miR-1-5p修饰脐带间充质干细胞对系统性红斑狼疮T淋巴细胞亚群的免疫调节

doi:10.12307/2021.132

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (31): 4928-4938.doi: 10.12307/2021.132

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miR-1-5p修饰脐带间充质干细胞对系统性红斑狼疮T淋巴细胞亚群的免疫调节

胡明智1，张晶莹2，杨国安3，庞春艳3，张伟3，王永福3，孙晓林3

包头医学院第一附属医院，1风湿免疫科，包头医学院风湿免疫研究所，2重症医学科，内蒙古自治区包头市 014010；3自体免疫学重点实验室，内蒙古自治区包头市 014010

收稿日期:2020-08-13 修回日期:2020-08-14 接受日期:2020-09-26 出版日期:2021-11-08 发布日期:2021-04-25
通讯作者: 孙晓林，博士，主管检验师，自体免疫学重点实验室，内蒙古自治区包头市 014010
作者简介:胡明智，女，1993年生，天津市人，汉族，2017 年山西医科大学毕业，硕士，目前主要从事自身免疫性疾病的研究
基金资助:
国家自然科学基金项目(81860294)，项目负责人：孙晓林；国家自然科学基金项目(81860295)，项目负责人：张伟；内蒙古自治区自然科学基金项目(2019MS08055)，项目参与人：孙晓林；内蒙古自治区科技计划项目(201802089)，项目参与人：孙晓林；内蒙古自治区科技计划项目(2019GG052)，项目负责人：王永福

Immunomodulatory effects of umbilical cord-mesenchymal stem cells modified by miR-1-5p on T lymphocyte subsets in systemic lupus erythematosus

Hu Mingzhi1, Zhang Jingying2, Yang Guoan3, Pang Chunyan3, Zhang Wei3, Wang Yongfu3, Sun Xiaolin3

1Department of Rheumatology, First Affiliated Hospital of Baotou Medical College, Institute of Rheumatology of Baotou Medical College, Baotou 014010, Inner Mongolia Autonomous Region, China; 2Department of Critical Care Medicine, First Affiliated Hospital of Baotou Medical College, Baotou 014010, Inner Mongolia Autonomous Region, China; 3Key Laboratory of Autoimmunology, Baotou 014010, Inner Mongolia Autonomous Region, China

Received:2020-08-13 Revised:2020-08-14 Accepted:2020-09-26 Online:2021-11-08 Published:2021-04-25
Contact: Sun Xiaolin, MD, Laboratorian-in-charge, Key Laboratory of Autoimmunology, Baotou 014010, Inner Mongolia Autonomous Region, China
About author:Hu Mingzhi, Master, Department of Rheumatology, First Affiliated Hospital of Baotou Medical College, Institute of Rheumatology of Baotou Medical College, Baotou 014010, Inner Mongolia Autonomous Region, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 81860294 (to SXL), No. 81860295 (to ZW); Natural Science Foundation of Inner Mongolia Autonomous Region, No. 2019MS08055 (to SXL); Science and Technology Project of Inner Mongolia Autonomous Region, No. 201802089 (to SXL), No. 2019GG052 (to WYF)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
miR-1：miRNA是一类高度保守的小分子非编码 RNA，miRNA通过降解特定的mRNA或抑制翻译过程，参与转录后水平基因表达的调控，进而调节细胞的增殖、分化、凋亡等生物学过程。越来越多的研究证明，miR-1与肿瘤的发生、发展过程密切相关，miR-1在许多肿瘤细胞中存在异常表达，并参与肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡。miR-1也被认为是一种肌肉特异性miRNA，最早被发现在心肌和骨骼肌中表达，有研究发现其在皮肌炎中呈低表达。

免疫调节：脐带间充质干细胞具有免疫调节的生物学特性，表现为对T淋巴细胞亚群(Th1/Th2/Th17/Treg)分化的调节，维持其免疫平衡。

背景：近年来有很多关于基因修饰间充质干细胞治疗疾病的研究，包括自身免疫性疾病的治疗。已发现多种 miRNA 在自身免疫性疾病中异常表达，其中miR-1在多发性肌炎中呈低表达，miR-1-3p是与系统性红斑狼疮易感基因相关的miRNA之一。
目的：研究miR-1-5p修饰脐带间充质干细胞对系统性红斑狼疮T淋巴细胞亚群的免疫调节作用。
方法：选取疾病活动期30-60岁系统性红斑狼疮女性患者和健康体检者各8例，实时荧光定量PCR检测两组外周血单个核细胞中的miR-1-5p表达水平；无菌条件下采集足月顺产或剖宫产新生儿脐带进行脐带间充质干细胞的分离培养，利用脂质体法，按浓度梯度为5，7，10，15 nmol/L的Red Fluorescent Control miRNA分别转染脐带间充质干细胞24，48，72 h，流式细胞术检测不同浓度梯度和时间梯度下miR-1-5p转染效率；密度梯度离心法分离系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞，与miR-1-5p转染的脐带间充质干细胞共培养，分为miR-1转染脐带间充质干细胞与外周血单个核细胞共培养组，miRNA阴性对照转染脐带间充质干细胞与外周血单个核细胞共培养组，未转染脐带间充质干细胞与外周血单个核细胞共培养组，外周血单个核细胞单独培养组。共培养48 h，实时荧光定量PCR检测各组外周血单个核细胞中IL-17A、Foxp3、IFN-γ、IL-4基因的相对表达量；流式细胞术检测各组外周血单个核细胞中Th17、Treg、Th1、Th2细胞的分化情况。
结果与结论：①与健康对照组相比，miR-1-5p在系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞中的表达显著下调(P < 0.05)；②当miR-1-5p浓度为
10 nmol/L、转染时间为48 h时，转染效率最高；③与外周血单个核细胞组相比，miR-1-5p转染脐带间充质干细胞与外周血单个核细胞共培养组Foxp3的表达增加，Treg细胞比例显著升高，差异有显著性意义(P < 0.05)；与外周血单个核细胞组相比，其他3个共培养组Th17/Treg比值在基因表达水平上是下降的，差异有显著性意(P < 0.01)，但流式检测各组Th17/Treg细胞比值，差异无显著性意义(P > 0.05)；与外周血单个核细胞组相比，miR-1-5p转染脐带间充质干细胞与外周血单个核细胞共培养组Th1/Th2比值在基因表达水平上是下降的，差异有显著性意义(P < 0.05)，但流式检测各组Th1/Th2细胞比值，差异无显著性意义(P > 0.05)；④结果显示，miR-1-5p修饰的脐带间充质干细胞对系统性红斑狼疮Treg细胞具有免疫调节作用，过表达miR-1-5p可以促进系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞中Treg细胞的分化和增殖。miR-1-5p通过上调Treg细胞表达调节Th17/Treg的免疫失衡，同时也调节Th1/Th2的免疫失衡。
https://orcid.org/0000-0003-1989-9901(胡明智)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 脐带间充质干细胞, miR-1, 系统性红斑狼疮, T淋巴细胞, Treg细胞, Th1, Th2, 免疫调节

Abstract: BACKGROUND: In recent years, there were lots of researches on the treatment of diseases by gene modified mesenchymal stem cells, including the treatment of autoimmune diseases. Various miRNAs have been found to be abnormally expressed in autoimmune diseases, among which miR-1 is low-expressed in polymyositis, and miR-1-3p is one of the miRNAs related to systemic lupus eythematosus susceptibility genes.
OBJECTIVE: To investigate the immunoregulatory effect of miR-1-5p modified umbilical cord-mesenchymal stem cells on T lymphocyte subsets in systemic lupus erythematosus.
METHODS: The expression level of miR-1-5p in the two groups was detected by real-time fluorescence quantitative PCR in eight patients aged 30-60 years with active systemic lupus erythematosus and eight healthy subjects. Umbilical cord-mesenchymal stem cells were isolated and cultured from umbilical cord of newborns delivered at term or cesarean section under aseptic conditions. Using the liposome method, the umbilical cord-mesenchymal stem cells were transfected with Red Fluorescent Control with a concentration gradient of 5, 7, 10, and 15 nmol/L for 24, 48, and 72 hours. Transfection efficiency of miR-1-5p was determined by flow cytometry at different concentration gradients and time gradients. Peripheral blood mononuclear cells in systemic lupus erythematosus patients were isolated by density gradient centrifugation and co-cultured with umbilical cord-mesenchymal stem cells which were transfected with miR-1-5p, and divided into four groups: umbilical cord-mesenchymal stem cells transfected with miR-1 and co-cultured with peripheral blood mononuclear cells of systemic lupus erythematosus patients, umbilical cord-mesenchymal stem cells transfected with miRNA negative control and co-cultured with peripheral blood mononuclear cells of systemic lupus erythematosus patients, umbilical cord-mesenchymal stem cells co-cultured with peripheral blood mononuclear cells of systemic lupus erythematosus patients, and peripheral blood mononuclear cells of systemic lupus erythematosus patients without treatment group. The co-culture was conducted for 48 hours. The relative expression levels of IL-17A, Foxp3, IFN-γ and IL-4 genes in each group were detected by real-time fluorescence quantitative PCR. Flow cytometry was used to detect the differentiation of Th17, Treg, Th1 and Th2 cells in peripheral blood mononuclear cells of each group.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) miR-1-5p was significantly down-regulated in peripheral blood mononuclear cells of systemic lupus erythematosus patients compared with healthy controls (P < 0.05). (2) The transfection efficiency was highest when the concentration of miR-1-5p was 10 nmol/L and the transfection time was 48 hours. (3) Compared with the peripheral blood mononuclear cells of systemic lupus erythematosus patients without treatment group, the expression of Foxp3 in umbilical cord-mesenchymal stem cells transfected with miR-1-5p and co-cultured with peripheral blood mononuclear cells of systemic lupus erythematosus patients group was increased; the proportion of Treg cells was significantly increased; and the differences were statistically significant (P < 0.05). Compared with the peripheral blood mononuclear cells of systemic lupus erythematosus patients without treatment group, Th17/Treg ratio decreased in the other three co-culture groups, and the difference was statistically significant (P < 0.01). Th17/Treg cell ratio detected by flow cytometry in each group was not significantly different (P > 0.05). Compared with the peripheral blood mononuclear cells of systemic lupus erythematosus patients without treatment group, the Th1/Th2 ratio in the umbilical cord-mesenchymal stem cells transfected with miR-1-5p and co-cultured with PBMC of systemic lupus erythematosus patients group decreased, and the difference was statistically significant (P < 0.05). However, the Th1/Th2 cell ratio of each group detected by flow cytometry was not significantly different (P > 0.05). (4) The results showed that the umbilical cord-mesenchymal stem cells modified by miR-1-5p had an immunoregulatory effect on Treg cells of systemic lupus erythematosus, and overexpression of miR-1-5p could promote the differentiation and proliferation of Treg cells of systemic lupus erythematosus patients. miR-1-5p regulates the immune imbalance of Th17/Treg and Th1/Th2 by up-regulating the expression of Treg cells.

Key words: stem cells, umbilical cord-mesenchymal stem cells, miR-1, systemic lupus erythematosus, T lymphocytes, Treg cells, Th1, Th2, immunoregulation

中图分类号:

胡明智, 张晶莹, 杨国安, 庞春艳, 张伟, 王永福, 孙晓林. miR-1-5p修饰脐带间充质干细胞对系统性红斑狼疮T淋巴细胞亚群的免疫调节[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(31): 4928-4938.

Hu Mingzhi, Zhang Jingying, Yang Guoan, Pang Chunyan, Zhang Wei, Wang Yongfu, Sun Xiaolin. Immunomodulatory effects of umbilical cord-mesenchymal stem cells modified by miR-1-5p on T lymphocyte subsets in systemic lupus erythematosus[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(31): 4928-4938.

图/表（结果） 18

2.1 系统性红斑狼疮患者PBMCs中miR-1-5p的表达下调收集8例系统性红斑狼疮患者和8例健康对照人群的PBMCs，采用qRT-PCR检测miR-1-5p的表达，结果显示：miR-1-5p在系统性红斑狼疮患者PBMCs中的表达显著低于健康对照人群(P < 0.05)，见图1。

UC-MSCs的形态特征和生长规律组织爬片法培养7 d后，倒置显微镜下可观察到组织周围有单个的短梭形或多角形细胞散落分布。培养12 d后可观察到细胞形成群落，并逐渐开始呈放射状密集生长，15 d后细胞融合可达80%-90%，90%以上为形态相对均一的长梭形细胞，呈平行排列生长或旋涡状生长。传代后的细胞增殖迅速，4 d后细胞融合可达90%以上，符合间充质干细胞的形态特征和生长规律，见图2。

UC-MSCs表面标志抗原鉴定流式细胞仪检测第2代UC-MSCs表面标志蛋白，CD34、CD45及CD11c阴性表达，CD105、CD90及CD44阳性表达，见图3。

UC-MSCs的诱导分化能力 UC-MSCs成骨诱导分化后，细胞形态逐渐由长梭形变为多角形，且胞体增大，镜下可见钙化结节，茜素红染色后钙化结节呈橘红色；UC-MSCs成脂诱导分化后，细胞形态逐渐由长梭形变为短梭型、椭圆形或圆形，镜下可见大小不一的折光性很强的空泡形成，油红O染色后细胞内可见大量被染成鲜红色的脂滴，见图4。

miRNA Mimic转染效率以Lipofectamine? RNAiMAX Reagent为载体，倒置显微镜下观察转染miR-1-5p基因的UC-MSCs形态无明显变化。BLOCK-iTTMAlexa FluorTM Red Fluorescent Control为专门用于测定转染效率的miRNA mimic，转染UC-MSCs后，通过流式细胞仪检测其自带红光，记录转染效率。实验结果发现，当BLOCK-iTTMAlexa FluorTM Red Fluorescent Control浓度为10 nmol/L、转染时间为48 h时，转染效率最高，见图5。

Q-PCR检测miR-1-5p在UC-MSCs中的表达采用Q-PCR法检测miR-1-5p转染UC-MSCs中的miR-1-5p表达水平，结果显示，与未经转染的UC-MSCs相比，转染后UC-MSCs中miR-1-5p的表达显著升高(P < 0.05)，表明miR-1-5p已成功转染UC-MSCs，并在其中表达，见图6。

各组PBMCs中IL-17A的表达，见表2，图7A。各组PBMCs中Foxp3的表达，见表2，图7B。统计基因水平各组PBMCs中Th17/Treg细胞比例，见表2，图7C。

各组PBMCs中IFN-γ的表达，见表3，图8A。 各组PBMCs中IL-4的表达，见表3，图8B。 统计基因水平各组PBMCs中Th1/Th2细胞比例，见表3，图8C。

各组PBMCs中Th17细胞的分化情况 Th17细胞流式检测图，见图9。

Th17细胞占CD4+T细胞的百分率，见表4，图10A。 Treg细胞占CD4+T细胞的百分率，见表4，图10B。 各组Th17/Treg细胞比例见表4，图10C。

各组PBMCs中Treg细胞的分化情况 Treg细胞流式检测图，见图11。

各组PBMCs中Th1细胞的分化情况 Th1细胞流式检测图，见图12。

Th1细胞占CD4+T细胞的百分率，见表5，图13A。 Th2细胞占CD4+T细胞的百分率，见表5，图13B。 各组Th1/Th2细胞比例见表5，图13C。

Th2细胞流式检测图，见图14。

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引言

系统性红斑狼疮是一种以T细胞功能异常、B细胞产生大量自身抗体为特征的多系统受累和器官损害为特征的自身免疫性疾病，目前系统性红斑狼疮的发病机制尚不完全清楚[1]。越来越多的证据表明，T细胞稳态的失衡在系统性红斑狼疮的发展中起着至关重要的作用，有研究指出辅助性T细胞1(T helper cell 1，Th1)和辅助性T细胞2(T helper cell 2，Th2)以及辅助性T细胞17(T helper cell 17，Th17)和调节性T细胞(regulatory T cells，Tregs)比例的失衡是系统性红斑狼疮发病机制的基础[2-3]。已有大量研究证实在系统性红斑狼疮中Th1/Th2、Th17/Treg的比值升高，平衡受到破坏，导致促炎反应增强[4-6]。初始CD4+T细胞经刺激后可分化为Th1、Th2、Th17、Treg等细胞亚群，Th1可分泌干扰素γ(interferon-γ，IFN-γ)并参与细胞免疫，Th2可分泌白细胞介素4 (interleukin-4，IL-4)并参与体液免疫[7]。Th17可分泌白细胞介素17A(interleukin-17A，IL-17A)，并在系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病的发生发展中起着关键作用[8]。Treg细胞具有免疫抑制功能，在诱导和维持自身免疫耐受中发挥重要作用，Treg细胞的减少和功能障碍与系统性红斑狼疮的发生发展密切相关[9]。间充质干细胞是一群具有多向分化潜能和免疫调节功能的多能干细胞。脐带间充质干细胞(umbilical cord-mesenchymal stem cells，UC-MSCs)具有来源充足、取材方便、培养简单等特点，在临床研究上较骨髓间充质干细胞更具有伦理学和安全性优势[10]。有研究发现UC-MSCs可以在系统性红斑狼疮患者的体内和体外上调Treg细胞水平，下调Th17细胞水平[11]。近年来有很多关于基因修饰间充质干细胞治疗多种疾病的研究，发现其在放射性肝损伤[12]、骨组织修复[13]、神经系统疾病中的治疗作用[14]。 miRNA属于非编码小分子RNA，在进化上高度保守，与机体的免疫调节密切相关[15]。miR-1最初被发现表达于心肌和骨骼肌细胞，因此被认为是一种肌肉特异性miRNA。hsa-miR-1-1 和 hsa-miR-1-2两种miRNAs组成hsa-miR-1家族[16-17]。miR-1在细胞核和细胞质中进行生物合成，编码miRNA的基因在细胞核中转录生成初始miRNA(primary miRNA，pri-miRNA)，初始miRNA被RNase Ⅲ内切酶加工成前体miRNA(precursor miRNA，pre-miRNA)，前体miRNA在细胞质中转化为成熟的miRNA[18]。近年来多项研究发现，miR-1在许多肿瘤中存在异常表达，如胃癌[19]、肺癌[20]、肝癌[21]、膀胱癌等癌症中[22]，miR-1的表达均下调，发挥抑癌基因的作用。LIU等[23]研究发现miR-1可以通过抑制CLTC1基因，调节肿瘤巨噬细胞的吞噬功能。TIAN等[24]研究发现急性哮喘患儿外周血中miR-1的表达水平明显低于非哮喘患儿，推测miR-1表达下调可能导致Th1/Th2细胞比例失衡，在诱导免疫反应中发挥重要作用。
目前已发现多种 miRNA 在自身免疫性疾病中异常表达，其中miR-1在多发性肌炎中呈低表达[25]，miR-1-3p是与系统性红斑狼疮易感基因相关的miRNA之一[26]。因此，作者推测miR-1可能在系统性红斑狼疮的治疗中发挥作用，文中选择hsa-miR-1-5p(NCBI Gene ID：4603，GenBank Accession：NM_001080416)序列为ACA UAC UUC UUU AUA UGC CCA U进行研究。该研究利用hsa-miR-1-5p mimic转染 UC-MSCs，探索hsa-miR-1-5p过表达是否能提高 UC-MSCs对系统性红斑狼疮T淋巴细胞亚群的免疫调控作用，对系统性红斑狼疮的治疗起到协同作用。

材料方法

1.1 设计体外细胞学实验。
1.2 时间及地点实验于2019年6月至2020年1月在包头医学院第一附属医院中心实验室完成。
1.3 材料新生儿脐带由包头医学院第一附属医院妇产科提供，足月顺产或剖宫产健康产妇，产妇及家属知情同意。选取包头医学院第一附属医院风湿免疫科处于疾病活动期的30-60岁系统性红斑狼疮女性患者和健康体检者各8例，系统性红斑狼疮的诊断均符合美国风湿病学会ACR 1997年推荐的系统性红斑狼疮分类标准。所有患者经过知情同意后获取外周血标本，该研究获得包头医学院第一附属医院医学伦理委员会批准。
该研究选取了处于疾病活动期的系统性红斑狼疮疾病患者：补体C3正常值范围0.8-1.55 g/L，选取的8例患者小于正常值，补体低下；血沉正常值范围：< 15-20 mm/h，选取的8例患者大于正常值，血沉加快；C-反应蛋白正常值范围：≤ 10 mg/L，选取的8例患者大于正常值，大部分患者轻度升高；抗ds-DNA正常值范围：0-100 IU/mL，选取的8例患者明显高于正常值；选取的8例患者抗核抗体(ANA)呈阳性，均处于疾病活动期。
实验试剂与仪器：DMEM/F12培养基、OPTI培养基、胎牛血清、双抗、胰蛋白酶、磷酸盐缓冲液购自美国 Gibco公司；CD105-FITC、CD90-FITC、CD44-PE、CD34-PE、CD11c-PE、CD45-FITC5、同型对照流式抗体购自BD公司；钙盐染色液、油红O染色液购于索莱宝科技有限公司；人外周血淋巴细胞分离液购自灏洋生物制品科技有限公司；mirVanaTM miRNA Mimic、miR-1 positive control、Lipofectamine® RNAiMAX Reagent、Red Fluorescent Control、Trizol Reagent购自Themor Fisher公司；PMA/Ionomycin mixture(250X)(佛波酯/离子霉素混合物)、BFA/Monensin Mixture(250X)(布雷非德菌素A/莫能霉素混合物)购自联科生物；细胞内固定和破膜缓冲液组合、Foxp3/转录因子染色液组合试剂盒、CD4单克隆抗体、CD25单克隆抗体、FOXP3单克隆抗体、IL-17A单克隆抗体、IFN-γ单克隆抗体、IL-4单克隆抗体购自eBioscience公司；miRNA第一链cDNA合成(茎环法)试剂盒购自上海生工；RT-PCR kit试剂盒、SYBR Green Realtime PCR Master Mix购自东洋纺生物科技有限公司；定量PCR反应扩增仪(ABI公司)。
1.4 方法
1.4.1 UC-MSCs的分离培养无菌条件下，取健康足月顺产或剖宫产新生儿脐带组织，在超净台内用含两性霉素B的PBS反复洗涤去除残血，并剔除脐动静脉，留下Wharton胶样组织。用组织剪将其剪碎至1 mm3大小，接种于含有DMEM/F12(含体积分数为10%胎牛血清，1%双抗)培养基的培养皿中，置于37 ℃、体积分数为5%CO2孵箱内培养，每三四天换液1次，待细胞长至90%融合时，胰蛋白酶消化传代培养，取2代UC-MSCs用于后续实验。
1.4.2 流式细胞术鉴定UC-MSCs 取第2代UC-MSCs，胰酶消化制成单细胞悬液，分别加入鼠抗人CD105、CD90、CD44、CD34、CD11c、CD45单克隆抗体各4 μL，室温避光孵育30 min，洗涤并重悬于PBS中，用流式细胞仪检测其表面标志蛋白的表达。
1.4.3 UC-MSCs分化能力检测取60%-70%融合的长势良好的第2代UC-MSCs，更换诱导分化培养液，每3 d换液1次，培养 21 d后进行染色。
向成骨细胞诱导分化：移除培养基，用PBS洗2次，用茜素红S染色液滴染2 min，稍水洗后McGee-Russell分化液迅速分化数秒，Mayer苏木精染色液浅染胞核2 min，PBS浸洗重复3次，1 mL PBS覆盖细胞，显微镜下观察。
向成脂细胞诱导分化：移除培养基，用PBS洗2次，加ORO Fixative固定液固定20 min，蒸馏水洗2次，60%异丙醇浸洗5 min，弃去60%异丙醇加入配好的ORO Stain 10 min，弃去染色液，水洗3次，加入Mayer苏木精染色液复染核2 min，弃去染液后水洗3次，加ORO Buffer 1 min后弃去，1 mL PBS覆盖细胞，显微镜下观察。

1.4.4 miR-1-5p转染效率测定取第2代UC-MSCs接种于24孔板，待细胞融合至60%-80%进行转染，转染前用OPTI培养基润洗2遍，每孔按3 μL Lipofectamine® RNAiMAX Reagent和50 μL OPTI培养基混合稀释，每孔分别按浓度梯度为5，7，10，15 nmol/L的Red Fluorescent Control miRNA和50 μL OPTI培养基混合稀释，将稀释后的Red Fluorescent Control miRNA加入稀释后的Lipofectamine® RNAiMAX Reagent (1∶1比例)，室温孵育5 min，将RNA-脂质体混合物加入24孔板对应孔中，按24，48，72 h的时间梯度进行转染。通过流式细胞仪检测不同浓度梯度和时间梯度下的转染效率。

1.4.5 UC-MSCs与外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)共培养用密度梯度离心法分离系统性红斑狼疮患者PBMCs：将2 mL全血与2 mL PBS等体积混匀后，缓慢加入淋巴细胞分离液上层，在2 000 r/min条件下离心20 min，吸管吸取离心后的中间白膜层加入到离心管中，加PBS吹打混匀，1 500 r/min离心7 min，弃上清，再加PBS吹打混匀，1 000 r/min离心4 min，弃上清。取第2代UC-MSCs，以2×105/孔的密度接种于24孔板，在最佳转染效率下进行转染，以1×106/孔的密度加入PBMCs与之进行直接共培养48 h。实验分组：miR-1-5p转染 UC-MSCs与PBMCs共培养组(UC-MSCs+miR-1组)，miRNA阴性对照转染UC-MSCs与PBMCs共培养组(UC-MSCs+miR-NC组)，UC-MSCs与PBMCs共培养组(UC-MSCs组)以及PBMCs组。

1.4.6 实时荧光定量PCR检测相关基因的表达用TRIzol试剂获取细胞总RNA，检测miR-1-5p在系统性红斑狼疮患者、健康人群PBMCs以及UC-MSCs中的表达，使用miRNA第一链cDNA合成(茎环法)试剂盒将RNA反转录为cDNA；检测各组系统性红斑狼疮患者PBMCs中Foxp3、IL-17A、IFN-γ、IL-4的表达，使用ReverTra Ace qPCR RT Kit试剂盒将RNA反转录为cDNA，用特异引物和SYBR Green Realtime PCR Master Mix试剂盒于定量PCR反应扩增仪进行定量检测，最后结果以2-ΔΔCt分析相对表达。miR-1-5p、IL-17A、Foxp3、IFN-γ、IL-4的引物序列，见表1。
1.4.7 流式细胞术检测T淋巴细胞亚群的分化情况利用佛波酯/离子霉素混合物刺激PBMCs，布雷非德菌素A/莫能霉素混合物阻断细胞内因子的分泌，收集共培养的PBMCs，DPBS洗涤2次后，用CD4、CD25单抗对细胞表面进行标记染色，4 ℃避光孵育30 min；DPBS洗涤1次，离心弃上清，加入固定破膜液并涡旋混匀，4 ℃避光孵育30 min，加入透化液，1 300 r/min离心5 min弃上清；在剩余体积的透化液中重悬沉淀，加入1 μL Foxp3、IL-17A、IFN-γ、IL-4单抗进行胞内标记染色，室温避光孵育30 min；加入透化液，1 300 r/min离心5 min弃上清，将细胞重悬于400 μL流式染色液中，流式细胞术检测T淋巴细胞亚群的分化情况，其中CD4+CD25+Foxp3+代表Treg细胞亚群，CD4+IL-17+代表Th17细胞亚群，CD4+IFN-γ+代表Th1细胞亚群，CD4+IL-4+代表Th2细胞亚群。
1.5 主要观察指标 ①miR-1-5p在健康人群和系统性红斑狼疮患者外周血PBMCs中的表达；②脐带间充质干细胞在显微镜下的形态、表面抗原鉴定及成骨成脂诱导后的分化情况；③流式细胞术检测miR-1-5p的转染效率；④Q-PCR检测miR-1-5p在转染后UC-MSCs中的表达；⑤Q-PCR检测各组系统性红斑狼疮患者PBMCs中IL-17A、Foxp3、IFN-γ、IL-4的表达；⑥流式细胞术检测各组系统性红斑狼疮患者PBMCs中Th1/Th2/Th17/Treg细胞的比例。
1.6 统计学分析使用SPSS 23.0统计软件进行数据分析，符合正态分布的数据用x±s表示，各组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，组间多重比较用LSD-t法，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

间充质干细胞是来源于发育早期中胚层的一群具有自我更新、增殖、多向分化潜能的干细胞。间充质干细胞具有低免疫原性，可促进组织损伤修复，通过与细胞直接接触或分泌可溶性因子调节免疫反应，因此在血液系统疾病、神经系统疾病、心血管疾病以及自身免疫性疾病的治疗中显示出巨大的潜力[31-32]。ZHOU等[33]通过荟萃分析发现骨髓间充质干细胞可能会成为治疗系统性红斑狼疮的一种有效手段。WANG等[34]的多中心临床研究利用脐带间充质干细胞移植治疗活动期和难治性系统性红斑狼疮，对40例活动期系统性红斑狼疮患者进行12个月的随访，SLEDAI评分在随访3，6，9，12个月时明显下降，血清白蛋白和补体C3水平在移植治疗后升高，6个月时达到峰值，血清抗核抗体和抗双链DNA抗体均下降，随访3个月时差异有显著性意义，说明同种异体脐带间充质干细胞移植治疗系统性红斑狼疮患者的临床疗效满意，有较好的安全性和有效性。此外，间充质干细胞移植治疗系统性红斑狼疮的并发症也有较好的效果。GU等[35]在一项单中心临床试验中，利用骨髓间充质干细胞或脐带间充质干细胞治疗81例疾病活动期的难治性狼疮肾炎患者，进行12个月的定期随访，结果显示60.5%的患者病情得到缓解，肾功能明显改善，SLEDAI评分在治疗后明显降低。LI等[36]对35例患有难治性血细胞减少症的系统性红斑狼疮患者进行间充质干细胞移植治疗，结果显示大多数患者的血细胞计数在治疗后有显著改善，提示间充质干细胞对累及血液系统的系统性红斑狼疮患者有治疗作用。该文章为基于基因修饰的脐带间充质干细胞治疗系统性红斑狼疮患者的基础性研究，为间充质干细胞在临床治疗上的应用提供实验依据和理论基础。 miRNAs是一类长度约为22个核苷酸的非编码小分子RNA，通过与目标mRNA的 3′非翻译区(3′-UTR)结合使RNA降解或抑制蛋白翻译，在转录后水平调控基因的表达[37]。miRNAs调节大约90%的蛋白质编码基因，并在各种生物学过程中发挥核心作用，包括细胞的分化、增殖、凋亡以及免疫稳态的维持。目前研究较深入的是miRNAs在肿瘤和自身免疫性疾病中的作用，已经发现系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、干燥综合征、系统性硬化症等自身免疫性疾病中miRNA的表达水平变化[38]。如LIU等[39]研究发现系统性红斑狼疮患者CD3+T细胞中miRNA-410的表达水平低于健康对照组，miRNA-410通过直接靶向系统性红斑狼疮患者CD3+T细胞中的STAT3基因，抑制STAT3磷酸化，从而调控STAT3的失活。LI等[40]研究发现miR-153-3p在系统性红斑狼疮患者中表达上调，过表达miR-153-3p削弱了UC-MSCs在MRL/lpr小鼠中的治疗作用。由此可见，不同的miRNA在系统性红斑狼疮中的作用不同。miR-1最早被发现特异性表达于心肌细胞和骨骼肌细胞，通过靶向组蛋白去乙酰化酶4促进肌肉分化，在控制骨骼肌细胞增殖和分化方面起到重要作用[41]，同时miR-1也在胚胎干细胞和心肌细胞的发育中发挥重要作用，它与肌钙蛋白、Nkx2.5、血清反应因子等许多转录因子的表达有关，参与心脏疾病的发生发展[42]。大量研究已经证明miR-1和许多肿瘤的发生发展密切相关，但miR-1在自身免疫性疾病中的研究相对较少，近年来miR-1在特发性炎症性肌病中的异常表达逐渐被发现，PARKES等[43]研究证实在特发性炎症性肌病中增加的炎性细胞因子通过激活NF-κB通路，下调miR-1的表达，从而抑制成肌细胞分化。该研究结果显示，系统性红斑狼疮患者PBMCs中miR-1-5p的表达与健康对照组相比显著降低。因此作者推测，是否可以通过miR-1-5p修饰脐带间充质干细胞，加强其对系统性红斑狼疮的免疫调节作用。
Th17细胞具有促炎效应，在系统性红斑狼疮患者中Th17细胞比例较高，且一般与疾病活动性呈正相关[44]。Treg细胞已经被证实在维持免疫稳态和预防自身免疫性疾病中起着重要作用，Treg细胞的分化或功能缺陷与包括系统性红斑狼疮在内的多种人类自身免疫性疾病有关[45]。该实验结果显示，UC-MSCs 和miR-1-5p转染的UC-MSCs分别与系统性红斑狼疮患者 PBMCs共培养后，均在基因水平显著上调了Th17/Treg细胞比例，提示UC-MSCs和miR-1-5p修饰的UC-MSCs均可以调节系统性红斑狼疮患者Th17/Treg的免疫失衡。另外，该研究中q-PCR结果显示，miR-1-5p修饰的UC-MSCs与系统性红斑狼疮患者PBMCs共培养组和未处理的系统性红斑狼疮 PBMCs组相比，Foxp3基因的表达显著上调，而未经miR-1-5p修饰的UC-MSCs与系统性红斑狼疮患者PBMCs共培养组和未处理的系统性红斑狼疮患者PBMCs组相比，Foxp3基因的表达趋势虽有上调，但差异无显著性意义。以上结果也表明，miR-1-5p基因修饰UC-MSCs后，对系统性红斑狼疮患者PBMCs 中Treg细胞亚群分化的调节起到了协同作用。流式细胞术结果也显示，miR-1-5p修饰的UC-MSCs与系统性红斑狼疮患者PBMCs共培养组和未处理的系统性红斑狼疮患者PBMCs组相比，Treg细胞占CD4+T细胞的比例显著上调，与q-PCR实验结果一致，说明miR-1-5p可以通过修饰UC-MSCs，上调系统性红斑狼疮患者PBMCs中Treg细胞比例，加强对Th17/Treg细胞比例失衡的免疫调节作用。
系统性红斑狼疮患者PBMCs中Th1表达上调，导致Th1/Th2免疫失衡，在其发病机制中起着重要的作用。该研究通过q-PCR法分析发现，miR-1-5p转染UC-MSCs与系统性红斑狼疮患者 PBMCs共培养组和未处理的系统性红斑狼疮患者 PBMCs组相比，Th1/Th2细胞比例显著降低，未经修饰的UC-MSCs对Th1/Th2细胞比例有下调作用，但差异无显著性意义，说明miR-1-5p可能加强了UC-MSCs对系统性红斑狼疮患者Th1/Th2比例失衡的调节作用，在基因水平改善了系统性红斑狼疮患者Th1/Th2的免疫失衡状态。流式检测结果显示，UC-MSCs和miR-1-5p修饰的UC-MSCs对系统性红斑狼疮患者 PBMCs中Th1/Th2细胞比例均有下调趋势，但各组Th1/Th2细胞比例差异无显著性意义，考虑与转录翻译过程、蛋白的半衰期和合成速度等诸多影响因素有关[46]。
JAK/STAT信号通路的失调与多种自身免疫性疾病有关，过去已有很多研究证实，系统性红斑狼疮的发病机制与JAK/STAT3信号通路的激活有关，Foxp3基因对Treg细胞的发育至关重要，在炎症条件下，STAT3 可以通过与Foxp3启动子结合，减弱其表达，从而抑制Treg细胞的分化[47-49]。该研究已经证实UC-MSCs经miR-1-5p修饰后，加强了其对系统性红斑狼疮患者 Treg细胞的免疫调节作用，可以促进Treg细胞的分化和增殖，但其机制尚不明确。有研究表明miRNA可以通过靶向调控STAT3基因的表达而参与系统性红斑狼疮的发病[39，50]，ZUO等[51]研究证实miR-1的启动子区含有STAT结合位点，LI等[52]研究发现miR-1-3p通过靶向ETS1基因的表达，调控多发性硬化患者Th17细胞的分化。因此，miR-1-5p是否通过与STAT3 mRNA 的3′-UTR 区结合，调控JAK/STAT3信号通路，影响Treg细胞的分化和增殖，或通过作用于靶基因影响Th17细胞分化，进而调节Th17/Treg的免疫失衡是下一步要深入研究的内容。
综上所述，作者发现系统性红斑狼疮患者PBMCs中miR-1-5p的表达下调，miR-1-5p修饰的UC-MSCs对系统性红斑狼疮患者Treg细胞具有免疫调节作用。过表达miR-1-5p可以促进系统性红斑狼疮患者Treg细胞的分化和增殖，miR-1-5p通过上调Treg细胞的表达，调节Th17/Treg的免疫失衡，同时也调节Th1/Th2的免疫失衡。这些结果均提示miR-1-5p修饰的UC-MSCs对系统性红斑狼疮患者 T淋巴细胞亚群具有免疫调节作用，为治疗系统性红斑狼疮提供了新思路。但miR-1-5p促进系统性红斑狼疮患者Treg细胞分化，以及调节Th17/Treg和Th1/Th2失衡的机制有待深入研究。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

miR-1-5p修饰脐带间充质干细胞对系统性红斑狼疮T淋巴细胞亚群的免疫调节

Immunomodulatory effects of umbilical cord-mesenchymal stem cells modified by miR-1-5p on T lymphocyte subsets in systemic lupus erythematosus

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