还原型谷胱甘肽和乌司他丁对冻融人类卵巢组织异种移植的保护作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1074

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (7): 1084-1089.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1074

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还原型谷胱甘肽和乌司他丁对冻融人类卵巢组织异种移植的保护作用

龙惠东1，2，龙玲莉1，麦庆云1，赵雯1，李宇彬1

(1中山大学附属第一医院生殖医学中心，广东省广州市 510080；2深圳爱维艾夫妇科医院，广东省深圳市 518000)

收稿日期:2018-10-29 出版日期:2019-03-08 发布日期:2019-03-08
通讯作者: 李宇彬，博士，副主任医师，中山大学附属第一医院生殖医学中心，广东省广州市 510080
作者简介:龙惠东，女，1980年生，广东省广州市人，2007年中山大学毕业，硕士，主治医师，主要从事生殖医学的研究。
基金资助:
国家自然科学基金青年项目(81100470)，项目负责人：李宇彬；广东省自然科学基金项目(2014A030313182)，项目负责人：李宇彬；深圳市龙岗区经济与科技发展专项资金(20160606092142616),项目负责人：龙惠东

Protection of reduced glutathione and ulinastatin on frozen-thawed ovarian tissues after xenotransplantation

Long Huidong1,2, Long Lingli1, Mai Qingyun1, Zhao Wen1, Li Yubin1

(1Center for Reproductive Medicine, the First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China; 2Shenzhen IVF Gynaecological Hospital, Shenzhen 518000, Guangdong Province, China)

Received:2018-10-29 Online:2019-03-08 Published:2019-03-08
Contact: Li Yubin, MD, Associate chief physician, Center for Reproductive Medicine, the First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China
About author:Long Huidong, Master, Attending physician, Center for Reproductive Medicine, the First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China; Shenzhen IVF Gynaecological Hospital, Shenzhen 518000, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation for the Youth of China, No. 81100470 (to LYB); the Natural Science Foundation of Guangdong Province, No. 2014A030313182 (to LYB); the Economic and Technological Development Project of Longgang District in Shenzhen, No. 20160606092142616 (to LHD)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
卵泡(follicle)：卵巢皮质内由一个卵母细胞和其周围许多小型卵泡细胞所组成。根据卵泡发育过程的形态和功能变化，可分为原始卵泡、生长卵泡和成熟卵泡3个阶段。女性的原始卵泡是与生俱来的，新生儿两侧卵巢就有70万-200万个原始卵泡，到青春期约有4万个原始卵泡。超声显像为检测卵泡发育和有否排卵提供了一项有效的方法，对卵泡发育的异常和各种排卵障碍能比较明确地进行诊断。临床上最常见的异常有卵泡发育不良和无卵泡发育。
谷胱甘肽(Glutataione，GSH)：又有名词解释为媚力肽GSH，为解除毒素的特效物质，是一种由3个氨基酸组成的小分子肽，它作为体内重要的抗氧化剂和自由基清除剂，如与自由基、重金属等结合，从而把机体内有害的毒物转化为无害的物质，排泄出体外。

摘要
背景：还原型谷胱甘肽是有效的抗氧化剂，可直接消除氧自由基，具有抑制炎症细胞因子的作用。乌司他丁能抑制氧自由基的产生，抑制多种炎症递质的产生，维持细胞膜和溶酶体膜的稳定性，还可抑制大量亢进的酶的活性，发挥了对移植器官的保护作用。
目的：探讨还原型谷胱甘肽和乌司他丁在改善冻融人类卵巢组织异种移植方面的效果。
方法：收集6名来源于中山大学附属第一医院年龄(31.8±5.7)岁妇女的卵巢组织，慢速程序化冻融后每一份卵巢组织随机分成4组：还原型谷胱甘肽组(谷胱甘肽组)、乌司他丁组、谷胱甘肽+乌司他丁组、空白对照组，卵巢组织培养箱中平衡15 min后移植在雄性NOD-SCID小鼠背部皮下，移植后4组小鼠分别连续5 d给药还原型谷胱甘肽、乌司他丁、还原型谷胱甘肽和乌司他丁、生理盐水。移植后第1，3，7，14，28，56和85天回收移植物，用苏木精-伊红染色法及酶消化分离荧光染色法观察卵泡组织学形态、各阶段卵泡比例及卵泡的存活率。
结果与结论：①解冻后的卵巢组织中以始基卵泡为主(79.5±14.3)%。新鲜卵巢组织切片的卵泡存活率为97.6%，解冻后卵巢组织的卵泡存活率为(84.4±5.7)%；②还原型谷胱甘肽组、乌司他丁组及谷胱甘肽+乌司他丁组卵泡存活率均高于空白对照组(P=0.022)，联合用药与单独用药比较无显著差异(P > 0.05)；移植后第3天卵泡存活率达到低值(P < 0.05)，移植1周后有所上升；③用药各组在各时间点分离卵泡后的平均卵泡存活率稍高于对照组但差异无显著性意义(P=0.114)，与组织学切片部分比较，分离卵泡的存活率明显更高；④结果说明，使用还原型谷胱甘肽和乌司他丁可以改善人类卵巢组织异种移植后早期的卵泡存活率，联合用药暂未见优势。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0001-6981-1694(龙惠东)

关键词: 卵巢组织, 冷冻保存, 异种移植, 还原型谷胱甘肽, 乌司他丁, 组织构建

Abstract:

BACKGROUND: Reduced glutathione, as an effective antioxidant can inhibit inflammatory cytokines. Ulinastatin can directly remove oxygen free radicals and inhibit production of oxygen free radicals and various inflammatory mediators, sustain the stability of cell membrane and lysosomal membrane, and inhibit the activity of active enzymes, thus protecting the transplanted organ.
OBJECTIVE: To evaluate the effect of reduced glutathione and ulinastatin on improving the xenotransplantation efficiency of frozen-thawed human ovarian tissue.
METHODS: Ovarian tissue samples from 6 women aged 31.8±5.7 years old in the First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, were collected and each tissue sample was randomly divided into four groups after slow freezing: reduced glutathione, ulinastatin, glutathione + ulinastatin and blank control (normal saline) groups. Ovarian tissues were xenotransplantated under the back skin of male NOD-SCID mice after 15-minute cultivation. The mice were administered with corresponding drugs for 5 consecutive days. The grafts were collected at 1, 3, 7, 14, 28, 56, and 85 days after transplantation. Histomorphology, growth situation and viability of the follicle were observed through hematoxylin-eosin staining and enzymatic isolation method.
RESULTS AND CONCLUSION: The majority of the frozen-thawed ovarian tissues were primordial follicles (79.5±14.3%). The viability of the follicle in fresh ovarian tissue was 97.6%, and (84.4±5.7)% in thawed ovarian tissue. The reduced glutathione, ulinastatin, and glutathione + ulinastatin groups showed significantl improvement in the viability of the follicle compared with the control group (P=0.022). There was no significant difference between single and combined drug groups (P > 0.05). The follicle viability reached a lowest value at 3 days after transplantation (P < 0.05), and increased after 1 week later. The mean survival rate of the follicle in the isolated follicle at different time points showed no significant difference among groups (P=0.114). Compared with the histological sections, the isolated follicle showed highest survival rate. Our results suggest that reduced glutathione and ulinastatin can increase the early viability of the follicles after xenotransplantation, and combined administration shows no extra benefit.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Ovary, Cryopreservation, Glutathione, Transplantation, Tissue Engineering

中图分类号:

R446
R318

龙惠东, 龙玲莉, 麦庆云, 赵雯, 李宇彬. 还原型谷胱甘肽和乌司他丁对冻融人类卵巢组织异种移植的保护作用[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(7): 1084-1089.

Long Huidong, Long Lingli, Mai Qingyun, Zhao Wen, Li Yubin. Protection of reduced glutathione and ulinastatin on frozen-thawed ovarian tissues after xenotransplantation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(7): 1084-1089.

图/表（结果） 4

2.1 在NOD-SCID小鼠中的卵巢组织移植物回收购买NOD-SCID实验小鼠96只，实验期间死亡12只，小鼠死亡率12.5%(12/96)，死亡时间多在移植后56-85 d。卵巢组织移植物与小鼠组织分界清晰，容易辨认，移植后期偶有发现小鼠皮下缺失少量移植组织块，移植物回收率(回收的组织块/原移植的组织块)为99% (499/504)。

2.2 卵泡组织学及生长分析共有84组蜡块行组织学切片检查，解冻后的卵巢组织中主要以始基卵泡为主；解冻后卵巢组织的卵泡存活率为(84.4±5.7)%。解冻后卵巢组织中的始基卵泡比例为(79.5±14.3)%，初级卵泡比例为(17.8±10.5)%，次级卵泡比例为(2.7±4.3)%，窦前卵泡比例为0。卵泡存活率见表2，图1；存活卵泡与不存活卵泡的形态苏木精-伊红染色结果见图2。

表2及趋势图显示，谷胱甘肽组、乌司他丁组及谷胱甘肽+乌司他丁组卵泡存活率均高于对照组(P=0.022)；谷胱甘肽组、乌司他丁组和谷胱甘肽+乌司他丁组各时间点平均卵泡存活率均高于对照组，差异均有显著性意义(P < 0.05)，联合用药组与单独用药比较差异无显著性意义(P > 0.05)。移植后各时间点之间的卵泡存活率有统计学差异(P=0.018)，在移植后第3天达到低值(与第28，56，85天比较，P < 0.05)，移植1周后有所上升(与第14天比较，P=0.38)。

2.3 酶消化分离卵泡共有84组卵巢移植物进行酶消化的卵泡分离，每组用于消化的卵巢组织片为2-4块，消化 1 h后可在40×镜下找到不同阶段的卵泡，其中发现部分形态上类似卵泡的类圆形结构，但缺乏卵泡独有的层次结构及折光性，故排除在统计的范围之外。大部分卵泡已经游离，有部分密集的始基卵泡未游离，尝试用1 mL注射器针头机械分离，但是发现容易损伤或丢失卵泡，故将整个包含未游离卵泡的组织进行荧光染色，并测量卵泡直径。

2.4 分离卵泡的存活率结果酶消化分离的卵泡行活性荧光染色后在荧光显微镜下观察，根据荧光的颜色直接评估卵泡存活，移植后卵巢组织分离卵泡的存活情况见表3，图3。

从表3及趋势图可看出，谷胱甘肽组、乌司他丁组、谷胱甘肽+乌司他丁组各时间点平均卵泡存活率稍高于对照组，但差异无显著性意义(P=0.114)，与组织学切片部分的卵泡存活情况(见表2)比较，分离卵泡的存活率明显更高。各移植时间点之间卵巢组织的分离卵泡存活率有明显差异(P=0.000 1)，在移植后第3-7天达到低值(第1天与第3天比较，P=0.000 4)，移植1周后有所上升(第7天与第14天比较，P=0.025)。移植后各组的分离卵泡存活率与组织学切片部分的卵泡存活情况比较，变化趋势相似，但总体来说各组存活率都比组织学切片高。存活卵泡与不存活卵泡形态活性荧光染色见图4。

参考文献

[1] Lobo RA. Potential options for preservation of fertility in women. N Engl J Med.2005;(1):64-73.

[2] Lotz L, Maktabi A, Hoffmann I, et al. Ovarian tissue cryopreservation and retransplantation-what do patients think about it? Reproductive BioMedicine Online. 2016;(4):394-400.

[3] Huser M, Crha I, Hudecek R, et al. Ovarian tissue cryopreservation- new opportunity to preserve fertility in female cancer patients. Eur J Gynaecol Oncol. 2007;28(4):249-55.

[4] Donnez J, Dolmans Mm Fau - Martinez-Madrid B, Martinez-Madrid B, et al. The role of cryopreservation for women prior to treatment of malignancy. Curr Opin Obstet Gynecol.2005;(4):333-338.

[5] Donnez J, Dolmans MM, Demylle D, et al. Livebirth after orthotopic transplantation of cryopreserved ovarian tissue. Lancet. 2004; 364(9443):1405-1410.

[6] Meirow D, Levron J, Eldar-Geva T, et al. Pregnancy after transplantation of cryopreserved ovarian tissue in a patient with ovarian failure after chemotherapy. N Engl J Med.2005; (3):318-321.

[7] Ladanyi C, Mor A, Christianson MS, et al. Recent advances in the field of ovarian tissue cryopreservation and opportunities for research. J Assist Reprod Genet .2017;(6):709-722.

[8] Li YB, Zhou CQ, Yang GF, et al.Modified vitrification method for cryopreservation of human ovarian tissues. Chin Med J (Engl). 2007;120(2):110-114.

[9] Jensen AK, Macklon KT, Fedder J, et al. 86 successful births and 9 ongoing pregnancies worldwide in women transplanted with frozen-thawed ovarian tissue: focus on birth and perinatal outcome in 40 of these children. J Assist Reprod Genet.2017;(3):325-336.

[10] Beckmann MW, Dittrich R, Lotz L, et al. Fertility protection: complications of surgery and results of removal and transplantation of ovarian tissue. Reprod Biomed Online. 2018;36(2):188-196.

[11] Kim S, Lee Y, Lee S, Kim T. Ovarian tissue cryopreservation and transplantation in patients with cancer. Obstet Gynecol Science. 2018;(4):431-442.

[12] Kristensen SG, Andersen CY. Cryopreservation of Ovarian Tissue: Opportunities Beyond Fertility Preservation and a Positive View Into the Future. Front Endocrinol (Lausanne). 2018;9:347.

[13] Estrada E, Rodríguez-Gil JE, Rivera Del Álamo MM,et al.Effects of reduced glutathione on acrosin activity in frozen-thawed boar spermatozoa.Reprod Fertil Dev. 2017;(2):283-293.

[14] Tao Z, Hu FQ, Li CF, et al.Effect of ulinastatin, a human urinary protease inhibitor, on heatstroke-induced apoptosis and inflammatory responses in rats.Exp Ther Med. 2017;(1):335-341.

[15] Cho YS, Shin MS, Ko IG, et al. Ulinastatin inhibits cerebral ischemia-induced apoptosis in the hippocampus of gerbils. Mol Med Rep. 2015;12(2):1796-802.

[16] Zhou L, Rui JA, Zhou RL,et al. Liver injury after intermittent or continuous hepatic pedicle clamping and its protection by reduced glutathione. Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 2004;3(2):209-213.

[17] Guan L, Liu H, Fu P, et al.The Protective Effects of Trypsin Inhibitor on Hepatic Ischemia-Reperfusion Injury and Liver Graft Survival. Oxid Med Cell Longev. 2016;2016:1429835.

[18] Dolmans MM, Michaux N,Fau - Camboni A, et al. Evaluation of Liberase, a purified enzyme blend, for the isolation of human primordial and primary ovarian follicles. Hum Reprod.2006; (2): 413-420.

[19] Martinez-Madrid B, Dolmans MM, Langendonckt AV,et al. Ficoll density gradient method for recovery of isolated human ovarian primordial follicles. Fertil Steril.2004;(6):1648-1653.

[20] Dolmans MM, Michaux N, Camboni A, et al. Evaluation of Liberase, a purified enzyme blend, for the isolation of human primordial and primary ovarian follicles. Hum Reprod. 2006;21(2): 413-420.

[21] Gougeon A. Dynamics of follicular growth in the human: a model from preliminary results. Hum Reprod. 1986;1:81-87

[22] Candy CJ, Wood MJ, Whittingham DG. Effect of cryoprotectants on the survival of follicles in frozen mouse ovaries. J Reprod Fertil.1997; 110(1):11-19.

[23] Israely T, Dafni H,Fau - Nevo N, et al. Angiogenesis in ectopic ovarian xenotransplantation: multiparameter characterization of the neovasculature by dynamic contrast-enhanced MRI. Magn Reson Med.2004; (4):741-750.

[24] Kim SS, Yang Hw,Fau - Kang HG, et al. Quantitative assessment of ischemic tissue damage in ovarian cortical tissue with or without antioxidant (ascorbic acid) treatment. Fertil Steril.2004;(3):679-685.

[25] Hreinsson J, Zhang P,Fau - Swahn ML, et al. Cryopreservation of follicles in human ovarian cortical tissue. Comparison of serum and human serum albumin in the cryoprotectant solutions. Hum Reprod. 2003; (11):2420-2428.

[26] 焦桂萍,赵兵,袁志柳,等.还原型谷胱甘肽对大鼠肺缺血再灌注损伤的保护作用[J].中国临床保健杂志,2006，9(2):142-144.

[27] Kevelaitis E, Nyborg NC, Menasché P.Protective effect of reduced glutathione on endothelial function of coronary arteries subjected to prolonged cold storage. Transplantation.1997;64(4):660-663.

[28] 大西冶夫.Ulinastatin. Biomedical Sciences.1984, 5(2):76-77.

[29] 曾文红,白国强.乌司他丁研究进展[J].中华肝胆外科杂志，2001,7(1): 52-54.

[30] Matsumi M, Mizobuchi S, Kaku R ,et al. Changes of urinary tripsin inhibitor in blood and urine, as well as serum cytokines in living related liver transplantation. Masui. 2003;52(3):251-256.

[31] 马兴久,耿振宏,李德春.乌司他汀对肝脏缺血再灌注损伤的防护作用[J].医师进修杂志,2005,28(7):22-28.

[32] 钱叶本,赵红川,熊奇如,等.乌司他丁在肝脏缺血再灌注损伤和肝脏再生中的作用[J].中华肝胆外科杂志,2001,11(7):701-2.

[33] 于金贵,周广利,孟冬梅,等.乌司他丁对心脏直视患者体外循环期炎性细胞因子和自由基的影响[J].中华麻醉学杂志, 2001,21(12):724-26.

[34] Zhang XQ, Sun JL, Chen YJ, et al. Amelioration of ischemia-reperfusion injury of transplanted small intestine by ulinastatin: effects on accumulation and adhesion of neutrophil. Transplant Proc. 2005;37(10):4464-4466.

[35] Nugent D, Newton H Fau - Gallivan L, Gallivan L,et al. Protective effect of vitamin E on ischaemia-reperfusion injury in ovarian grafts. J Reprod Fertil.1998;(2):341-346.

[36] Schnorr J, Oehninger S,Fau - Toner J, et al. Functional studies of subcutaneous ovarian transplants in non-human primates: steroidogenesis, endometrial development, ovulation, menstrual patterns and gamete morphology. Hum Reprod.2002;(3):612-619.

[37] Gadea J, Gumbao D,Fau - Matas C, et al. Supplementation of the thawing media with reduced glutathione improves function and the in vitro fertilizing ability of boar spermatozoa after cryopreservation. J Androl.2005; (6):749-756.

[38] Luo CQ, Long LL,Li XH, et al.Human ovarian tissue xenografted in asepticallywounded mice to conserve follicles.Int J Clin Exp Med.2017; (9):13482-13490.

[39] Nisolle M, Casanas-Roux F,Fau - Qu J, et al. Histologic and ultrastructural evaluation of fresh and frozen-thawed human ovarian xenografts in nude mice. Fertil Steril.2000;(1):122-129.

引言

材料方法

1.1 设计分组对照观察。

1.2 时间及地点 2005年至2007年在中山大学附属第一医院完成。

1.3 材料

1.3.1 人类卵巢组织研究得到医院伦理委员会批准后，2005至2007年募集6名中山大学附属第一医院妇科肿瘤患者，年龄(31.8±5.7)岁(24-38岁)妇女，术前无放化疗史。卵巢组织是在卵巢良性肿瘤切除的肿块边缘取得或子宫恶性肿瘤需行附件切除的组织中获得。收集好的卵巢组织通过病理切片证实没有癌细胞而且可见卵泡，经过慢速程序化冷冻保存起来用于实验研究。

1.3.2 实验动物健康雄性SCID小鼠96只，SPF级，五六周龄大小，购于中山大学北校区动物中心。实验动物遗传背景稳定，于无病原微生物的层流间中饲养，鼠笼、饲料、饮水和室内空气均经过消毒处理。SCID小鼠在实验中充当移植物宿主。

1.3.3 药品还原型谷胱甘肽为意大利福斯卡玛生化制药公司产品，批准文号：国药准字H20020388；乌司他丁为广州天普生化医药股份有限公司产品，批准文号：国药准字H19990134。

1.4 实验方法

1.4.1 人类卵巢组织的冷冻、解冻及预处理在全麻下行开腹手术，手术剪活检取得卵巢组织，保存于α-MEM液(Gibco，BRL)中在冰块上半小时内运送回实验室，去除大体可见卵泡、黄体及髓质，少量新鲜卵巢组织立即送病理切片行苏木精-伊红染色及排除癌细胞存在，将其余大部分卵巢组织切成6 mm×2 mm、厚约1 mm的组织块，通过慢速冷冻法冷冻保存于液氮中，慢速程序化冷冻方法如研究组先前所报道^[7]。解冻后将少量卵巢组织立即送病理切片行苏木精-伊红染色以评价卵泡存活情况，其余用手术刀切割成约3 mm×1 mm×1 mm大小的组织片，将每个妇女来源的组织片随机分成4份，分装到装有体积分数5%人类血清白蛋白(HAS，SAGE IVF，USA)+α-MEM液的小试管中。在37 ℃、体积分数5.5%CO₂培养箱中平衡15 min。然后将小试管夹在冰块间，带至SPF级SCID小鼠动物房。

1.4.2 各组处理人卵巢组织在移植当天解冻，解冻方法如研究组先前所报道^[7]，平均每只小鼠移植6块卵巢组织片，每组每个时间段使用小鼠3只；同一患者的卵巢组织片随机分为4组还原型谷胱甘肽组(谷胱甘肽组)，乌司他丁组，还原型谷胱甘肽+乌司他丁组(谷胱甘肽＋乌司他丁组)，空白对照组。根据不同组别，在上述小试管中加入不同药物：谷胱甘肽组添加浓度为5.0 mmol/L的还原型谷胱甘肽，乌司他丁组添加100 U/mL乌司他丁，谷胱甘肽+乌司他丁组添加5.0 mmol/L还原型谷胱甘肽和 100 U/mL乌司他丁；对照组无添加谷胱甘肽或乌司他丁。在培养箱中平衡15 min后，移植在雄性NOD-SCID小鼠背部皮下，从移植当天起连续5 d给接受移植的小鼠用药方法，见表1。

表1 各组小鼠人卵巢组织移植后当天起连续5 d用药方法

Table 1 Administration in each group immediately after transplantation and 5 days later

组别	用药方法
谷胱甘肽组	给予肌肉注射还原型谷胱甘肽2.0 g/kg，1次/d
乌司他丁组	给予尾静脉注射乌司他丁1×10⁵U/kg，1次/d
谷胱甘肽+ 乌司他丁组	同时给予还原型谷胱甘肽2.0 g/kg和乌司他丁1×10⁵U/kg， 1次/d
对照组	给予肌肉注射生理盐水0.1 mL，1次/d

谷胱甘肽和乌司他丁的用药剂量和给药方式均是参考文献报道及药物说明的有效剂量及合理给药方式来选用的^[13^，^16-17]。分别在移植后第1，3，7，14，28，56和85天回收移植物，麻醉后颈椎脱臼处死小鼠后剪开皮肤找到移植物，每阶段每组处死3只小鼠。回收的卵巢组织一半用于组织学检查和卵泡生长形态学评估(苏木精-伊红染色)，一半用于酶消化的卵泡分离，结合利用EthD-1和Calcein-AM荧光染色以评估卵泡的存活率。酶消化的卵泡分离方法^[18-20]：在室温下将卵巢组织片移入装有α-MEM溶液的培养皿中清洗，用眼科剪剪碎至约1 mm×0.5 mm×0.5 mm的小块，加入3 g/L的胶原酶Ⅰ溶液2 mL，放入37 ℃的培养箱内消化，每隔20 min用玻璃吸管吹打1次。消化60 min后在显微镜下用内径300-400 μm的玻璃吸管吸取卵泡，移至PBS中漂洗后移入含活性荧光剂的微滴中(5 µmol/L EthD-1和2 µmol/L Calcein-AM)置于37 ℃的培养箱 45 min，其后在荧光显微镜下观察每一卵泡的染色情况。

1.4.3 收集各移植卵巢组织片进行卵泡组织学形态分析及存活率比较

(1)苏木精-伊红染色组，在光学显微镜下观察并记录卵巢组织切片中卵泡的形态。对每个切片中形态正常和异常的卵泡进行计数，形态正常者视之为存活，根据Gougeon^[21]的标准观察卵泡形态：形态正常的卵泡结构为卵泡和卵母细胞呈圆形，颗粒细胞分布均匀，基底膜完整，卵母细胞胞浆和核无固缩；形态异常的卵泡结构为卵母细胞浆皱缩，卵母细胞核固缩，颗粒细胞固缩、排列紊乱。测量卵泡直径，结合卵泡形态和直径对卵泡进行如下分类^[21]：始基卵泡、初级卵泡、次级卵泡、窦前卵泡、早期窦卵泡。为避免卵泡的重复计数，切片中见到卵母细胞核才对卵泡进行计数。

(2)酶消化分离卵泡组，在40×显微镜下卵泡的形态特点为外形规律，圆形或类圆形，折光性强，与周围组织分界清楚，通常可见外面颗粒细胞层包绕着卵子的结构层次，染绿色荧光的卵泡定义为存活的卵泡，染红色荧光的卵泡为死亡的卵泡，同时有两种染色的卵泡也定义为不存活的卵泡，计算卵泡存活率。

1.5 主要观察指标观察卵泡组织学形态、各阶段卵泡比例及卵泡的存活率。

1.6 统计学分析使用SPSS 17.0统计软件分析进行组间比较。率和构成比的比较使用χ²检验分析，检验水准α=0.05。P < 0.05时差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

3.1 还原型谷胱甘肽与乌司他丁对异位移植的冻融人卵巢组织中卵泡的保护提高卵巢组织中的卵泡存活率是获得冻融人卵巢组织移植成功的关键因素，一直以来是研究者所关注的热点。由于卵巢组织移植是非血管吻合的游离移植，在新生血管长入移植物之前处于缺血缺氧状态，在这个时期组织能量供应不足，氧自由基、炎症递质、多种水解酶的损害会使卵巢组织中的卵泡大量丢失^[22]；待新生血管形成以后，再灌注期氧自由基、钙超载以及炎症递质等进一步产生各种损害^[23-24]，目前认为冻融卵巢组织移植后的卵泡丢失可达50%-65%^[5]。在该研究中发现，冻融后卵巢组织中卵泡丢失率为15.6%，移植后卵泡的丢失率达到44.3%，比冻融造成的损伤更加显著，与文献报道的结论基本一致^[25]，移植后的缺血再灌注损伤导致了大量卵泡丢失，直接影响到移植卵巢组织的长期存活，因此很有必要对移植物采取有效保护措施，以改善卵巢组织移植的成功率。

针对缺血再灌注损伤发生机制的关键环节，研究首次报道还原型谷胱甘肽和乌司他丁对人冻融卵巢组织移植的干预研究。由于氧自由基是导致缺血再灌注损伤的重要因素之一，保护组织细胞膜的稳定性也显得格外重要。还原型谷胱甘肽抗缺血再灌注损伤及抗氧化作用的有效性已在多方面的临床应用及研究得到证实^[16^，^26-27]；多个研究表明，乌司他丁对肝脏及小肠移植等重要脏器的缺血再灌注损伤具有明显的保护作用^[28-34]。

研究结果显示应用还原型谷胱甘肽和乌司他丁均可以有效改善移植后冻融人卵巢组织的卵泡存活率。既往Nugent等^[35]应用维生素E改善移植后卵巢组织的卵泡存活情况，卵泡存活率从45%提高到72%，其干预组的卵泡存活率要比此次研究干预组的高，可能是因为其移植卵巢组织的种属差异(小鼠)与部位(肾囊下)不同所致^[36]；此次研究对象直接是人的卵巢组织，从而增加了结论的可靠性。与对照组相比，还原型谷胱甘肽和乌司他丁的保护作用在移植早期更明显，提示还原型谷胱甘肽和乌司他丁通过减轻移植早期的缺血再灌注损伤对移植物的卵泡起到保护作用，而且移植后较长时间(移植后12周)仍可见到这一保护效应。由于样本量有限，作者仅对各组的卵泡存活率作比较，缺乏对缺血再灌注的代谢产物如超氧化物歧化酶、过氧化脂质做深入的检测，但基于目前对还原型谷胱甘肽和乌司他丁作用机制的理解和认识^[27-28]，可推测还原型谷胱甘肽和乌司他丁是作用于抗自由基、抑制炎症因子、稳定细胞膜及溶酶体膜等一系列环节，改善移植后卵泡的存活率，因此应用还原型谷胱甘肽和乌司他丁可有效提高卵巢组织移植的成功率。联合用药组的卵泡存活率与单独用药组相比差异无显著性，推测是由于还原型谷胱甘肽和乌司他丁在抗自由基、抑制炎症因子、稳定细胞膜等重要作用机制上存在一定的相似性，并且根据文献报道两者在药物浓度上可能已达到了有效的作用浓度，两者合用后的叠加效应就不明显；但也有可能是该研究样本量还不足够的缘故，要了解两药有无叠加作用有待进一步研究探讨。另外，作者在解冻后的短时体外培养中添加了干预因素，根据Gadea等^[37]研究也认为在冷冻液和解冻液中添加 5 mmol/L的还原型谷胱甘肽可以改善冷冻精子的功能。因此作者认为移植前在解冻液中添加干预因素短时培养可对移植后的卵泡存活起到有益的预处理作用，而且解冻和移植是一个紧密连接的过程，两者的保护作用应是承前继后的。

卵泡存活率在移植后各时间点之间存在统计学差异，移植后第3天卵泡存活率处于最低水平，推测可能是移植后缺血再灌注损伤导致了大量卵泡的丢失，是发生缺血再灌注损伤的主要时期；随着移植后时间的推移，移植物中血管的形成逐渐稳定，卵泡的丢失也随之减少^[38]，移植物有限的寿命就取决于卵泡储备的多少，由此可看出移植早期对卵泡保护的重要性，故此，在移植早期采取对卵泡的保护措施是非常必要的。

3.2 对酶消化分离卵泡法的评价胶原酶在分离卵泡过程中会产生一些不良反应如卵泡基底膜的损伤等，这些不良反应的发生与组织在酶中所暴露的时间密切相关^[18]。作者发现酶消化分离卵泡法的卵泡存活率要明显高于组织学切片法；进一步观察发现分离的卵泡在体外死亡裂解后，已失去形态上特有的结构，不易辨认，推测可能移植后卵巢组织中的部分卵泡经历了冻融及缺血再灌注等损伤已经走向凋亡和闭锁^[39]，因而在酶的消化作用下更容易发生裂解，形态变得不规则以至不能从形态学上辨别，最终没有被纳入统计中，导致卵泡存活率较组织学切片法的存活率高，并且组别之间存活率的差异也无法体现出来，因而不能对移植后的卵泡进行全面真实的分析。所以认为用酶消化分离卵泡法评价移植后卵巢组织的卵泡存活率会存在偏差，应选用组织学切片法较为合适。

Martinez-Madrid等^[17]报道在新鲜卵巢组织中用酶消化分离卵泡法得到的卵泡存活率可达到95.8%，与此次研究组织学切片法评价的新鲜卵巢组织卵泡存活率97.6%接近，提示酶消化分离卵泡法用于评价新鲜卵巢组织的卵泡存活率较为合适。由于样本量有限，此次研究没有对新鲜卵巢组织进行酶消化分离卵泡分析，但其余实验的结果与文献报道是相似的^[20]，移植后卵巢组织分离的卵泡存活率平均也可达到78%以上，因此作者认为该法能有效分离到存活率高的卵泡，可应用于卵泡体外培养之前的卵泡分离提取。

综上所述，通过研究发现用还原型谷胱甘肽和乌司他丁在人类卵巢组织异种移植早期单独应用均可以改善卵泡存活率，可作为人类卵巢组织移植临床及基础研究的一种临床使用参考，联合应用暂时看不到叠加优势，可能需要进一步大样本研究证实。酶消化分离卵泡方法可以得到较多存活的卵泡，为今后卵泡体外培养成熟的研究提供基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

还原型谷胱甘肽和乌司他丁对冻融人类卵巢组织异种移植的保护作用

Protection of reduced glutathione and ulinastatin on frozen-thawed ovarian tissues after xenotransplantation

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[1]	许国峰, 李学斌, 唐一钒, 赵寅, 周盛源, 陈雄生, 贾连顺. 人黄韧带细胞骨化发生过程中的自噬[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1174-1181.
[2]	周玉, 龙小安, 李宁, 王纯. 有限元法分析髌腱炎状态时的生物力学变化[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1280-1286.
[3]	张源, 曾敏, 翟博. 组织玻璃化冻存技术：优势与尚未完全解决的问题[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(23): 3751-3755.
[4]	宋旭东, 何云武, 李勇霖, 陈静, 胡君兰. 超声引导下椎旁神经阻滞治疗带状疱疹相关疼痛的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(11): 1797-1804.
[5]	曹曦，崔伟，陈跃平，冯洋，路通. 尼尔样1型生长因子促进修复骨再生和治疗骨质疏松的应用潜力[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(8): 1235-1240.
[6]	庞巨涛，张新虎，孙建华，周连军，刘斌，李凤国，李文哲. 经皮球囊扩张椎体后凸成形后椎体再骨折的危险：回顾性多因素分析[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(8): 1182-1187.
[7]	夏玲，王磐，吴春芳，张兆波. 表面肌电图在周围神经损伤修复过程中的应用价值[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(7): 1142-1148.
[8]	高坤，朱文秀，李亨，刘伟东，李全，余伟吉，王立新，曹亚飞 . 去卵巢大鼠血清来源外泌体促进原代成骨细胞的增殖[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(7): 958-989.
[9]	宋超，田鑫，刘琳，徐雅雯，孟圆，李晓丽，彭萌，李华东，王志涛，戈莎. 骨密度测试联合老年人运动功能量表-25评估筛查老年人基础运动障碍及跌倒风险：天津市6个社区1 458例调查[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(7): 990-995.
[10]	艾力麦尔旦•艾尼瓦尔，李鹏，刁兆峰，木合塔尔•霍加. 幼兔颅盖骨成骨细胞的分离培养及鉴定[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(7): 996-1000.
[11]	武敏1，李雪1，高洁1，杨帅1，蔡毅志2，王明国1 . 下颌持续前导对成年及幼年期大鼠髁突软骨血管内皮生长因子表达和Micro-CT下髁突骨质变化的差异[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(7): 1001-1006.
[12]	王灿莉, 焦志立, 孙勇, 孙嵩. 两种富血小板纤维蛋白对人牙龈成纤维细胞增殖活性影响的比较[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(7): 1007-1012.
[13]	周艳星，彭新生，侯敢，李江滨，张华，周志昆，周艳芳. 辣椒素抑制成纤维细胞增殖的作用及其分子机制[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(7): 1018-1022.
[14]	赵彩萍，朱美玲，王婷婷，柳雪蕾，刘翠玲. 化学神经根炎症模型大鼠的制备及评价[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(7): 1030-1034.
[15]	韩杰，陈跃平，莫坚，王大伟，苏波，李书振，夏天，王世鑫 . 三七总皂苷干预激素性股骨头缺血坏死模型兔的超微结构评价[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(7): 1035-1039.