1.1 设计 体外细胞学实验。数据之间比较采用单因素方差分析及配对t检验。
1.2 时间及地点 实验于2020年1月至2022年9月在宁夏医科大学附属口腔医院和宁夏回族自治区干细胞与再生医学重点实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验仪器 生物安全柜(Thermo Fisher,美国);超净工作台(Thermo Fisher,美国);二氧化碳培养箱(Thermo Fisher,美国);倒置荧光显微镜(OLYMPUS,日本);实时定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增仪器(Bio-rad,美国);流式细胞仪(BD Biosciences,美国);低温高速离心机(Thermo Fisher,美国);酶标仪(Thermo Fisher,美国);ImageQuantLAS4000数字成像系统(General Electric 公司);Western blot电泳仪(北京君意公司,中国);移液枪(Eppendorf,德国);培养板、培养皿、培养瓶等(Corning公司,美国)。
1.3.2 实验试剂 PBS(HyClone,美国);α-MEM培养基(HyClone,美国);胎 牛 血 清(BI公司,以色列);0.25%胰蛋白酶(HyClone,美国);青霉素+链霉素(HyClone,美国);Ⅰ型胶原酶、Ⅱ型Dispase酶、抗体(CD146、CD45、CD31、STRO-1) (eBioscience,美国);抗坏血酸、地塞米松、β-甘油磷酸钠、IBMX、吲哚美辛、胰岛素、茜素红、油红O、碱性磷酸酶试剂盒、核质分离试剂盒PARISTMKIT(Invitrogen,美国);二甲基亚砜、Trizol Reagent、反转录试剂盒PScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara,日本);荧光定量PCR试剂盒SYBRPremix Ex TaqTM(Takara,日本);RIPA裂解液、PMSF、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(博士德,中国);BCA蛋白浓度测定试剂盒(博士德,中国);SDS-PAGE电泳液(自配);WB转膜液(自配);PVDF膜(Merck millipore,美国);脱脂牛奶(伊利,中国);TBST缓冲液(自配);超敏ECL化学发光试剂盒(Merck millipore,美国);过表达空载体(LV-Lin28A-NC:滴度≥1×108 TU/mL,上海佐润);过表达Lin28A载体 (LV-Lin28A:
滴度≥1×108 TU/mL,上海佐润);干扰表达空载体 (SH-Lin28-NC:滴度≥1×108 TU/mL,上海佐润);干扰Lin28A载体 (SH-Lin28A:滴度≥1×108 TU/mL,上海佐润);抗Runt相关转录因子2抗体
(Proterintech,美国);Anti-GAPDH抗体(Proterintech,美国);辣根酶标记山羊抗兔IgG(中杉金桥,北京);hsa-let-7a-5p mimic(吉满,上海);PCR引物由上海生工合成,具体引物序列见表1和表2,课题实施中未给予特殊标注的试剂均来自于美国Sigma-Aldrich公司。
1.4 实验方法
1.4.1 PDLSCs分离、培养 实验研究前获得宁夏医科大学医学伦理审查委员会审核(宁医大伦理第2019-171号)。采集12-18岁患者(征得患者及家属同意并签署知情同意书)因正畸治疗所拔除的健康前磨牙,放入含体积分数为15%胎牛血清的α-MEM培养基中,超净工作台中刮取牙根中1/3的牙周膜组织,PBS清洗,剪至1 mm3大小,随后将样本转移至含有Dispase酶(4 mg/mL)和Ⅰ型胶原酶(3 mg/mL)的消化液中,37 ℃恒温环境消化1 h ,70 μm滤器过滤,收集下层液体,α-MEM正常培养液中和,常温低速离心5 min,弃上清,重悬细胞,37 ℃、体积分数为5%CO2细胞培养箱中培养。镜下观察细胞生长形态,每3 d予以换液,待细胞长至85%-90%时予以消化传代,培养的第3-5代细胞用于后续实验。
1.4.2 PDLSCs的表面标志物鉴定 使用0.25%胰蛋白酶溶液将第3代PDLSCs消化,经预冷PBS洗涤3次后重悬细胞(细胞浓度1.0×109 L-1),分5组,每组1 mL细胞悬液,4 ℃静置30 min;避光条件下,各组细胞内分别加入5 μL细胞表面标志物抗体(间充质干细胞表面标志分子STRO-1、CD146、白细胞共同抗原CD45、血小板内皮细胞标志分子CD31和空白对照PBS),混匀后4 ℃避光孵育1 h;PBS洗涤2次,离心去上清,预冷500 μL PBS悬浮细胞,上流式细胞仪检测。
1.4.3 PDLSCs成骨分化和成脂分化能力检测
(1)成骨诱导培养:将成骨诱导培养基(配方:100 μmol/L抗坏血酸+10 mmol/L β-甘油磷酸钠+10 nmol/L地塞米松+体积分数10%胎牛血清和1%双抗+基础培养液)加入到生长良好的第3代PDLSCs,培养液加入量依培养容器的差异而定,每3 d更换培养基,成骨诱导7 d行早期碱性磷酸酶染色,14 d时行成骨标志基因(碱性磷酸酶、Runt相关转录因子2 和骨桥蛋白)检测,21 d时行茜素红染色。
(2)成脂诱导培养:将成脂诱导培养基(配方:1 μmol/L吲哚美辛+10 μmol/L胰岛素+0.5 mmol/L IBMX+0.5 μmol/L地塞米松+体积分数为10%胎牛血清和1%双抗+基础培养液)培养生长状态良好的第3代PDLSCs,液体加入量仍依培养容器的要求量取,每3 d换液,成脂诱导18 d行油红O染色和成脂相关基因(脂蛋白脂酶和过氧化物酶体增殖物激活受体γ)检测。
1.4.4 成骨能力碱性磷酸酶染色、茜素红染色和成脂能力油红O染色
(1)碱性磷酸酶染色:成骨诱导培养7 d的第3代PDLSCs行早期成骨能力检测。弃上层培养液,PBS冲洗,每孔加入2 mL多聚甲醛固定液固定30 min,弃固定液,PBS冲洗,每孔加入1.5 mL 碱性磷酸酶染色液避光染色15 min,去除染色液,ddH2O冲洗5次,镜下观测碱性磷酸酶染色效果。
(2)茜素红染色:成骨诱导培养21 d的第3代PDLSCs行晚期成骨能力检测。弃上层培养液,PBS反复冲洗3次,每孔加入2 mL多聚甲醛固定液固定30 min,弃固定液,PBS冲洗,每孔加入2 mL茜素红染液染色30 min,弃染色液,PBS冲洗5次,镜下观测钙结节的染色效果。
(3)油红O染色:成脂诱导培养18 d的第3代PDLSCs行脂滴形成检测。吸弃上层培养液,PBS冲洗3次,每孔加入2 mL多聚甲醛固定液固定30 min,弃固定液,PBS冲洗,每孔加入2 mL油红O染液染色20 min,去除染色液,PBS冲洗5次,镜下观测脂肪样脂滴的形成和染色效果。
1.4.5 Lin28A在PDLSCs亚细胞结构的分布 按照核质分离试剂盒说明书要求,将4×106个生长状态良好的第4代PDLSCs消化、清洗,置于冰上,加入500 µL预冷的分离缓冲液,分离样本组分; 4 ℃条件下超低速离心(500 r/min),呈现清亮的上层细胞质和白色沉淀的下层细胞核组分;转移上层液体至新EP管,下层细胞核加入裂解缓冲液,经纯化、洗脱、提取,获得样本的细胞核和细胞质RNA;后续完成qRT-PCR检测PDLSCs亚细胞结构中Lin28A表达水平,选用U6为细胞核参照,GAPDH为细胞质参照。
1.4.6 过表达及干扰Lin28A表达的慢病毒载体转染PDLSCs,构建细胞模型
(1)实验分为5组:①空白对照组(无任何载体);②过表达Lin28A组(包含Lentiviral-Lin28A载体);③过表达空载体组(Lentiviral-Lin28A阴性对照);④干扰Lin28A表达组(包含Lin28A-shRNA载体);⑤干扰表达空载体组(Lin28A-shRNA阴性对照)。
(2)转染过程:收集状态最佳的第4代PDLSCs,以1×103个/孔细胞量接种至96孔板,24 h后以不同梯度的感染复数(0,10,20,40,60,80,100)加入相应慢病毒载体,转染培养48 h,通过镜下观测细胞的生长状态及荧光染色表达量筛选出最佳感染复数值,随后将细胞分别以5×104个/孔和2×104个/孔接种于无菌6孔板和24孔板中,以最佳感染复数为20对PDLSCs进行相关病毒载体转染培养(病毒载体转染48 h)和后续的成骨诱导培养(成骨诱导培养7,14,21 d),完成碱性磷酸酶染色、总RNA提取和茜素红染色。
1.4.7 实时定量RT-PCR检测相关基因的表达水平 将不同培养条件下的细胞进行清洗,利用Trizol试剂和RNA提取程序获取各组细胞总RNA,经PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒获取cDNA,结合荧光定量PCR试剂盒SYBRPremix Ex TaqTM进行实时荧光定量检测,分析成骨、成脂基因及Lin28A的表达。实验设计的引物序列见表1和表2。检测总RNA样本时,选用GAPDH为内参照;检测细胞质RNA和细胞核RNA时,以GAPDH为细胞质参照,以 U6为细胞核参照。
1.4.8 Western blot检测Lin28A对成骨相关蛋白Runt相关转录因子2的影响 使用RIPA蛋白裂解液(含1%PMSF蛋白酶抑制剂)分步骤提取各组细胞总蛋白,利用BCA蛋白试剂盒测量蛋白浓度,按要求进行蛋白变性。应用SDS-PAGE凝胶电泳和转膜方式,分离、转移蛋白样本印迹,随后对样本膜进行5%脱脂奶粉封闭2 h、一抗(抗Runt相关转录因子2抗体)孵育过夜、洗膜、二抗孵育、洗膜,利用成像仪对蛋白样本进行免疫印迹显影测定,采集图像,Image J软件分析数据。
1.4.9 利用生物信息学预测相关miRNA 应用Starbase V2.0预测软件(http://starbase.sysu.edu.cn/mirlncRNA.php)和TargetScan 8.0预测软件(http//www.targetscan.org)找出都可与Lin28A产生关联的miRNAs,分析其与Lin28A相互间存在的结合位点。通过PubMed、CNKI、Web of Science等生物医学文献数据库,检索和综合分析前期预测结果,筛选可能有目标调控作用let-7家族成员。
1.4.10 双荧光素酶法检测Lin28A与let-7a的结合关系 通过NCBI预测hsa-let-7a-5p和Lin28A的潜在序列。结合序列及其突变序列设计插入到pGL3-CMV-LUC载体上,创建Lin28A-NC(空白对照)、Lin28A-WT(野生型)和Lin28A-MT(突变型)报告载体,然后分别将mimic NC和hsa-let-7a-5p mimic依次与Lin28A-NC、Lin28A-WT和Lin28A-MT混合,通过HG transgene reagent转染试剂转染293T细胞。转染48 h后,使用报告基因检测试剂盒测定各组细胞荧光素酶活性,验证两者间的结合强度。
1.5 主要观察指标 ①PDLSCs表面标志物的表达和多向分化能力;②Lin28A在PDLSCs的亚细胞结构定位和成骨分化诱导不同时间的差异表达趋势;③利用慢病毒载体实现过表达Lin28A和干扰表达Lin28A的PDLSCs模型构建;④成骨诱导后,从正反两个方面观测Lin28A对PDLSCs成骨有关指标mRNA和蛋白水平、碱性磷酸酶染色和茜素红染色的影响;⑤利用生物信息学预测与Lin28A相关的miRNA,并筛选和验证出表达差异明显的miRNA,结合双荧光素酶活性分析与Lin28A有直接结合能力的miRNA;⑥应用成骨诱导实验,佐证Lin28A与let-7a在PDLSCs成骨分化的作用。
1.6 统计学分析 通过GraphPad Prism 9.0和SPSS 20.0统计学软件对所得数据进行应用分析及绘图。所有实验均进行3次或3次以上的独立重复实验,每次最少设置3组平行实验。定量数值采用x±s表示,检验方法采用单因素方差分析及配对t检验,P < 0.05为差异有显著性意义。实验数据的统计学方法已通过宁夏医科大学公共卫生与管理学院统计学专家审核。