(1)提取：①将15只新生SD大鼠浸泡于乙醇中至死后取颅骨，将颅骨浸泡于PBS中用手术刀片剔除附着表面组织，PBS冲洗3遍至骨片透明。将骨片于干净培养皿中剪碎为0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm，用移液枪加0.25%胰蛋白酶  4 mL后置于培育箱中消化10-15 min，见图1，2；②取出后吸弃上清液，加入0.1%Ⅱ型胶原蛋白酶5 mL于培育箱中消化1 h后，270目滤网过滤后取上清液置于离心管中于       1 000 r/min下离心7 min，吸弃上清液(注意不要误吸细胞团)后加入配置好的培养液1 mL(450 mL DEME+50 mL胎牛血清+5 mL双抗)充分吹打100下，移液枪辅助下移入装有培养液4 mL培养皿，放置培育箱中；③重复步骤②两三次。

(1)提取：①将15只新生SD大鼠浸泡于乙醇中至死后取颅骨，将颅骨浸泡于PBS中用手术刀片剔除附着表面组织，PBS冲洗3遍至骨片透明。将骨片于干净培养皿中剪碎为0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm，用移液枪加0.25%胰蛋白酶  4 mL后置于培育箱中消化10-15 min，见图1，2；②取出后吸弃上清液，加入0.1%Ⅱ型胶原蛋白酶5 mL于培育箱中消化1 h后，270目滤网过滤后取上清液置于离心管中于       1 000 r/min下离心7 min，吸弃上清液(注意不要误吸细胞团)后加入配置好的培养液1 mL(450 mL DEME+50 mL胎牛血清+5 mL双抗)充分吹打100下，移液枪辅助下移入装有培养液4 mL培养皿，放置培育箱中；③重复步骤②两三次。

2.1  细胞形态学观察  原代细胞培养2 d，显微镜下观察可见少量成骨细胞；原代细胞培养约7 d后，细胞数增多，向四周充分伸展，呈三角形、梭形、多边形，胞体向外伸展，胞浆丰富，胞核呈卵圆形见；约15 d起，细胞数目增多，形状如瓦片状重叠生长，细胞多集结于中心生长，中心密集且具体形态难以不清。见图3。

2.2  成骨细胞鉴定  第4代成骨细胞数目增多，细胞形态呈不规则形态，形状如瓦片状重叠生长，细胞多集结于中心生长，中心密集且具体形态难以不清；经碱性磷酸酶染色后倒置显微镜下可见阳性细胞胞浆内有灰黑色颗粒，细胞体形态呈不规则形。见图4。

2.3  不同质量浓度地黄梓醇对成骨细胞药毒性  不同质量浓度地黄梓醇培养成骨细胞8 h后，CCK-8法检测结果可见1 mg/L地黄梓醇培养成骨细胞较正常组相比差异无显著性意义(P > 0.05)；当质量浓度为10，100 mg/L地黄梓醇培养成骨细胞较正常组相比差异有显著性意义(P < 0.05)。见表1，图5。

2.3  不同质量浓度地黄梓醇对成骨细胞药毒性  不同质量浓度地黄梓醇培养成骨细胞8 h后，CCK-8法检测结果可见1 mg/L地黄梓醇培养成骨细胞较正常组相比差异无显著性意义(P > 0.05)；当质量浓度为10，100 mg/L地黄梓醇培养成骨细胞较正常组相比差异有显著性意义(P < 0.05)。见表1，图5。

2.4  不同质量浓度脂多糖诱导胎鼠炎性成骨细胞模型  不同质量浓度脂多糖诱导成骨细胞6 h后，CCK-8法检测结果可见各质量浓度脂多糖对成骨细胞均有炎性损伤，较正常组比较均有显著性意义(P < 0.05)，当80 mg/L脂多糖诱导炎性成骨细胞时，与正常组相比差异有非常显著性意义(P < 0.01)，因此实验选择80 mg/L作为最佳质量浓度。见表2，图6。

2.4  不同质量浓度脂多糖诱导胎鼠炎性成骨细胞模型  不同质量浓度脂多糖诱导成骨细胞6 h后，CCK-8法检测结果可见各质量浓度脂多糖对成骨细胞均有炎性损伤，较正常组比较均有显著性意义(P < 0.05)，当80 mg/L脂多糖诱导炎性成骨细胞时，与正常组相比差异有非常显著性意义(P < 0.01)，因此实验选择80 mg/L作为最佳质量浓度。见表2，图6。

2.5  地黄梓醇对脂多糖诱导胎鼠炎性成骨细胞的影响  不同质量浓度地黄梓醇培养炎性成骨细胞8 h后，CCK-8法检测结果可见模型组、地黄梓醇低浓度组对炎性成骨细胞的保护作用较正常组相比差异无显著性意义(P > 0.05)；地黄梓醇中浓度组、地黄梓醇高浓度组对炎性成骨细胞的保护作用较正常组相比差异有显著性意义(P < 0.05)。见表3，图7。

2.5  地黄梓醇对脂多糖诱导胎鼠炎性成骨细胞的影响  不同质量浓度地黄梓醇培养炎性成骨细胞8 h后，CCK-8法检测结果可见模型组、地黄梓醇低浓度组对炎性成骨细胞的保护作用较正常组相比差异无显著性意义(P > 0.05)；地黄梓醇中浓度组、地黄梓醇高浓度组对炎性成骨细胞的保护作用较正常组相比差异有显著性意义(P < 0.05)。见表3，图7。

膝骨关节炎是一种常见的慢性关节疾病，其特征是疼痛、畸形、不稳定以及运动和功能下降^[1]。膝骨关节炎作为世界性治疗难题，主要在于其高患病率和发病率，以及目前仍缺乏有效的治疗方法^[2]。膝骨关节炎的治疗目标是减缓早期形式的进展，减轻疼痛，并在晚期尽可能多地保留关节活动性和功能^[3]。因此早期治疗膝骨关节炎成为必要手段。早期膝骨关节炎的特征是软骨变性和丧失以及软骨下骨的重塑增加^[4]，这些改变是由细胞介导的，例如关节软骨中的软骨细胞和骨中的破骨细胞、成骨细胞和骨细胞。在这些细胞中，成骨细胞是负责骨骼生成和重塑的间充质来源细胞，通过产生细胞外基质蛋白来调节骨骼结构和骨基质矿化，并通过产生细胞因子或直接细胞接触来诱导破骨细胞生成^[5]。有研究表明成骨细胞代谢异常也可能是膝骨关节炎中软骨下骨矿化异常的原因^[6]，同时体外和体内越来越多的证据表明，成骨细胞能够影响软骨细胞^[7]。因此，成骨细胞不仅可以影响软骨细胞、破骨细胞以及骨重建，而且对软骨下骨矿化亦有影响。当成骨细胞处于炎性状态下，可促使其凋亡，抑制其再生^[8]。因此从早期治疗膝骨关节炎角度考虑，促进成骨细胞增殖、抑制成骨细胞炎性状态对控制及治疗膝骨关节炎有重要意义。

中药长期以来一直用于预防和治疗膝骨关节炎，与化学合成药物相比，不良反应少且更适合长期使用，因此在国内外受到广泛关注和研究^[9-10]。地黄梓醇是传统四大怀药之一熟地黄是的主要活性成分，药理作用包括抗细胞凋亡、抗炎等特性，但缺乏相应的基础研究支持^[11]。此次研究主要目的在于探讨：①地黄梓醇能否促进成骨细胞增殖；②地黄梓醇对成骨细胞有无药物毒性的影响；③地黄梓醇对脂多糖诱导的炎性成骨细胞是否有抗炎保护作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  细胞学实验观察。

1.2  时间及地点  实验于2019年8月至12月在南京中医药大学附属南京中医院中心实验室完成。

1.3  材料

1.3.1  动物  选取15只新生雌性SD大鼠(出生24 h以内)，体质量无影响，购于南京医科大学实验动物中心，许可证号：SYXK(苏)2016-0006。

1.3.2  实验用主要试剂及仪器  地黄梓醇(大连美伦生物科技；批号：J0520A5)；脂多糖(南京恒博生物；批号：#456A07)；CCK8(南京恒博生物；批号：#46255)；DEME(南京恒博生物；批号：8119361)；PBS(南京恒博生物；批号：8119396)；Ⅱ型胶原蛋白酶(南京恒博生物；批号：EZ4567A109)；0.25% 胰蛋白酶(南京恒博生物；批号：2120917)；胎牛血清(南京恒博生物；批号：FBSSA00818-1)；双抗(南京恒博生物；批号：2108966)；CO2培养箱(Thermo HRRAce11 150i)；高速低温离心机(美国贝克曼 J-26XP)；超净台(Heal Force)；倒置生物显微镜(奥林巴斯CX41)；全波长酶标仪(EPOCH)。

1.4  实验方法

1.4.1  成骨细胞培养及鉴定

(1)提取：①将15只新生SD大鼠浸泡于乙醇中至死后取颅骨，将颅骨浸泡于PBS中用手术刀片剔除附着表面组织，PBS冲洗3遍至骨片透明。将骨片于干净培养皿中剪碎为0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm，用移液枪加0.25%胰蛋白酶  4 mL后置于培育箱中消化10-15 min，见图1，2；②取出后吸弃上清液，加入0.1%Ⅱ型胶原蛋白酶5 mL于培育箱中消化1 h后，270目滤网过滤后取上清液置于离心管中于       1 000 r/min下离心7 min，吸弃上清液(注意不要误吸细胞团)后加入配置好的培养液1 mL(450 mL DEME+50 mL胎牛血清+5 mL双抗)充分吹打100下，移液枪辅助下移入装有培养液4 mL培养皿，放置培育箱中；③重复步骤②两三次。

(2)培养及传代：将成功细胞培养2 d进行换液并放置于显微镜下观察，待细胞贴壁成长至铺满培养皿80%时进行传代。具体步骤：取培养皿吸弃培养液，用PBS冲洗2遍，0.25% 胰蛋白酶4 mL充分消化15 min后，于显微镜下观察细胞脱壁，形态呈圆形，移液枪吸取上清液于离心管中    1 000 r/min离心7 min后，吸弃上清液(注意不要误吸细胞团)后加入配置好的培养液2 mL充分吹打后等份装于2份新培养皿中培养，24 h后换液。之后传代方法同上。

(3)鉴定：选择4代成骨细胞通过观察形态、碱性磷酸酶染色以及矿化结节染色法(茜红素S法)鉴定。具体步骤：取3代成骨细胞接种于装有玻片的6孔板中，待细胞基本铺满玻片时取出，PBS冲洗，用体积分数95%乙醇固定10 min，具体染色过程详见说明书。

1.4.2  地黄梓醇对成骨细胞药毒性检测  选择0，1，10，100 mg/L，4个质量浓度地黄梓醇分别培养成骨细胞8 h后，CCK-8法检测细胞活性。

1.4.3  脂多糖诱导炎性成骨细胞模型  选择4代成骨细胞，给予0，10，20，40，80，160 mg/L，6个梯度脂多糖诱导炎性成骨细胞模型6 h后，CCK-8法检测成骨细胞活性，筛选出最佳诱导浓度。

1.4.4  地黄梓醇对炎性成骨细胞的影响  将实验分为正常组、模型组、低浓度地黄梓醇组、中浓度地黄梓醇组、高浓度地黄梓醇组。选择实验中筛选出的脂多糖浓度诱导炎性成骨细胞6 h，再分别给予不同质量浓度地黄梓醇8 h后，CCK-8法检测细胞活性，根据结果得出地黄梓醇是否对脂多糖诱导的炎性成骨细胞有抗炎保护作用。

1.5  主要观察指标  ①细胞形态学观察；②成骨细胞鉴定；③不同质量浓度地黄梓醇对成骨细胞药毒性；④不同质量浓度脂多糖诱导胎鼠炎性成骨细胞模型结果：⑤地黄梓醇对脂多糖诱导胎鼠炎性成骨细胞的影响。

1.6  统计学分析  实验数据和资料用x(_)±s表示，采用 SPSS 22.0统计学软件进行统计学分析，采用配对t 检验(α=0.05)，比较各组间实验结果，P < 0.05为差异有显著性意义。

膝骨关节炎是一种慢性关节疾病，其病理特征是软骨变性和丧失、滑膜炎症、关节周围骨质改变以及骨赘形成和软骨下骨硬化^[1]。膝骨关节炎病变与通常在年轻人中遭受急性创伤并局部治疗的局灶性缺损所不同，膝骨关节炎病变会影响老年患者，甚至影响整个关节表面^[2]。骨关节炎的发病机制仍知之甚少，主要病理学原因为成骨细胞增殖能力降低而破骨细胞吸收能力加快，因而研究成骨细胞对其治疗具有直接作用^[12-13]。成骨细胞是重塑单位的骨形成细胞，通过合成逐渐矿化的骨基质参与骨代谢的调节^[14]。成骨细胞不仅参与破骨细胞的调节，而且对多种激素有调节作用，例如：副甲状腺激素、维生素D、降钙素，雌激素等^[14-17]。越来越多的证据强调了成骨细胞在骨关节炎中的重要作用^[18-19]。

由于软骨细胞行为的改变，膝骨关节炎中的软骨变化主要与组织重塑失衡有关^[20]。骨骼的异常重塑和矿化的减少是导致骨骼微结构改变的特征，其特征是小梁数目增加、小梁间距减小和骨骼硬度降低^[21]。有研究表明成人膝骨关节炎软骨下骨成骨细胞产生的细胞外基质的特征是矿物质含量减少和基质的异常组织，因此，成骨细胞代谢异常也可能是膝骨关节炎中软骨下骨矿化异常的原因^[6]。越来越多的证据表明软骨下骨中的成骨细胞可影响上层软骨^[7]，因此成骨细胞对关节软骨的修复有一定作用。

目前尚无修复退化软骨和骨质改变的治疗方法，现有的几种用药策略有很大的不良反应风险，尤其是对于老年人群，例如乙酰氨基酚引起的肝毒性、非类固醇抗炎药引起的胃肠道毒性作用以及阿片类药物引起的跌倒、骨折和神经错乱等^[22]。因此将中国传统中药应用于临床日渐成为研究热点^[23]。地黄是传统四大怀药之一，熟地黄主归肝肾两经, 具有补阴血，益肾精的功效。《本草纲目》：“填骨髓, 长肌肉, 生精血”，肯定了熟地黄对筋骨肌肉虚劳诸证的补益作用。目前熟地黄在临床上已经被广泛用于治疗炎性疾病^[24]。地黄梓醇是从地黄中提取出来的一种环烯醚萜苷化合物，2015版《中国药典》明确规定了地黄梓醇作为地黄质量控制的指标^[25]。地黄梓醇的药理作用包括抗细胞凋亡，抗炎等特性，但缺乏相应的基础研究支持^[11]。

前期研究进行过地黄梓醇对早期膝骨关节炎大鼠滑膜组织中钙结合蛋白(S100A12)、白细胞介素1β、半乳糖凝集素3(Galectin-3)的基础研究，结果显示地黄梓醇可以调节滑膜组织中上述3种因子水平，从而控制炎性反应，延缓膝骨关节炎进展^[19]。在之前组织研究进展后，此次深入细胞研究结果表明：①不同质量浓度脂多糖对成骨细胞均有炎性损害，当其质量浓度高于80 mg/L时，对成骨细胞的炎性损伤呈显著趋势，因此实验选择80 mg/L为最佳损伤浓度；②地黄梓醇质量浓度低于1 mg/L时，对成骨细胞增殖无明显影响；高于10 mg/L时，地黄梓醇对成骨细胞具有促进其增殖作用且无药物毒性作用；③地黄梓醇质量浓度低于1 mg/L时，对成骨细胞炎性反应无明显保护作用；高于10 mg/L时，对成骨细胞炎性反应能起到明显保护作用。这提示将地黄梓醇应用于临床治疗膝骨关节炎且降低对成骨细胞本身的药物毒性具有一定意义。  

膝骨关节炎的发病机制仍知之甚少，目前尚无修复退化的软骨和骨质改变的治疗方法。越来越多的证据强调了成骨细胞在膝骨关节炎中的重要作用。实际上，成骨细胞负责诱导骨保护素和核因子κB受体活化因子配基的表达改变，通过异常的骨骼重塑和矿物质减少来改变骨骼的微结构。此外，基因表达的改变与诱导成骨细胞功能失调，骨骼重塑和矿化有关，从而导致膝骨关节炎的发展。成骨细胞产生许多与膝骨关节炎发病机制有关的转录因子，生长因子和其他蛋白质分子。因此更加深入研究成骨细胞与膝骨关节炎将成为下一步研究重点。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：

地黄梓醇：是从地黄中提取出来的一种环烯醚萜苷化合物，2015 版《中国药典》明确规定了地黄梓醇作为地黄质量控制的指标。地黄梓醇的药理作用包括抗细胞凋亡、抗炎等。

成骨细胞：是重塑单位的骨形成细胞，通过合成逐渐矿化的骨基质参与骨代谢的调节。成骨细胞不仅可以影响软骨细胞、破骨细胞以及骨重建，对软骨下骨矿化亦有影响，而且对多种激素有调节作用，例如：副甲状腺激素、维生素D、降钙素、雌激素等。越来越多的证据强调了成骨细胞在骨关节炎中的重要作用。

膝骨关节炎作为世界性治疗难题，主要在于其高患病率和发病率，以及目前仍缺乏有效的治疗方法。体外和体内越来越多的证据表明，成骨细胞不仅可以影响软骨细胞、破骨细胞以及骨重建，而且对软骨下骨矿化亦有影响。因此从早期治疗膝骨关节炎角度考虑，促进成骨细胞增殖，抑制成骨细胞炎性状态对控制及治疗膝骨关节炎有重要意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程