骨碎补影响破骨细胞分化的程度与含药血清浓度有关

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2777

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (29): 4620-4625.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2777

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骨碎补影响破骨细胞分化的程度与含药血清浓度有关

许金松，邓娜，张潇

濮阳市安阳地区医院骨一科，河南省安阳市 455000

收稿日期:2019-11-11 修回日期:2019-11-15 接受日期:2019-12-16 出版日期:2020-10-18 发布日期:2020-09-12
作者简介:许金松，男，1978年生，河南省鲁山县人，汉族，2002年新乡医学院毕业，副主任医师，主要从事关节、脊柱的研究。
基金资助:
2018年度河南省科技攻关目录(182102310463)

Effect of Rhizoma Drynariae on osteoclast differentiation is related to the concentration of drug-containing serum

Xu Jinsong, Deng Na, Zhang Xiao

Department of Orthopedics, Anyang District Hospital of Puyang City, Anyang 455000, Henan Province, China

Received:2019-11-11 Revised:2019-11-15 Accepted:2019-12-16 Online:2020-10-18 Published:2020-09-12
About author:Xu Jinsong, Associate chief physician, Department of Orthopedics, Anyang District Hospital of Puyang City, Anyang 455000, Henan Province, China
Supported by:
the 2018 Science and Technology Research Catalog of Henan Province, No. 182102310463

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

活化T细胞核因子1：属于NFAT家族重要成员之一，是破骨细胞分化形成中的重要转录因子，活化T细胞核因子1激活后可由细胞质转位至细胞核，在此过程中c-Fos/AP1信号通路起关键作用。CTSK、抗酒石酸酸性磷酸酶是破骨细胞特异性蛋白，活化T细胞核因子1活化的同时，可将CTSK、抗酒石酸酸性磷酸酶转录出细胞核，促进破骨细胞分化。

中药含药血清：是指动物灌胃给予中药或单体制剂，经吸收进入血液循环，在一定时间内采取血液，分离所得血清，必定还有一定量的该药物成分，可反映机体真实血药浓度；将此血清进行体外细胞培养体系，可观察体外药理作用。

背景：已有报道骨碎补总黄酮有防治骨质疏松症的效果，但其作用机制多集中于对成骨细胞的作用，而对破骨细胞分化的影响研究较少。

目的：探讨骨碎补通过活化T细胞核因子1信号通路对破骨细胞分化的影响。

方法：40只SD大鼠随机分为4组，分别以0，11.6，34.8，104.4 g/kg的骨碎补总黄酮灌胃，获得阴性对照血清及低、中、高浓度含药血清。另取5周龄大鼠分离获取骨髓巨噬细胞，采用CCK-8法检测不同含药血清对巨噬细胞活性的影响；取巨噬细胞分为低、中、高浓度组、阴性对照组、空白组，每孔5个复孔，分别加入低、中、高浓度含药血清、阴性对照血清培养液、正常培养液；所有培养液均用20 μg/L巨噬细胞集落刺激因子、100 μg/L核因子κB受体活化因子配体进行破骨细胞诱导分化。诱导分化7 d，抗酒石酸酸性磷酸酶染色检测破骨细胞数、融合指数，实时荧光定量PCR、Western blot检测各组细胞c-Fos、Fra-1、Fra-2、活化T细胞核因子1、组织蛋白酶KmRNA和蛋白表达；诱导分化14 d，骨片吸收陷窝试验检测破骨细胞骨吸收陷窝数、陷窝面积占比。实验方案经濮阳市安阳地区医院动物实验伦理委员会批准，批准号为PYSAYDQ-2019096。

结果与结论：①不同浓度骨碎补含药血清对巨噬细胞活性影响无明显变化；②诱导分化前巨噬细胞形态规则，诱导分化后行抗酒石酸酸性磷酸酶染色证实为破骨细胞；③与空白组、阴性对照组比较，低、中、高浓度组破骨细胞数、融合指数、骨吸收陷窝数、陷窝面积占比、c-Fos、Fra-1、Fra-2、活化T细胞核因子1、组织蛋白酶K mRNA和蛋白相对表达量均明显降低(P < 0.05)，且上述指标均随骨碎补含药血清浓度升高呈降低趋势：低浓度组>中浓度组>高浓度组，各浓度组间比较差异均有显著性意义(P < 0.05)；④结果说明，骨碎补可能通过活化T细胞核因子1信号通路抑制大鼠巨噬细胞向破骨细胞的分化，且分化抑制程度与骨碎补含药血清浓度有关。

ORCID: 0000-0003-3948-4631(许金松)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 骨碎补, 活化T细胞核因子1, 破骨细胞, 分化, 抑制

Abstract:

BACKGROUND: Total flavonoids of Rhizoma Drynariae can be used to prevent and treat osteoporosis, but its mechanism of action is mostly focused on osteoblasts rather than osteoclast differentiation.

OBJECTIVE: To investigate the effect of Rhizoma Drynariae on osteoclast differentiation through T-cell nuclear factor 1 (NFATc1) signaling pathway.

METHODS: Forty Sprague-Dawley rats were randomly divided into four groups. Total flavonoids of Rhizoma Drynariae were intragastrically administered at 0, 11.6, 34.8 and 104.4 g/kg, respectively. Control serum and low-, middle-, high-concentration drug-containing sera were obtained. Bone marrow macrophages were isolated from 5-week-old rats and the effects of different drug-containing sera on macrophage activity were detected by cell counting kit-8 method. The macrophages were divided into low-, middle- and high-concentration groups, negative control group and blank group, with 5 multiple holes in each well. The low, middle and high concentration of drug-containing serum, negative control serum culture medium and normal culture medium were added respectively. All culture media were used to induce osteoclast differentiation with 20 μg/L macrophage colony-stimulating factor and 100 μg/L receptor activator of nuclear factor kappa B ligand. The number of osteoclasts and fusion index were detected by tartrate-resistant acid phosphatase staining 7 days after induction of differentiation. The expressions of c-Fos, Fra-1, Fra-2, NFATc1 and cathepsin K were detected by real-time fluorescence quantitative PCR and western blot at 7 days after differentiation. The number of bone resorption lacunae and the proportion of lacunae area in osteoclasts after 14 days of differentiation were detected by bone fragment absorption lacunae test. The study protocol was approved by the Animal Experiment Ethics Committee of Anyang District Hospital of Puyang City with approval No. PYSAYDQ-2019096.

RESULTS AND CONCLUSION: Cell counting kit-8 results showed that there was no significant change in macrophage activity after intervention with different concentration of sera containing Rhizoma Drynariae. The morphology of macrophages was regular before differentiation. After differentiation, osteoclasts were identified by tartrate-resistant acid phosphatase staining. Compared with the blank group and negative control group, the number of osteoclasts, fusion index, number of bone resorption lacunae and proportion of lacunae area and the relative expressions of c-Fos, Fra-1, Fra-2, NFATc1, cathepsin K mRNA and protein in the low-, middle- and high-concentration groups decreased significantly (P < 0.05). The above indicators showed a decreasing trend with the increase of serum concentration of Rhizoma Drynariae: low-concentration group > middle-concentration group > high-concentration group, and there were significant differences between different concentration groups (P < 0.05). In conclusion, Rhizoma Drynariae may inhibit the differentiation of rat macrophages into osteoclasts through NFATc1 signaling pathway, and the degree of differentiation inhibition is related to the serum concentration of Rhizoma Drynariae.

Key words: Rhizoma Drynariae, nuclear factor-activated T cell 1, osteoclast, differentiation, inhibition

中图分类号:

许金松, 邓娜, 张潇. 骨碎补影响破骨细胞分化的程度与含药血清浓度有关[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(29): 4620-4625.

Xu Jinsong, Deng Na, Zhang Xiao. Effect of Rhizoma Drynariae on osteoclast differentiation is related to the concentration of drug-containing serum[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(29): 4620-4625.

图/表（结果） 9

1.4.7 c-Fos、Fra-1、Fra-2、活化T细胞核因子1、CTSK mRNA表达检测取诱导分化7 d的各组细胞，Trizol法提取细胞内总RNA，反转录试剂盒获得cDNA，应用SYBR Premix Ex Taq试剂盒进行实时荧光定量PCR扩增目的基因，以GAPDH为内参基因，根据熔解曲线分析目的基因扩增情况，以2^-^??Ct表示目的基因的相对表达强度，引物序列见表1。

2.1 不同时刻CCK实验A值比较 CCK实验结果显示，不同浓度骨碎补含药血清对巨噬细胞活性无明显影响，干预24，48，72 h时CCK试验A值组间比较，差异均无显著性意义(P > 0.05)。见表2。

2.2 巨噬细胞诱导分化前后形态学观察诱导分化前巨噬细胞形态规则，诱导分化后行抗酒石酸酸性磷酸酶染色，可见细胞体积较大、有伪足、突起等不规则特征，细胞质酶活性部位呈红色，细胞核为多核，证实为破骨细胞。见图1。

2.3 破骨细胞数、融合指数比较破骨细胞数、融合指数组间比较，差异均有显著性意义(P < 0.05)；与空白组、阴性对照组比较，低、中、高浓度组破骨细胞数、融合指数均明显降低(P < 0.05)，且破骨细胞数、融合指数随骨碎补含药血清浓度升高呈降低趋势(P < 0.05)；空白组与阴性对照组比较，差异无显著性意义(P > 0.05)。见表3，图2。

2.4 破骨细胞骨吸收陷窝数、陷窝面积占比比较骨吸收陷窝数、陷窝面积占比组间比较，差异均有显著性意义(P < 0.05)；与空白组、阴性对照组比较，低、中、高浓度组骨吸收陷窝数、陷窝面积占比均明显降低(P < 0.05)，且骨吸收陷窝数、陷窝面积占比随骨碎补含药血清浓度升高呈降低趋势(P < 0.05)；空白组与阴性对照组比较，差异无显著性意义(P > 0.05)。见表4。

2.5 c-Fos、Fra-1、Fra-2、活化T细胞核因子1、CTSK mRNA表达量比较 c-Fos、Fra-1、Fra-2、活化T细胞核因子1、CTSK mRNA相对表达量组间比较，差异均有显著性意义(P < 0.05)；与空白组、阴性对照组比较，低、中、高浓度组c-Fos、Fra-1、Fra-2、活化T细胞核因子1、CTSK mRNA相对表达量占比均明显降低(P < 0.05)，且随骨碎补含药血清浓度升高呈降低趋势(P < 0.05)；空白组与阴性对照组比较，差异无显著性意义(P > 0.05)。见表5。

2.6 c-Fos、Fra-1、Fra-2、活化T细胞核因子1、CTSK蛋白表达量比较 c-Fos、Fra-1、Fra-2、活化T细胞核因子1、CTSK蛋白相对表达量组间比较，差异均有显著性意义(P < 0.05)；与空白组、阴性对照组比较，低、中、高浓度组c-Fos、Fra-1、Fra-2、活化T细胞核因子1、CTSK蛋白相对表达量占比均明显降低(P < 0.05)，且随骨碎补含药血清浓度升高呈降低趋势(P < 0.05)；空白组与阴性对照组比较，差异无显著性意义(P > 0.05)。见表6，图3。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2017年3月至2019年2月在濮阳市安阳地区医院完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物获取细胞用5周龄SPF级雄性SD大鼠4只，体质量(150±10)g；制备含药血清用3月龄SPF级SD雄性大鼠40只，体质量(400±20)g，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK(京)2016-0001。

1.3.2 药物、主要试剂和仪器骨碎补总黄酮(北京岐黄制药有限公司，国药准字Z20020002，每1 g含生药66.67 g)。DMEM培养基、胎牛血清(美国Gibco公司)，重组核因子κ B受体活化因子配体蛋白(美国R&D公司)，CCK-8试剂盒(日本Dojindo公司)，反转录试剂盒(日本Takara公司)，BCA蛋白定量分析试剂盒(美国Thermo Fisher公司)，兔抗大鼠c-Fos、Fra-1、Fra-2、T-细胞核因子1(nuclear factor-activated T cell 1，NFATc1)、组织蛋白酶K(cathepsin K，CTSK)多抗、山羊抗兔c-Fos、Fra-1、Fra-2、活化T细胞核因子1、CTSK多抗(美国Abcam公司)；StepOne Puls Real Time PCR仪(美国ABI公司)，680型酶标仪、CheniDoc XRS凝胶成像分析系统(美国Bio-rad公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 骨碎补总黄酮含药血清制备取3月龄SD大鼠40只，随机分为4组，各10只，低、中、高浓度组分别灌胃11.6，34.8，104.4 g/kg骨碎补总黄酮(低浓度组剂量为人-大鼠体表面积折算后剂量^[6]，中、高浓度组按照3倍、9倍低浓度组的剂量)，阴性对照组灌胃等体积生理盐水，1次/d，连续灌胃2周，末次灌胃2 h后乙醚麻醉，腹主动脉取血，3 000 r/min离心10 min取上层血清，经56 ℃、30 min灭活、过滤后分装，-80 ℃保存备用。

1.4.2 大鼠骨髓巨噬细胞分离与培养取5周龄SD雄性大鼠，麻醉脱颈处死后浸泡于体积分数75%的乙醇5 min，无菌条件分离股骨和胫骨，剪断两骨骺端，无菌注射器吸取α-MEM培养液(含10^-8 mol/L 1α-25羟维生素D3、体积分数10%胎牛血清、1%青链霉素)1 mL，反复冲洗骨髓腔获得骨髓细胞，400目滤网过滤，Tris-NH₄Cl去红，接种至24孔板，每孔2 mL，于37 ℃、体积分数5% CO₂、饱和湿度条件下培养24 h，吸出未黏附细胞悬液，重新接种于α-MEM培养液，加入20 μg/L巨噬细胞集落刺激因子细胞因子诱导孵育2 d，再次吸出悬浮细胞接种，之后隔2 d换液1次，7 d后获得纯化巨噬细胞。

1.4.3 不同浓度含药血清对巨噬细胞活性影响取巨噬细胞按照1×10⁴个/孔接种于96孔板，分为低、中、高浓度组、阴性对照组，每孔5个复孔，过夜后分别加入相应浓度骨碎补含药大鼠血清、阴性对照组培养液，所有细胞培养液中均含有20 μg/L 巨噬细胞集落刺激因子细胞因子，干预24，48，72 h后，各组分别加入10 μL CCK-8检测液，继续孵育4 h后，于酶标仪上检测450 nm波长处吸光度(A)值。

1.4.4 分组、干预及诱导分化取巨噬细胞按照1.5×10⁵个/孔接种于48孔板，分为低、中、高浓度组、阴性对照组、空白组，每孔5个复孔，过夜贴壁生长后，分别加入低、中、高浓度含药血清、阴性对照血清培养液、正常培养液，所有培养液均含20 μg/L巨噬细胞集落刺激因子、100 μg/L 核因子κB受体活化因子配体进行破骨细胞诱导分化，隔半天半量换液。

1.4.5 抗酒石酸酸性磷酸酶染色诱导分化前、诱导分化7 d后，应用抗酒石酸酸性磷酸酶染色试剂盒进行染色，倒置显微镜下随机取5个视野，计数破骨细胞数(细胞核≥3个)及抗酒石酸酸性磷酸酶阳性细胞数(细胞浆呈红色不溶性沉淀，细胞核未染色)，计算融合指数=破骨细胞数/抗酒石酸酸性磷酸酶阳性细胞×100%。

1.4.6 骨片吸收陷窝试验取诱导分化14 d各组细胞，弃去上层培养液，PBS轻轻洗1次，1%甲苯胺蓝染色法染色骨片，蒸馏水洗涤后显微镜观察并拍照，图像分析软件测定破骨细胞骨吸收陷窝数、陷窝面积占比(陷窝面积占总面积百分比)。

1.4.7 c-Fos、Fra-1、Fra-2、活化T细胞核因子1、CTSK mRNA表达检测取诱导分化7 d的各组细胞，Trizol法提取细胞内总RNA，反转录试剂盒获得cDNA，应用SYBR Premix Ex Taq试剂盒进行实时荧光定量PCR扩增目的基因，以GAPDH为内参基因，根据熔解曲线分析目的基因扩增情况，以2^-^∆∆Ct表示目的基因的相对表达强度，引物序列见表1。

1.4.8 c-Fos、Fra-1、Fra-2、活化T细胞核因子1、CTSK蛋白相对表达量检测取诱导分化7 d的各组细胞，预冷PBS充分洗涤，加入0.1 mL细胞裂解液，冰盒裂解30 min，离心收集上清液，BCA法进行蛋白定量，取45 μg样品与等量上样缓冲液混匀，沸水浴5 min，离心后再次收集上清液，进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰氨凝胶(SDS-PAGE)电泳，电转仪转至硝酸纤维素膜，加入封闭液摇床孵育2 h，加入封闭液稀释一抗，4 ℃孵育过夜，充分洗涤后加入封闭液稀释二抗，常温孵育1 h，BSA法显影，凝胶成像系统扫描拍照，图像分析软件进行灰度值分析，以目的蛋白与内参蛋白灰度值比值表示蛋白相对表达强度。

1.5 主要观察指标 ①骨碎补含药血清对巨噬细胞活性影响比较；②巨噬细胞诱导分化前后形态学观察；③破骨细胞数、融合指数比较；④破骨细胞骨吸收陷窝数、陷窝面积占比比较；⑤c-Fos、Fra-1、Fra-2、活化T细胞核因子1、CTSK mRNA及蛋白表达量比较。

1.6 统计学分析采用SPSS 19.0统计软件分析处理数据，计量资料以x(_)±s表示，多样本计量资料比较采用单因素方差分析，进一步两两样本比较采用SNK-q检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

骨质疏松症等骨代谢疾病发病原因多种多样，高龄、内分泌紊乱、维生素缺乏、遗传因素等均可导致发病^[7-8]，骨吸收大于骨形成是病情进展的主要表现。生理状态下，机体骨骼系统中成骨细胞和破骨细胞处于动态平衡状态，当前体破骨细胞向破骨细胞过度分化或破骨细胞过度激活时，导致骨吸收过程加速，骨代谢疾病发生^[9-10]。临床主要采用双膦酸盐、氟化物、雌激素、钙制剂及维生素D等药物抑制骨吸收或促进骨形成，但对骨质疏松症等骨破坏相关疾病治疗效果不甚理想，另外由于不良反应不明，且患者对药物耐受性随着年龄增加逐渐降低^[11-12]，开发安全且效果确切的药物对已成为迫切需要。

此次研究应用不同浓度骨碎补总黄酮灌胃大鼠获得其含药血清，将含药血清作用于巨噬细胞发现，与阴性对照血清比较，不同时刻CCK实验A值组间比较无明显差异，说明以11.6-104.4 g/(kg·d)灌胃大鼠2周获得含药血清对巨噬细胞活性无明显影响，提示骨碎补含药血清安全性好。中医学认为，肾藏精而主髓，肾经充足则骨髓生化得源，肾与骨病理及生理关系密切^[13]。骨碎补归经肝、肾，属于中医常用祛风湿强筋骨类中药。骨碎补总黄酮提取自骨碎补干燥根茎，是其有效成分，现代药理学证实其具有促进骨对钙的吸收、改善骨质、调节激素紊乱等多种生物学活性^[14]。临床研究发现，骨碎补总黄酮可有效增强骨质疏松症患者牙槽骨骨密度^[15]，说明骨碎补总黄酮对有利于成骨细胞与破骨细胞间平衡；SONG等^[16]证实骨碎补总黄酮能有效预防后肢卸荷所致骨丢失。上述研究均证实骨碎补总黄酮具有调节成骨细胞与破骨细胞间平衡的作用，同时参与破骨细胞分化进程。此次研究首先验证了骨碎补含药血清的安全性较好，然后将不同浓度含药血清作用于巨噬细胞诱导分化，结果显示各浓度组破骨细胞数、融合指数、骨吸收陷窝数、陷窝面积占比等细胞分化指标均明显降低，且降低程度呈剂量依赖性，提示骨碎补含药血清可有效抑制大鼠巨噬细胞向破骨细胞分化过程，且与骨碎补含药血清浓度有关。

此外，此次研究中将不同浓度骨碎补含药血清作用于巨噬细胞诱导分化，干预后细胞c-Fos、Fra-1、Fra-2、活化T细胞核因子1、CTSK mRNA和蛋白相对表达量均明显降低，且降低程度呈剂量依赖性，提示骨碎补含药血清可能通过抑制阻断c-Fos/活化T细胞核因子1信号通路，进而抑制该通路下游主要靶基因活化T细胞核因子1表达，从而抑制核因子κB受体活化因子配体诱导巨噬细胞向破骨细胞分化，减少破骨细胞生成。破骨细胞形成过程涉及复杂信号调控通路。活化T细胞核因子1属于NFAT家族重要成员之一，是破骨细胞分化形成中的重要转录因子，活化T细胞核因子1激活后可由细胞质转位至细胞核，在此过程中c-Fos/AP1信号通路起关键作用^[17]。CTSK、抗酒石酸酸性磷酸酶是破骨细胞特异性蛋白，活化T细胞核因子1活化的同时，可将CTSK、抗酒石酸酸性磷酸酶转录出细胞核，促进破骨细胞分化^[18-19]。RHO等^[20]研究发现，通过抑制c-Fos基因异位表达及其依赖的活化T细胞核因子1基因表达，可有效抑制破骨细胞分化过程。因此，阻断c-Fos/活化T细胞核因子1信号通路及其下游靶基因活化T细胞核因子1表达，对抑制核因子κB受体活化因子配体诱导巨噬细胞向破骨细胞分化，减少破骨细胞生成有重要意义。

综上所述，骨碎补可能通过活化T细胞核因子1信号通路抑制大鼠巨噬细胞向破骨细胞的分化，且分化抑制程度与骨碎补含药血清浓度有关，为临床骨碎补相关药物的研发及应用于骨质疏松症及其他骨代谢相关疾病的治疗提供理论支持，但其是否存在其他调控通路仍需进一步研究探讨。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

骨碎补影响破骨细胞分化的程度与含药血清浓度有关

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