLLÄNDER GA, et al. Generation of a complete thymic microenvironment by MTS24(+) thymic epithelial cells. Nat Immunol. 2002;3(7):635-642.
[22] BENNETT AR, FARLEY A, BLAIR NF, et al. Identification and characterization of thymic epithelial progenitor cells. Immunity. 2002; 16(6):803-814.
[23] ROSSI SW, JENKINSON WE, ANDERSON G, et al. Clonal analysis reveals a common progenitor for thymic cortical and medullary epithelium. Nature. 2006;441(7096):988-991.
[24] LAI L, JIN J. Generation of thymic epithelial cell progenitors by mouse embryonic stem cells. Stem Cells. 2009;27(12):3012-3020.
[25] KIKUCHI A, YAMAMOTO H, SATO A. Selective activation mechanisms of Wnt signaling pathways. Trends Cell Biol. 2009;19(3):119-129.
[26] ANGERS S, MOON RT. Proximal events in Wnt signal transduction. Nat Rev Mol Cell Biol. 2009;10(7):468-477.
[27] PAIGE SL, OSUGI T, AFANASIEV OK, et al. Endogenous Wnt/beta-catenin signaling is required for cardiac differentiation in human embryonic stem cells. PLoS One. 2010;5(6):e11134.
[28] SLAWNY NA, O’SHEA KS. Dynamic changes in Wnt signaling are required for neuronal differentiation of mouse embryonic stem cells. Mol Cell Neurosci. 2011;48(3):205-216.
[29] DZOBO K, VOGELSANG M, PARKER MI. Wnt/β-Catenin and MEK-ERK Signaling are Required for Fibroblast-Derived Extracellular Matrix-Mediated Endoderm Differentiation of Embryonic Stem Cells. Stem Cell Rev Rep. 2015;11(5):761-773.
[30] LEE H, HALLER C, MANNEVILLE C, et al. Identification of Small Molecules Which Induce Skeletal Muscle Differentiation in Embryonic Stem Cells via Activation of the Wnt and Inhibition of Smad2/3 and Sonic Hedgehog Pathways. Stem Cells. 2016;34(2):299-310.
[31] WANG Q, SONG JW, LIU Y, et al. Involvement of Wnt pathway in ethanol-induced inhibition of mouse embryonic stem cell differentiation. Alcohol. 2017;58:13-18.
[32] 李远迪,马静怡,余佳珊.Wnt7a/β-连环蛋白/自身免疫调节因子信号通路参与1型糖尿病的发生[J].解剖学报,2022,53(4):453-460.
[33] GU B, ZHANG J, CHEN Q, et al. Aire regulates the expression of differentiation-associated genes and self-renewal of embryonic stem cells. Biochem Biophys Res Commun. 2010;394(2):418-423.
[34] KAWANO H, NISHIJIMA H, MORIMOTO J, et al. Aire Expression Is Inherent to Most Medullary Thymic Epithelial Cells during Their Differentiation Program. J Immunol. 2015;195(11):5149-5158.
[35] NISHIJIMA H, KAJIMOTO T, MATSUOKA Y, et al. Paradoxical development of polymyositis-like autoimmunity through augmented expression of autoimmune regulator (AIRE). J Autoimmun. 2018;86:75-92.
[36] SPECK-HERNANDEZ CA, ASSIS AF, FELICIO RF, et al. Aire Disruption Influences the Medullary Thymic Epithelial Cell Transcriptome and Interaction With Thymocytes. Front Immunol. 2018;9:964.

引言

胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)是指从囊胚期的内细胞团中分离出来的，能在体外培养、具有发育全能性的干细胞。在体内外环境的诱导下，其可分化为机体几乎所有组织的细胞。研究表明，各种转录因子维持和参与了胚胎干细胞的多能性，促进其向3个胚层组织细胞的分化，广泛应用于生命科学的各个领域[1-2]。自身免疫调节因子(autoimmune regulator gene，Aire)于1997年在自身免疫性多内分泌疾病-念珠菌-外胚层营养不良综合征中首次被发现[3]，参与胸腺内特异性组织抗原的表达，参与调控自身免疫病的发生。研究表明，Aire不仅在胸腺上皮细胞中表达[4]，而且在胚胎干细胞及诱导多能干细胞中都有表达[5]。Aire在转录水平上调控组织特异性抗原的表达[6-7]，参与自身免疫调节[8]。此外，发育理论认为Aire是髓质胸腺上皮细胞成熟的一个分化因子[9]，当胸腺上皮祖细胞分化为胸腺上皮细胞时，Aire的表达逐渐增加，胸腺中组织特异性抗原的表达数量也逐渐增加，而Aire基因缺失将导致组织特异性抗原表达减少[10]。对Aire-/-小鼠的研究显示，其髓质胸腺上皮细胞的成熟有缺陷，也导致组织特异性抗原的基因表达受损[11]。因此，调控组织特异性抗原表达的Aire基因可能与自身免疫的发展密切相关。研究表明，Aire基因的突变和缺失可以引起自身免疫性多腺体综合征Ⅰ型，同时有涉及多个腺体的临床特征，如甲状腺疾病、1型糖尿病等[8，12]。
Wnt信号通路在胚胎早期发育中起着至关重要的作用，其可以维持胚胎干细胞的自我更新能力和保持多能状态[13]。研究表明，经典的Wnt/β-catenin信号在组织分化中起着双相作用[14]：在胚胎体形成的早期阶段，Wnt通路激活促进了胚胎干细胞向心肌细胞的分化，同时抑制了向造血和血管细胞系的分化；相反，胚胎体形成的晚期阶段，Wnt通路激活则抑制了胚胎干细胞向心肌细胞的分化[15-17]。研究表明，使用抑制剂激活Wnt/β-catenin信号通路可以促进胚胎干细胞的集落形成和增殖，并保持其未分化状态，并上调多能相关基因和增殖相关基因的表达水平[18]。综上，Aire及Wnt信号通路在小鼠胚胎干细胞多能性的维持及分化中都发挥着重要作用，且Aire在自身免疫病的发病机制中也扮演着重要的角色，但关于Wnt信号与Aire是否参与了小鼠胚胎干细胞向胸腺上皮祖细胞的分化尚未可知，探讨三者之间可能存在的关系，以期为干细胞治疗自身免疫性疾病提供实验依据和理论支撑。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学体外实验。
1.2 时间及地点实验于2021年6月至2022年12月在贵州医科大学组织学与胚胎学实验室完成。
1.3 材料 C57BL/6小鼠胚胎干细胞来源于中国科学院干细胞库(编号：SCSP-218)；ESGRO Complete Plus Serum-free 培养基(Millipro公司)；DMEM(Gibco公司)；BSA(Sigma公司)；activin A、Noggin、成纤维细胞生长因子7、成纤维细胞生长因子10、骨形成蛋白4、表皮生长因子(Peprotech公司)；兔抗OCT4、小鼠抗SSEA1、小鼠抗FOXA2 、兔抗SOX17(Genetex公司)；Alexa Fluor 488标记抗兔IgG、Alexa Fluor 488标记抗羊IgG、Alexa Fluor 647标记抗兔IgG、Alexa Fluor 647标记抗大鼠IgG(Abcam公司)；PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD326(EpCAM)(Biolegend公司)；小鼠抗K5和羊抗K8(Genetex公司)；抗小鼠IgG-PE和抗羊IgG-APC(Abcam公司)；TAKARA(RR820A)试剂盒；Wnt7a、β-catenin、Gsk-3β、Aire、GAPDH引物由上海生工生物工程有限公司合成。
1.4 实验方法
1.4.1 胚胎干细胞的培养及诱导分化为胸腺上皮祖细胞将C57BL/6来源的小鼠胚胎干细胞接种于预先铺过0.1%明胶的6孔板中，每孔1×105细胞，用ESGRO培养基进行培养，培养2 d长出细胞克隆后进行分化，使用新配置的分化培养基[在含体积分数为15%胎牛血清的DMEM培养基中添加细胞因子activin(50 μg/mL)、Noggin(20 μg/mL)]，培养2 d后诱导分化为内胚层，更换细胞因子为表皮生长因子(50 ng/mL)、成纤维细胞生长因子7 (20 ng/mL)、成纤维细胞生长因子10(20 ng/mL)、骨形成蛋白4(20 ng/mL)，继续培养10 d[19-20]。
1.4.2 免疫荧光染色检测小鼠胚胎干细胞中SSEA1及OCT4的表达小鼠胚胎干细胞常规培养第2天后，置于光学显微镜下观察其细胞形态及大小，然后进行40 g/L多聚甲醛固定、0.2% TritonX-100破膜、山羊血清封闭处理后，滴加鼠抗SSEA1(1∶200)和兔抗OCT4(1∶200)，4 ℃孵育过夜，加入相应二抗山羊抗小鼠IgM-647(1∶500)和山羊抗兔IgG-FITC (1∶500)，37 ℃避光孵育2 h，DAPI染细胞核，激光共聚焦显微镜观察。
1.4.3 免疫荧光染色检测内胚层细胞中FOXA2及SOX17的表达细胞诱导分化第3天，光学显微镜下观察细胞形态及大小，然后进行40 g/L多聚甲醛固定、0.2% TritonX-100破膜、山羊血清封闭处理后，滴加兔抗SOX17(1∶200)和鼠抗FOXA2(1∶200)，4 ℃孵育过夜，加入相应二抗山羊抗小鼠IgM-647(1∶500)和山羊抗兔IgG-FITC(1∶500)，37 ℃避光孵育2 h，DAPI染细胞核，激光共聚焦显微镜观察。
1.4.4 流式细胞术检测胸腺上皮祖细胞中EPCAM、K5、K8的表达细胞诱导分化第10天，光学显微镜下观察细胞形态及大小，胰酶消化细胞，PBS清洗，加入PerCP/Cy5.5anti-mouse(CD326)EpCAM(1∶50)，4 ℃避光孵育45 min，PBS洗2次，40 g/L多聚甲醛4 ℃固定20 min，0.2% TritonX-100破膜，4 ℃孵育30 min，加入小鼠抗K5(1∶100)和羊抗K8(1∶100)，4 ℃避光孵育45 min，PBS洗2次，加入抗小鼠IgG-PE(1∶200)和抗羊IgG-APC(1∶200)避光4 ℃孵育45 min，PBS洗3次，重悬细胞，流式细胞仪上机检测，Flowjo细胞分析软件分析细胞数量及百分比。
1.4.5 Western blot检测细胞分化过程中Wnt7a、β-catenin、Gsk-3β、Aire蛋白表达变化细胞诱导分化第0，3，10天，RIPA裂解细胞提取总蛋白，BCA法定量，根据浓度制备25 μL样品体系，进行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，分别加入Wnt7a、β-catenin、Gsk-3β和Aire一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，次日TBST洗后加入HRP标记的二抗(1∶3 000)，室温孵育2 h，用β-actin作为内参蛋白，使用化学发光底物于凝胶成像系统显影扫描检测蛋白表达，用Image J软件进行图像分析。
1.4.6 Real-time PCR检测Wnt7a、β-catenin、Gsk-3β、Aire mRNA表达变化细胞诱导分化第0，3，10天，Trizol法提取细胞总RNA，分光光度计测定后进行反转录，所用引物在Genbank查询序列，由上海生工生物工程(上海)有限公司合成，Wnt7a上游引物：5’-CGA GAG CYA GGC TAC GTG CT-3’，下游引物：5’-CTG AGG GGC TGT CTT ATT GC-3’；β-catenin上游引物：5’-GGC AAC CCT GAG GAA GAA GA-3’，下游引物：5’-AGG CGT CAA ACT GCG TGG AT-3’；Gsk-3β 上游引物：5’-CCA CCA TCC TTA TCC CTC CA-3’，下游引物：5’-AGG CGT CAA ACT GCG TGG AT-3’；Aire上游引物：5’-AGG TCA GCT TCA GAG AAA ACC A-3’，下游引物：5’-TCA TTC CCA GCA CTC AGT AGA-3’；GAPDH 上游引物：5’-TGT TTC CTC GTC CCG TAG-3’，下游引物：5’-CAA TCT CCA CTT TGC CAC T-3’，按照TAKARA(RR820A)试剂盒说明书，在StepOnePlus PCR仪上进行扩增。最后根据公式 2-ΔΔCt 计算目标基因相对表达量。
1.4.7 Aire shRNA胚胎干细胞稳定细胞株建立 C57BL/6来源的小鼠胚胎干细胞用2×107 TU/mL Aire shRNA慢病毒(重庆博艾麦迪森生物科技有限公司)进行转染，并用0.5 μg/mL嘌呤霉素(Solarbio)进行筛选，筛选后按1.4.1方法进行培养，分化。
1.5 主要观察指标 ①小鼠胚胎干细胞中SSEA1及OCT4的表达；②内胚层细胞中FOXA2及SOX17的表达；③胸腺上皮祖细胞中EPCAM、K5、K8的表达；④细胞分化过程中Wnt7a、β-catenin、Gsk-3β、Aire蛋白表达；⑤细胞分化过程中Wnt7a、β-catenin、Gsk-3β、Aire mRNA表达。
1.6 统计学分析采用SPSS 22.0统计学软件进行分析，数据以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析及t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。所有实验均已重复至少3次及以上，文章统计学方法已经胡蓉教授审核。

讨论

小鼠胚胎胸腺器官发育的研究表明，皮质上皮细胞和髓质上皮细胞都来自同一个祖细胞群[21]，一些研究团队已经在胚胎胸腺中发现了胸腺上皮祖细胞，并表明它们可以在体内重建能够支持T细胞发育的功能性胸腺微环境[22-23]。LAI等[24]的研究表明，在体外成功将小鼠胚胎干细胞定向诱导分化为胸腺上皮祖细胞，其在体内可以形成正常的胸腺结构，并发育成各种类型的胸腺上皮细胞。该实验中，OCT4、SSEA1作为小鼠胚胎干细胞的鉴定指标，通过免疫荧光染色均呈阳性；小鼠胚胎干细胞定向诱导分化第3天，通过免疫荧光染色检测SOX17、FOXA2蛋白在胞质内高表达；继续定向诱导分化10 d，流式细胞术检测EPCAM1单阳性细胞比例为30.1%，K5、K8双阳性细胞比例高达92%，说明定向诱导分化的细胞有一部分已经分化为胸腺上皮祖细胞。以上结果表明，已经成功将小鼠胚胎干细胞诱导分化为胸腺上皮祖细胞，为细胞治疗提供了实验依据。
Wnt信号通路是一个含有18种分泌型糖蛋白的大家族，其根据信号转导的方式可分为经典Wnt信号途径和非经典Wnt信号途径[25]。目前研究较多的是由β-catenin介导的Wnt/β-catenin经典信号通路，该通路在物种的进化及胚胎的发育过程中起着重要作用[26]。PAIGE等[27]发现内源性Wnt/β-catenin信号通路是人胚胎干细胞心脏分化的重要调节因子。SLAWNY等[28]证明Wnt信号连续变化是小鼠胚胎干细胞向神经元分化所必需的。Wnt/β-catenin信号也与胚胎干细胞的成骨、骨骼肌和内胚层分化有关[29-30]。WANG等[31]研究中发现乙醇可抑制小鼠胚胎干细胞生长，延缓心脏分化，主要是通过抑制Wnt信号通路来抑制小鼠胚胎干细胞分化。根据以上研究报道，作者猜想在小鼠胚胎干细胞向胸腺上皮祖细胞分化过程中，Wnt信号可能也参与其中。实验分别从蛋白水平和mRNA水平检测了小鼠胚胎干细胞定向诱导分化为胸腺上皮祖细胞过程中Wnt7a、β-catenin、Gsk-3β的表达变化，结果显示其蛋白表达和mRNA表达都呈上升趋势，提示Wnt信号通路可能参与了小鼠胚胎干细胞向胸腺上皮祖细胞分化的过程，但其具体的调控机制尚未明确。
Aire作为一种非经典的转录因子，主要在胸腺中表达，尤其在髓质胸腺上皮中高表达[32]。GU等[33-34]研究表明，其在胚胎干细胞多能性及自我更新能力维持中也起着十分重要的作用。另一方面，研究发现，Wnt受体在胸腺上皮细胞中表达，Wnt信号通路通过调控Foxn1的表达参与胸腺上皮细胞的发育[35]。实验研究发现，在小鼠胚胎干细胞定向诱导分化过程中Aire蛋白表达水平逐渐降低，可能是因为Aire蛋白主要在成熟的胸腺上皮细胞中表达，这与实验结果中定向诱导分化来的胸腺上皮祖细胞几乎不表达Aire的结果一致[36]。敲低小鼠胚胎干细胞中Aire的表达后，Wnt7a、β-catenin和Gsk-3β表达均降低，与正常小鼠胚胎干细胞分化的胸腺上皮祖细胞相比，敲低Aire的小鼠胚胎干细胞定向分化为胸腺上皮祖细胞后，Wnt7a、β-catenin和Gsk-3β表达也都降低。小鼠胚胎干细胞中Aire下调影响了Wnt7a/β-catenin/Gsk-3β信号通路，使小鼠胚胎干细胞向胸腺上皮祖细胞分化效能降低。
胸腺上皮祖细胞是胸腺上皮细胞的前体细胞，而胸腺上皮祖细胞又是由小鼠胚胎干细胞定向诱导分化而来，胸腺上皮细胞是胸腺微环境的主要构成成分，在支持胸腺内T细胞正常发育中发挥着重要作用。该实验研究发现，Wnt信号通路和Aire都参与了小鼠胚胎干细胞向胸腺上皮祖细胞的分化过程，但Wnt信号通路及Aire之间具体的调控作用以及作用机制仍需进一步研究。通过探讨Aire与Wnt信号通路在小鼠胚胎干细胞向胸腺上皮祖细胞分化过程中的变化，以期为干细胞移植治疗自身免疫性疾病提供相关实验依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Wnt信号通路与自身免疫调节因子共同参与胚胎干细胞向胸腺上皮祖细胞的分化

Wnt signaling pathway is involved in differentiation of embryonic stem cells into thymic epithelial progenitor cells together with autoimmune regulators

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 6

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	郑晓晗, 冯晓丽, 胡兰, 高仕君, 魏艳召, 黄婷, 孙圣童, 魏绪芳, 王埮, 赵振强. 巨噬细胞迁移抑制因子促进人胚胎干细胞分化为腹侧中脑多巴胺能神经祖细胞[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(33): 5348-5356.
[2]	郑晓晗, 魏艳召, 黄婷, 魏绪芳, 孙圣童, 王埮, 赵振强. 巨噬细胞迁移抑制因子对干细胞的作用[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(15): 2395-2403.
[3]	魏艳召, 郑晓晗, 高仕君, 黄婷, 魏续芳, 陈薪旭, 赵振强. 人胚胎干细胞自分泌巨噬细胞迁移抑制因子及受体表达[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(1): 34-41.
[4]	刘峰, 彭宇环, 罗良平, 吴本清. 植物源性碱性成纤维细胞生长因子维持人胚胎干细胞的生长与分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1032-1037.
[5]	熊挺淋, 应梦慧, 张丽莎, 张晓刚, 杨燕. 诱导多能干细胞分化的心肌细胞电生理特点[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1063-1067.
[6]	曾睿, 海冰. 尼古丁对干细胞的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(25): 4070-4075.
[7]	刘小刚, 李甜, 张舵. 软骨组织工程中种子细胞选择的研究热点[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(31): 5059-5064.
[8]	韦云剑, 张风波, 龙平, 江欣星, 马燕琳, 孙菲, 李崎. 比较人不同细胞来源诱导多能干细胞与胚胎干细胞拟胚体的分化培养过程[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 4019-4024.
[9]	张晓波, 张杰, 孙钰. 未来软骨修复的热点方向：层粘连蛋白促进干细胞增殖[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(1): 141-145.
[10]	伟人悦, 厉雪纯, 李妍, 于扬, 张宇, 刘忠华. 无血清单层细胞诱导法培养猪诱导多能性干细胞定向分化为血管内皮细胞[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(31): 4971-4978.
[11]	马静怡, 杨文江, 李远迪, 黄佑娇, 高杰, 李红, 胡蓉, 苏敏. 自身免疫调节因子在小鼠胚胎干细胞向胸腺上皮祖细胞分化中的表达[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(25): 3994-3999.
[12]	刘卒, 韩燊, 李亚雄, 李昆林, 张雅永, 蒋立虹. 不同干细胞来源外泌体在心血管疾病治疗中的应用、作用及问题[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(19): 3063-3070.
[13]	蔡志斌, 王萍. 心脏组织工程中细胞和生物支架的研究热点[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(16): 2599-2605.
[14]	刘亭亭, 韩长旭, 王国强. 细胞移植修复椎间盘的新视角与新进展[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(1): 154-158.
[15]	孙莉, 纵艳艳, 魏建峰. 两种传代方法影响人胚胎干细胞转染效率的比较[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(1): 72-76.