茶黄素-3，3’-双没食子酸酯缓解人工假体磨损颗粒引起的成骨抑制

doi:10.12307/2023.411

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (25): 4069-4074.doi: 10.12307/2023.411

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茶黄素-3，3’-双没食子酸酯缓解人工假体磨损颗粒引起的成骨抑制

侯振扬1，孙义玲2，苏长征1，李振1，许正文1，李文明3，柏家祥3

徐州医科大学附属滕州医院(滕州市中心人民医院)，1关节运动医学科，2肿瘤内科，山东省滕州市 277500；3苏州大学附属第一医院骨科，江苏省苏州市 215006

收稿日期:2022-04-15 接受日期:2022-05-28 出版日期:2023-09-08 发布日期:2023-01-17
通讯作者: 柏家祥，苏州大学附属第一医院骨科，江苏省苏州市 215006
作者简介:侯振扬，男，1983年生，山东省泰安市人，汉族，医学博士，主治医师，主要从事骨关节外科及相关基础研究。
基金资助:
徐州医科大学附属医院科技发展优秀人才基金项目(XYFY2020012)，项目负责人：侯振扬

Theaflavin-3,3'-digallate alleviates osteogenesis inhibition induced by wear particles in artificial prostheses

Hou Zhenyang1, Sun Yiling2, Su Changzheng1, Li Zhen1, Xu Zhengwen1, Li Wenming3, Bai Jiaxiang3

1Department of Joint Sports Medicine, 2Department of Tumor, The Affiliated Tengzhou Hospital of Xuzhou Medical University (Tengzhou Central People’s Hospital), Tengzhou 277500, Shandong Province, China; 3Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Suzhou University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China

Received:2022-04-15 Accepted:2022-05-28 Online:2023-09-08 Published:2023-01-17
Contact: Bai Jiaxiang, Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Suzhou University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China
About author:Hou Zhenyang, MD, Attending physician, Department of Joint Sports Medicine, The Affiliated Tengzhou Hospital of Xuzhou Medical University (Tengzhou Central People’s Hospital), Tengzhou 277500, Shandong Province, China
Supported by:
Science and Technology Development Excellent Talent Fund Project of Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University, No. XYFY2020012 (to HZY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

茶黄素-3，3’-双没食子酸酯：是一种红茶中多酚类衍生物，具有抗炎、抗氧化、抗衰老、抗癌等多种药理功能，已对多种炎症性疾病显示出治疗作用。
人工假体磨损颗粒：人工关节置换后由于假体与骨组织之间的长期磨损，出现大量微米级、纳米级的磨损颗粒并蓄积在假体周围，这种异物颗粒会引起假体与骨界面内细胞功能改变，诱导产生大量炎性细胞因子和趋化因子，导致假体周围微环境发生改变，破坏成骨细胞、破骨细胞、免疫细胞等局部细胞的平衡状态，最终假体与骨的整合失效，假体失去功能。

背景：茶黄素-3，3’-双没食子酸酯通过抑制破骨细胞形成在骨质疏松动物模型中显示出良好的治疗效果，但其对成骨细胞作用的研究还不多见。
目的：探讨茶黄素-3，3’-双没食子酸酯对人工假体周围骨溶解的作用。
方法：①体外实验：选取生长状态良好的MC3T3-E1细胞，分4组培养：对照组加入成骨诱导分化培养基，钛颗粒组加入钛颗粒+成骨诱导分化培养基，低剂量组加入钛颗粒+茶黄素-3，3’-双没食子酸酯(1 mg/L)+成骨诱导分化培养基，高剂量组加入钛颗粒+茶黄素-3，3’-双没食子酸酯(10 mg/L)+成骨诱导分化培养基。成骨诱导培养2周后，进行碱性磷酸酶染色；成骨诱导3周后，进行茜素红染色。②体内实验：将32只C57BL/6J小鼠按随机数字表法分4组，空白对照组不进行任何处理，模型组将无菌钛颗粒均匀置于颅骨表面建立骨溶解模型，低剂量组、高剂量组分别将1，10 mg/(kg·d)的茶黄素-3，3’-双没食子酸酯经腹腔注射至骨溶解模型小鼠体内。给药2周后，进行颅骨micro-CT扫描。

结果与结论：①体外实验：碱性磷酸酶与茜素红染色显示，钛颗粒可抑制MC3T3-E1细胞的碱性磷酸酶活性与矿化结节形成，茶黄素-3，3’-双没食子酸酯可抑制钛颗粒的作用，且具有剂量依赖性；②体内实验：micro-CT扫描显示，钛颗粒可引发颅骨周围骨溶解，高剂量茶黄素-3，3’-双没食子酸酯可抑制钛颗粒引起的骨溶解；③结果表明：茶黄素-3，3’-双没食子酸酯可促进成骨分化，抑制人工假体周围骨溶解。

https://orcid.org/0000-0002-5944-877X(侯振扬)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 茶黄素-3, 3’-双没食子酸酯, 钛颗粒, 成骨分化, 假体周围骨溶解, 假体松动

Abstract: BACKGROUND: Theaflavin-3,3'-digallate has shown a good therapeutic effect in animal models of osteoporosis by inhibiting osteoclast formation, but there are few studies on osteogenesis.
OBJECTIVE: To investigate the effect of theaflavin-3,3'-digallate on periprosthetic osteolysis.
METHODS: (1) In vitro test: The MC3T3-E1 cells with good growth status were selected and cultured in four groups. The control group was added with osteogenic differentiation medium; the titanium particle group was added with titanium particles + osteogenic differentiation medium; the low-dose group was added with titanium particles + theaflavin-3,3'-digallate (1 mg/L) + osteogenic differentiation medium; high-dose group was added with titanium particles + theaflavin-3,3'-digallate (10 mg/L) + osteogenic differentiation medium. After 2 weeks of osteogenic induction, alkaline phosphatase staining was performed; after 3 weeks of osteogenic induction, alizarin red staining was performed. (2) In vivo experiment: 32 C57BL/6J mice were randomly divided into 4 groups. The blank control group did not receive any treatment. In the model group, sterile titanium particles were evenly placed on the surface of the skull to establish an osteolysis model. The low-dose group and high-dose group were injected intraperitoneally with 1, 10 mg/(kg·d) theaflavin-3,3'-digallate into osteolysis model mice. The mouse skull was analyzed by micro-CT 2 weeks after operation.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) In vitro experiments: alkaline phosphatase and alizarin red staining showed that titanium particles could inhibit alkaline phosphatase activity and mineralized nodule formation in MC3T3-E1 cells, and theaflavins-3,3'-bisgallate could inhibit the effect of titanium particles and was dose-dependent. (2) In vivo experiments: micro-CT scans showed that titanium particles could induce osteolysis around the skull, and high-dose theaflavin-3,3'-digallate could inhibit the osteolysis caused by titanium particles. (3) The results showed that theaflavin-3,3'-digallate could promote the osteogenic differentiation of MC3T3-E1 and inhibit periprosthetic osteolysis.

Key words: theaflavin-3,3'-digallate, titanium particle, osteogenic differentiation, periprosthetic osteolysis, prosthesis loosening

中图分类号:

侯振扬, 孙义玲, 苏长征, 李振, 许正文, 李文明, 柏家祥. 茶黄素-3，3’-双没食子酸酯缓解人工假体磨损颗粒引起的成骨抑制[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(25): 4069-4074.

Hou Zhenyang, Sun Yiling, Su Changzheng, Li Zhen, Xu Zhengwen, Li Wenming, Bai Jiaxiang. Theaflavin-3,3'-digallate alleviates osteogenesis inhibition induced by wear particles in artificial prostheses[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(25): 4069-4074.

图/表（结果） 3

2.1 TF3对MC3T3-E1细胞增殖活性的影响 CCK-8实验检测结果显示，当TF3的质量浓度≤10 mg/L时，对MC3T3-E1细胞增殖无明显影响；当其质量浓度增加至20，40 mg/L时，对MC3T3-E1细胞增殖有显著影响，见图1A。培养72 h后，当TF3的质量浓度≤10 mg/L时，MC3T3-E1细胞存活率和生长抑制率未受到显著影响，当其质量浓度增加至20，40 mg/L时，MC3T3-E1细胞存活率显著下降，生长抑制率显著升高，见图1B、C。

2.2 体外TF3对成骨的影响根据TF3对MC3T3-E1细胞增殖活性影响的实验结果，选择1，10 mg/L的TF3进行成骨诱导分化实验。由于成骨早期碱性磷酸酶表达活性上调，晚期成骨细胞胞外骨基质分泌增加形成矿化结节，因此选择早期碱性磷酸酶活性染色和晚期茜素红染色评估TF3在钛颗粒干预下的成骨诱导能力。
碱性磷酸酶染色可将碱性磷酸酶活性和含量高的MC3T3-E1细胞染成深蓝色，染色程度与碱性磷酸酶呈正相关。碱性磷酸酶染色显示，与对照组相比，钛颗粒组具有明显抑制MC3T3-E1细胞成骨分化的作用；经过TF3处理后，钛颗粒抑制成骨分化的作用被逆转，并且此作用在高剂量组更明显，表明TF3的抑制作用与剂量呈正相关，见图2。成骨细胞矿化结节染色结果与碱性磷酸酶染色结果一致，与钛颗粒组相比，TF3处理组明显具有更多的成骨矿化结节，见图2。

2.3 体内TF3缓解钛颗粒引起的颅骨骨溶解 micro-CT扫描结果显示，模型组C57BL/6J小鼠颅骨受到了明显的侵蚀，经TF3治疗后可以减轻钛颗粒引起的骨质溶解；通过三维重建后对感兴趣区域(ROI)进行骨密度、骨体积/组织体积、孔隙率分析，结果显示高剂量组骨密度、骨体积/组织体积显著高于模型组(P < 0.05或P < 0.01)，骨组织孔隙率显著低于模型组(P < 0.01)，见图3。

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引言

随着生活水平的提高及医疗技术的进步，人工关节置换已成为治疗各类终末期关节疾病的金标准，并且由于中国社会的快速老龄化，未来需要关节置换治疗的患者将持续增长。尽管人工关节置换手术技术和假体设计取得了长足的进步，但关节假体磨损产生的颗粒及随后的生物反应导致的无菌性松动仍然是人工关节置换后中远期翻修的主要因素之一[1]，翻修手术难度大、术后并发症多、翻修后假体稳定性明显降低，使得患者的生活质量明显下降。因此，减少假体周围磨损颗粒引起的无菌性松动，加强假体周围的骨整合，将降低人工关节置换后中远期翻修率，提高假体使用寿命。
磨损颗粒主要包括假体组件相互作用产生的金属颗粒及聚乙烯颗粒，因钛颗粒较聚乙烯颗粒的物理性质更加稳定，且浓度较容易控制，较多的动物实验选用钛颗粒作为研究对象。现有的研究表明，磨损颗粒与假体周围组织的生物反应是导致无菌性松动的主要原因，其机制包括增加免疫细胞的活化、促进破骨细胞的激活、引起成纤维细胞的增殖及抑制成骨细胞的活性等[2-5]。以往研究多集中于破骨细胞的过度激活和增殖，认为磨损颗粒引起的局部慢性炎症反应导致的破骨细胞激活并吸收骨质是关键环节[6-8]。但是，对骨量的调控不仅是通过破骨细胞吸收骨质，而且还需要成骨细胞诱导的骨质生成，这两种过程在生理环境下紧密联系，维持骨质平衡[9-10]。此外，越来越多的研究证实，成骨细胞在假体周围骨溶解中的作用不容忽视，不仅包括成骨细胞的成骨作用，还包括成骨细胞对关节假体周围微环境的调控作用[11-13]。
大量临床研究证实，中国传统茶饮红茶富含促进健康的成分，如茶红素、茶黄素和儿茶素等[14]。其中茶黄素的主要成分之一茶黄素-3，3’-双没食子酸酯(Theaflavin-3，3’-
digallate，TF3)，已被多次报道可抑制破骨细胞活性和形成，减少破骨细胞导致的骨质吸收[15-17]，但是关于TF3对成骨细胞作用的研究较少，且机制不明确。有研究证实，红茶的活性生物活性成分具有促进成骨分化和增加成骨矿化的作用[18-20]。一些实验室通过体内外实验进一步发现，茶黄素具有促进诱导骨髓间充质干细胞成骨的能力[21-22]。在慢性炎症条件下成骨细胞的功能往往受到显著抑制，而TF3能否在炎症条件下有效诱导成骨还未见报道。此外，TF3还有清除胞内自由基、抵抗氧化应激、保持细胞活性的功能[23]。因此，此次研究通过体外细胞实验与小鼠颅骨骨溶解模型，验证TF3对钛颗粒引起的慢性炎症状态下细胞成骨分化功能的影响，以期为无菌性松动的预防和早期治疗提供新的思路和方法。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞学实验，随机对照动物实验，组间比较进行单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2021年1月至2022年2月在苏州大学附属第一医院完成。
1.3 材料
1.3.1 主要材料与试剂 TF3(HPLC≥98%，CAS:33377-72-9)购自上海源叶生物科技有限公司；钛颗粒购自Johnson Matthey公司；小鼠胚胎成骨细胞前体细胞MC3T3-E1购自中国科学院细胞库；胎牛血清、高糖DMEM培养基购自美国HyClone公司；BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒和成骨细胞矿化结节染色试剂盒(茜素红S法)购自上海碧云天生物公司；Cell Counting Kit-8 (CCK-8)购自日本同仁化学/DOJINDO LABORATORIES。
1.3.2 实验动物雄性C57BL/6J小鼠32只，6-8周龄，体质量25-30 g，购自苏州大学实验动物平台。所有动物饲养在SPF动物房，温度25 ℃，湿度55%，白天/夜间12 h交替，自由进食、饮水。将32只C57BL/6J小鼠按照随机数字表分成4组，空白对照组、模型组、低剂量组和高剂量组，每组8只。
实验获得苏州大学伦理委员会批准(伦理号：202109A0502)。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。
1.4 实验方法
1.4.1 钛颗粒的准备新购买的钛颗粒需要去除表面的内毒素：首先，将钛颗粒置于180 ℃烘箱中烘烤6 h，随后浸泡在体积分数75%乙醇中48 h；接着使用离心机离心，倒去乙醇，加入无菌PBS清洗，离心，反复清洗3遍后，使用内毒素检测试剂盒检测钛内毒素指标，检测无内毒素的钛颗粒用于实验。
1.4.2 细胞增殖和毒性实验使用无水乙醇将适量的TF3配制为1 g/L的母液。吸取适量的母液，加入含有体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，配制TF3质量浓度分别为0.1，1，10，20，40 mg/L的工作液。
根据镜下细胞形态，选取生长状态良好的MC3T3-E1细胞，消化、离心、重悬，将细胞悬液以5 000个/孔的密度接种于96孔板内，培养12 h后随机分组：实验组培养基更换为0.1，1，10，20，40 mg/L的TF3工作液，对照组继续常规培养，空白组仅仅加体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM培养基(无细胞)，每组5复孔，每孔100 μL。置于含有体积分数5%CO2细胞培养箱内37 ℃培养。培养至预设的时间点后，取出干预的96孔板，用含有10%CCK-8试剂和体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM培养基换液，置于培养箱内继续培养1 h后，在450 nm波长处检测各孔吸光度值。
培养72 h后，根据获得的吸光度值(A值)计算细胞存活率和抑制率，细胞存活率=[(A实验组-A空白组)/(A对照组-A空白组)]×100%；细胞生长抑制率=[(A对照组-A实验组)/(A对照组-A空白组)]×100%。根据细胞存活率与抑制率结果，筛选适宜质量浓度的TF3用于后续实验。
1.4.3 体外实验挑选生长状态良好的MC3T3-E1细胞悬液接种于24孔板，细胞密度为2×104/孔，随机分4组处理：对照组常规培养，钛颗粒组加入钛颗粒，低剂量组加入钛颗粒后加入1 mg/L的TF3，高剂量组加入钛颗粒后即刻加入10 mg/L的TF3，每组3复孔。待细胞贴壁、展开后，每孔加入1 mL成骨诱导分化培养基(含体积分数10% 胎牛血清、10 mmol/L β-甘油磷酸钠，0.1 μmol/L地塞米松、0.25 mmol/L抗坏血酸)诱导培养。
碱性磷酸酶染色：成骨诱导培养2周后，吸取培养基，用预冷PBS冲洗3遍，40 g/L多聚甲醛固定20 min；使用BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒进行碱性磷酸酶染色，倒置显微镜(Zeiss，德国)下拍照截图。
茜素红染色：成骨诱导培养3周后，每孔加入500 μL体积分数70%乙醇固定15 min；小心吸去固定液晾干后，每孔加入500 μL 0.5%茜素红溶液(pH=4.1)，37 ℃避光孵育15-30 min，至桔黄色出现；吸去染色液，加入蒸馏水终止反应，洗净晾干，显微镜下观察并拍照。
1.4.4 体内实验
制备颅骨骨溶解模型：取模型组、低剂量组和高剂量组C57BL/6J小鼠，使用戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，对颅骨进行备皮、消毒、铺单，在颅骨正中纵行作一2 cm切口，用血管钳钝性分离皮下组织暴露颅骨，将0.1 mg无菌钛颗粒均匀置于颅骨表面，逐层缝合，消毒包扎，给予抗生素预防感染。随后，低、高剂量组腹腔注射1，10 mg/(kg·d)的TF3，空白对照组与模型组腹腔注射等量的无菌PBS，连续给药2周。期间，每天观察小鼠活动、进食及伤口的状态。
颅骨micro-CT扫描：连续给药2周后，麻醉后处死小鼠，收集颅骨，40 g/L多聚甲醛固定48 h后，将颅骨表面的钛颗粒剥离干净，使用动物micro-CT(SkyScan 1176，Aartselaar，Belgium)对颅骨进行扫描，参数设置为电压60 kV，电流170 mA，旋转角度0.7°，分辨率为9 mm。使用制造商的软件SkyScan RECON，对扫描后的数据进行重建并用于分析骨密度、骨体积/组织体积、孔隙率及可视化呈现骨质变化。
1.5 主要观察指标 TF3对钛颗粒引起的慢性炎症状态下细胞成骨分化功能的影响。
1.6 统计学分析数据以x±s表示。用 Graphpad Prism 8.0软件进行统计分析，使用成组t检验、单因素方差分析及Tukey多重比较，检验来分析确定各组数据间的统计学差异性，P < 0.05 被认为差异有显著性意义。统计学方法已经苏州大学生物统计学专家审核。

讨论

人工关节置换是治疗各类终末期骨性关节炎的有效方法，但术后中晚期可发生无菌性松动，需要行关节翻修手术，这给患者带来了巨大的痛苦与沉重的经济负担。目前认为假体周围骨溶解和伴随而来的无菌性松动是人工关节置换后翻修的最常见原因[24]。无菌性松动机制有多种，比如假体的过度磨损、术后力线不佳等机械因素，这些情况往往与手术者的手术技术相关。除此种情况，开发药物治疗假体周围骨溶解意义重大。源自假体组件的磨损颗粒与假体周围组织中的多种细胞类型相互作用，导致慢性炎症过程，最终导致假体周围骨质流失[25]，这些细胞主要包括巨噬细胞、破骨细胞、成骨细胞和成纤维细胞。同时，人们普遍认为关节假体磨损颗粒的产生可能是假体周围骨溶解的主要致病因素，可以引起假体周围慢性炎症微环境[26]。目前，对假体周围骨溶解的发病机制尚未完全了解，没有明确有效的治疗药物，因此，选择并研究治疗假体周围骨溶解的有效药物成为一项具有重大意义的研究课题。
对于假体周围骨溶解的发生机制，多数学者认为是在多因素作用下假体磨损颗粒在植入物与骨界面引起慢性无菌性炎症，这种慢性炎症使微环境内的细胞功能发生改变，最终抑制植入物的骨整合，进而引发假体松动。目前，植入物与骨界面微环境内细胞的研究多数集中在免疫细胞、破骨细胞和成骨细胞，众所周知，巨噬细胞在炎症的发生、发展到缓解阶段都发挥着关键作用。体外将假体磨损颗粒与巨噬细胞共培养后，观察到巨噬细胞吞噬这些颗粒并释放前列腺素E2、肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素6等炎性细胞因子，促使更多巨噬细胞和免疫细胞激活募集，最终形成慢性炎症影响其他细胞功能。其中，破骨细胞被认为是吸收骨质最主要的细胞，关于在炎性环境下破骨细胞功能变化研究也一直是无菌性松动领域重点内容。
破骨细胞是由多个破骨前体细胞(单核-巨噬细胞细胞系)融合而成，通过局部释放乳酸、柠檬酸等多种酸性物质，在酸性环境下使骨内无机矿物质溶解，同时释放多种组织蛋白酶降解骨质有机物，最终引起骨质减少。研究人员在无菌性松动患者假体周围发现，多种募集和促进破骨前体细胞功能的细胞因子如巨噬细胞炎性蛋白1、巨噬细胞炎性蛋白1α、白细胞介素8、核因子κB受体活化因子配体等表达明显升高。体外研究中，在聚甲基丙烯酸甲酯和钛颗粒干预下，同样发现巨噬细胞和成纤维细胞高表达促进破骨细胞功能因子。此外，除了磨损颗粒的直接作用，研究人员还发现通过肿瘤坏死因子α、白细胞介素1等炎性细胞因子直接刺激同样可以引起动物破骨细胞功能亢进、骨质溶解，指出慢性炎性环境会加剧磨损颗粒引起的破骨细胞功能。与破骨细胞功能相反，具有促进骨形成和重建功能的成骨细胞，在假体植入后骨整合过程中发挥关键作用。
生理条件下，骨吸收和骨形成相互平衡，在骨重塑和内环境稳定中成骨与破骨细胞均发挥着重要作用。破骨细胞介导的骨吸收与成骨细胞新骨的形成紧密偶联，并且在假体周围骨溶解中，骨吸收与骨形成显著失衡，成骨细胞及其祖细胞的功能明显受损，导致整体植入物周围骨质流失。成骨细胞是骨形成相关细胞系的一部分，包括间充质干细胞、前成骨细胞、成骨细胞和骨细胞。间充质干细胞位于骨髓基质、骨膜和局部微血管壁中，它们在特定阶段的特定条件下分化为成骨细胞。间充质干细胞向成骨细胞分化的机制尚不完全清楚，但有代表其特征的转录因子，包括SOX9、RUNX2和Osterix等在成骨分化阶段特征性的表达增加。成骨细胞负责生产分泌胞外骨基质，包括骨胶原纤维和一些细胞因子类基质如碱性磷酸酶、骨结合素、骨钙素、骨生长调节因子等重要标记物。而磷酸钙、碳酸钙、柠檬酸钙等无机盐逐渐沉积为羟基磷灰石结晶埋于骨的有机质间隙中，这一过程也被称为骨矿化。一旦骨矿化形成，成骨细胞被细胞外基质包围，成骨细胞就被称为骨细胞。骨细胞之间相互联络，形成一个代谢活跃的细胞网络维持骨骼的代谢。然而在骨溶解中，对成骨细胞功能变化的研究仍未达到像破骨细胞和巨噬细胞研究一样全面。现有研究表明，磨损颗粒及炎性环境可以引起显著的成骨功能抑制，植入物周围无法形成新骨，最终导致假体失去稳定性并引起无菌性松动。此次研究在成骨碱性磷酸酶及成骨细胞矿化结节染色实验中发现，与对照组比，钛颗粒干预组明显抑制成骨功能。XIONG等[27]通过恢复钛颗粒引起的成骨抑制成功治疗了钛颗粒引起的小鼠颅骨骨溶解。因此，促进成骨分化及骨形成是治疗无菌性松动发生和抑制无菌性松动形成的有效方法，这也是作者选择TF3进行促进成骨的研究来治疗假体周围骨溶解的原因。
多项研究发现磨损颗粒引发成骨细胞氧化应激，在胞内形成过多的活性氧，最终引起多个细胞器功能紊乱，丧失成骨能力[28-29]。磨损颗粒还可以通过激活成骨细胞内凋亡通路导致细胞发生凋亡，抑制骨形成。DENG等[30]通过恢复被下调的SIRT1逆转了成骨细胞凋亡，并通过SIRT1激动剂成功治疗了小鼠颅骨骨溶解。与凋亡生物作用相反，自噬具有分解代谢和再循环细胞受损或有害成分、调节基本生理代谢和生长发育、维持细胞内稳态的功能[31]。大量研究指出，通过上调成骨细胞自噬水平可以促进成骨分化及骨形成[32-33]。然而有研究指出，在CoCrMo颗粒干预的成骨细胞内观察到自噬上调，通过自噬抑制剂可以缓解成骨细胞凋亡的发生[34]。由于假体磨损颗粒之间化学性能与物理性能的差异，使研究假体周围骨溶解的发生发展机制变得困难而缓慢，对假体周围骨溶解具体且精确的发病机制还不是很清楚。
TF3具有良好的抗炎作用，已有多项研究证实，TF3在体内体外均可以有效抑制巨噬细胞释放炎性细胞因子[23，35]。
HU等[15]还发现，TF3不仅可以在体外有效抑制破骨细胞形成，还可以在去势小鼠的骨质疏松模型中有效抑制破骨细胞活性、增加骨密度。最新研究表明，TF3促进小鼠成骨前体细胞向成骨分化，有效缓解了去势小鼠的骨量降低[36]。此次研究中，通过体外实验也发现，TF3可以有效缓解钛颗粒引起的MC3TC-E1细胞成骨功能抑制，并且促进成骨功能呈剂量依赖性，随着TF3质量浓度的增高其促进成骨能力增强。同时将TF3应用于钛颗粒诱导的骨溶解模型小鼠后，同样获得治疗作用，根据颅骨CT分析，TF3治疗组小鼠的颅骨骨密度、骨量均优于模型组，骨溶解程度明显低于模型组，因此，应用TF3促进成骨细胞功能增加人工关节植入物的骨整合程度，从而达到预防和治疗假体周围骨溶解是一个可行的手段。然而TF3对成骨细胞的作用机制未能阐明。最新研究指出，TF3通过激活Nrf2抑制细胞内氧化应激水平并逆转细胞凋亡的发生[37]。此外，TF3在高糖引起的心肌细胞损伤中，通过激活自噬发生恢复心肌细胞活性[38]。由于自噬和凋亡在成骨分化和成骨功能调控方面起着重要作用，因此，未来对TF3和成骨细胞相互作用的研究应更多集中在细胞自噬和凋亡方面。
综上所述，实验得出以下结论：TF3可促进MC3T3-E1细胞的成骨分化及小鼠颅骨骨形成，应用TF3可有效缓解假体周围骨溶解，但是关于TF3促成骨机制还有待深入研究。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

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磨损颗粒主要包括假体组件相互作用产生的金属颗粒及聚乙烯颗粒，因钛颗粒较聚乙烯颗粒物理性质更加稳定，且浓度较容易控制，较多的动物实验研究选用钛颗粒作为研究对象。现有的研究表明，磨损颗粒与假体周围组织的生物反应是导致无菌性松动的主要原因，其机制包括增加免疫细胞的活化、促进破骨细胞的激活、引起成纤维细胞的增殖及抑制成骨细胞的活性等。与成骨细胞相关研究相比，之前的研究更多集中于破骨细胞的过度激活和增殖，认为磨损颗粒引起的局部慢性炎症反应导致的破骨细胞激活并吸收骨质是关键环节。但是对骨量的调控不仅是通过破骨细胞吸收骨质，而且还需要成骨细胞诱导的骨质生成，这两种过程在生理环境下紧密联系，维持骨质平衡。此外，越来越多的研究证实，成骨细胞在假体周围骨溶解中的作用不容忽视，不仅包括成骨细胞的成骨作用，还包括成骨细胞对关节假体周围微环境的调控作用。#br# 经大量临床研究证实，中国传统茶饮红茶富含促进健康的成分，如茶红素、茶黄素和儿茶素等。其中茶黄素的主要成分之一茶黄素-3，3’-双没食子酸酯(Theaflavin-3,3'-digallate，TF3)，已被多次报道具有抑制破骨细胞活性和形成，减少破骨导致的骨质吸收。相较于TF3对破骨细胞相关的研究，关于TF3对成骨细胞作用的研究还比较少，且机制不是很明确。有研究证实红茶的活性生物活性成分具有促进成骨分化和增加成骨矿化的功能。一些实验室通过体内外实验进一步发现茶黄素具有促进诱导骨髓间充质干细胞成骨的能力。慢性炎症条件下成骨细胞的功能往往受到显著抑制，而茶黄素能否在炎症条件下有效诱导成骨还未有报道。此外，TF3还有清除胞内自由基，抵抗氧化应激，保持细胞活性的功能。因此，此次实验针对这些可能性进行实验设计，通过体外磨损颗粒对成骨细胞功能的抑制实验和体内磨损颗粒诱导的小鼠颅骨骨溶解模型，验证TF3对钛颗粒引起的慢性炎症状态下细胞成骨分化功能的影响，以期为无菌性松动的预防和早期治疗提供新的思路和方法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

茶黄素-3，3’-双没食子酸酯缓解人工假体磨损颗粒引起的成骨抑制

Theaflavin-3,3'-digallate alleviates osteogenesis inhibition induced by wear particles in artificial prostheses

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