2.1  玻璃化冻存的生物学原理  低温冻存条件下，细胞内的生化代谢反应受到极大抑制，细胞可以长期保持低代谢甚至停止代谢的稳定状态，其生物学活性也因此而得到保留。大多数细胞在温度不低于-10 ℃时，细胞受质膜保护，可处于过冷状态而不结冰。在温度降到-10 ℃以下，过冷胞质极易形成冰晶。形成冰晶的危险温区介于-15 ℃至-50 ℃之间，采取适当的冷冻方法和优化的冻存液成分配比可以使细胞在冻存和复苏过程中快速安全通过危险温区，有效避免冰晶的产生^[12]。玻璃化冷冻保存就是利用这些高浓度的低温保护剂组合成玻璃化冻存液，通过与水分子发生强烈的水合作用，增加溶液黏性，降低冰晶形成速度，从而使细胞在快速降温或复温过程中得以保护。

2.2  玻璃化冻存试剂的分类  见表1。①渗透性玻璃化冻存试剂：二甲基亚砜被认为是渗透性玻璃化冻存试剂中最优选的细胞保护剂^[13]。由于玻璃化冻存试剂需要保持较高浓度，在冻存液导入及洗脱过程中对细胞及组织有毒性损害，所以细胞冻存后必须进行洗涤，清除降低冻存试剂的毒性影响。②非渗透性玻璃化冻存试剂：这类冻存试剂的冻存效果比较差，但是细胞毒性较渗透性冻存试剂低很多。

2.3  组织的玻璃化冻存  组织冻存不同于细胞冻存，在降温或复温时，由于组织结构复杂，各部温度变化不同步，可能出现热应力释放导致的结构破坏，导致冻存效果不近人意^[15-16]。这一问题可以通过使用浓度更高、具有更强玻璃化能力的冻存试剂来缓解，但这种方法的代价是对组织的高毒性和高渗透性损害。为了降低整体损伤风险，可以混合使用多种低毒冻存试剂，添加非穿透性冻存试剂，或者添加可直接抑制冰核产生或重结晶的冻存试剂^[17]。

2.3.1  卵巢的玻璃化冻存  卵巢组织的冻存与移植是实现癌症妇女患者在放化疗前生育能力保存最有希望的方法^[18-20]。自体冻存卵巢移植成功后，该方法已经于2004年首次在人类临床上得到应用，至今共有120多个婴儿通过这种方法顺利出生^[21-22]。SILBER等^[23]进行了新鲜卵巢移植与冷冻卵巢移植后婴儿出生率的对照研究，11名新鲜卵巢移植的接受者顺利产下11名健康婴儿，另有13名冷冻卵巢移植的接受者产下9名健康婴儿。DONNEZ等^[24]报道了60例冷冻卵巢组织原位移植的研究结果，60例中有11例受孕，其中6例产下12例健康婴儿。可见，玻璃化冻存对卵巢组织和卵泡细胞仍具有一定的毒性损伤作用，冷冻技术还未达到完全成熟的水平，玻璃化冻存卵巢技术还需进一步的优化和提升。KONG等^[25]在研究中发现抗冻蛋白对再结晶有抑制作用，在玻璃化小鼠卵巢组织升温过程中添加抗冻蛋白可改善卵巢的组织活性与功能。NATEGHI等^[26]通过对比乙二醇、丙二醇、二甲基亚砜对冻存蛋鸡卵巢的影响，发现乙二醇和二甲基亚砜联合应用可减轻玻璃化蛋鸡卵巢的冷冻损伤和凋亡基因的表达。BRITO等^[27]分别采用浓度为0.1 mol/L和0.5 mol/L的蔗糖、海藻糖、棉籽糖混合40%乙二醇对成年猫的卵巢进行玻璃化，实验发现海藻糖混合乙二醇冻存复苏卵巢后的正常卵泡百分率最接近新鲜对照组(62.9±4.1)%。如果在现有的研究基础上对冷冻保存作进一步优化处理，将有望实现卵巢的高效保存和功能保留。

2.3.2  皮肤的玻璃化冻存  目前人造真皮和人造复合皮已经被广泛应用于烧伤后瘢痕修补、开放性创面植皮等多个方面^[28-29]，但只有对供体皮肤进行有效的保存，才能保证有充足的移植资源。玻璃化冻存技术可应用于供体皮肤长期的活性保存，有助于提高移植皮肤的存活率。WILSON等^[30]进行了一项冻存皮肤移植治疗骨软组织开放性创面的有效性和安全性研究，所有15例患者均进行标准的冻存皮肤移植治疗，其中14例(93.3%)伤口完全愈合，创面覆盖肉芽组织的平均时间为36.14 d，创面完全愈合的平均时间为133 d，平均移植次数为2次，术后无与移植相关的不良反应。HOLZER等^[31]对猪的新鲜皮肤移植和冷冻皮肤移植进行了横向对比研究，实验结果发现在移植早期二者可观察到显著的表观差异，但各组的总存活时间无差异。WOOD等^[32]对比研究了甘油化保存、包含二甲基亚砜的冷冻保存和不包含二甲基亚砜的冷冻保存对人自体皮肤移植的组织力学变化。实验结果表明，甘油化和冷冻保存都会引起皮肤显著的组织力学改变，其中包含二甲基亚砜的冷冻保存引起皮肤的弹性纤维损伤，而甘油化则导致了真皮-表皮分离和弹力蛋白断裂，无二甲基亚砜的冷冻保存对皮肤的组织力学改变最大。NAALDIJK等^[33]发现羟乙基淀粉可代替二甲基亚砜对真皮成纤维细胞和角质形成细胞进行冷冻保存，显著降低了冻存毒性，取得了良好的冻存效果。进一步完善冻存方法和冻存试剂的成分配比有利于提高皮肤的冻存效果。

2.3.3  角膜的玻璃化冻存  供移植角膜的短缺现象在许多国家日益严重。因此，角膜的长期保存是一个亟待解决的问题。早在20世纪六七十年代，就有学者对供体角膜的冷冻保存展开了研究，随访发现当年冻存的16例移植角膜有4例(25%)在27年后仍保持良好的功能状态，表明冷冻保存可以实现角膜的功能保留^[34]。后来不断有学者对冷冻试剂进行探索和改良。然而，甘油、二甲基亚砜、甲酰胺、丙二醇、丁二醇等一系列冻存试剂的改良实验均以失败告终，角膜损伤严重，上皮细胞损伤明显^[35-36]。后来又有学者对角膜上皮细胞进行冻存研究，采用10%甘油或二甲基亚砜将角膜在-80 ℃或-196 ℃条件下储存4或12周。实验结果表明，二甲基亚砜冻存的角膜上皮细胞在-80 ℃时的结构损伤更为明显，而甘油冷冻保存的角膜上皮细胞在-196 ℃条件下仅观察到微小的形态学变化^[37]。可见，角膜的毒性损伤承受能力较弱，低毒性是冻存角膜试剂的必要条件。由于角膜的冻存技术要求很高，目前仍处于试验阶段。

2.3.4  肿瘤组织的玻璃化冻存  传统的组织标本保存会使活肿瘤组织完全失去活性，导致大量宝贵的临床活肿瘤样本因无法得到及时利用和长期活性保存而被浪费。医学研究的发展需要高质量的疾病资源支持，虽然国内不同层次的临床生物样本库相继建立，但是实际上临床标本资源并没有得到及时有效的利用^[38]。有研究证明玻璃化冻存可实现肿瘤组织的活性保存，冻存前后肿瘤组织的生物学活性和组织学特征均未发生显著改变^[39-40]。通过玻璃化冻存技术可以大幅提升活性肿瘤组织的利用率，对是实验标本的保存给予坚实的技术支持。

2.3.5  骨关节软骨的玻璃化冻存  骨关节软骨冻存技术常用于实验标本和软骨移植物的保存，在不加保护剂的情况下，软骨中的黏多糖成分浓度容易发生显著改变，导致软骨的硬度下降，进而影响了骨软骨移植的功能和长期存活的能力^[41]。由于骨软骨的自我再生潜力非常有限，其功能常受限于骨关节炎、骨创伤等病变，极大地影响了患者的生活质量。软骨移植是治疗关节软骨缺损的有效方法，但由于不能长时间保存软骨，其应用受到限制^[42]。近年来，有学者通过植入冷冻保存的活骨软骨同种异体移植物以促进膝关节软骨修复，疗效较为满意^[43]。另有学者通过注射低温冻存骨髓基质细胞修复椎间盘，实验结果表明其治疗潜力巨大^[44]。RAJAGOPAL等^[45]则通过髂关节软骨细胞冻存实验，成功证实了冻存技术安全可行，软骨细胞的生物学活性和特征未发生显著改变。随着冻存技术的不断优化，冻存软骨细胞修复关节软骨损伤有望在实验与临床治疗中得到同步推进。

生物体的低温冻存一直是生物医学领域的研究热点^[1]。传统的低温保存法主要含缓慢降温及低温保存两个步骤，容易导致细胞外冰晶的形成^[3]。由于细胞外形成冰晶，导致胞外溶质浓度升高，为重新恢复渗透压的平衡，渗透浓度梯度驱动细胞内液穿过半透膜，在降温速率缓慢的情况下，细胞体积收缩、胞内脱水，产生溶质性损伤；在降温速率较快的情况下，易造成细胞内冰晶的形成^[4-6]。而在复温过程中，由于胞外冰晶融化使水分渗入细胞内，会使细胞内出现再结晶的现象，最终对细胞造成损伤^[4]。所以，传统低温保存的损伤主要来自溶质性损伤和冰晶损伤，这两个问题的解决办法是使用冷冻保护剂，找到合适的冷却和复温速率。

玻璃化是通过使用高浓度的冷冻保护剂诱导组织细胞转变为玻璃样凝固态，并在-196 ℃条件下快速冷却的过程。在整个快速的冷却和复温过程中，细胞内外均无冰晶产生，有效避免了冷冻损伤，细胞活性得以保留^[7]。

目前动物及人的生殖细胞及干细胞均实现了玻璃化冻存，并获得了比传统低温保存更高的存活率和基本功能^[8-11]，但组织的玻璃化冻存仍处于探索阶段，冻存技术尚不成熟。目前玻璃化冻存技术的研究方向是寻找低毒高渗的冻存试剂，进一步优化冷冻程序，提高玻璃化冻存的有效性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  资料来源  由第一作者检索1994年1月至2019年10月PubMed数据库及万方医学网。英文检索词为“tissue；vitrification；cryopreservation”，中文检索词为“组织；玻璃化；冷冻保存”。

1.2  纳入与排除标准  

纳入标准：①文章所述内容与玻璃化冻存的生物学原理的研究相关；②与玻璃化冻存试剂分类研究相关的内容；③与组织玻璃化冻存研究相关的内容；④同一领域选择近期发表的文献。

排除标准：重复性研究。

1.3  数据提取  检索文献量总计950篇，阅读文题及摘要进行初筛，排除与研究目的相关性差及内容陈旧、重复的文献，纳入45篇符合标准的文献进行综述。文献检索流程图见图1。

玻璃化冻存可以防止细胞内外冰晶形成，避免了冰晶给细胞带来的多种损伤，有效保留了细胞的生物活性与基本功能。卵巢、皮肤、角膜、骨关节软骨及肿瘤组织均在一定程度上实现了活性保存，但玻璃化冻存的冰冻损伤和毒性损害仍然存在。完全实现高效的组织玻璃化冻存还需要进一步的探索实验和技术攻关，相信将来一定可以攻克组织冻存技术瓶颈。通过优化实验步骤，提升冻存效果，未来玻璃化技术在保留组织器官生物活性的同时，期待可以实现更高水平组织器官的功能保留。技术的发展也将进一步逐步扩大玻璃化冻存的应用领域，在活性移植移植、活性生殖细胞冻存、濒危动植物种的救助与繁殖等多个领域发挥更大的作用。 

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文题释义：

玻璃化冷冻保存：是利用这些高浓度的低温保护剂组合成玻璃化冻存液，通过与水分子发生强烈的水合作用，增加溶液黏性，降低冰晶形成速度，从而使细胞在快速降温或复温过程中得以保护。

玻璃化：对于非晶高分子，当高分子通过降温从高弹态转变为玻璃态，或者通过升温从玻璃态转变为高弹态的过程称之为玻璃化转变，发生玻璃化转变的温度叫玻璃化转变温度。对于结晶高分子，玻璃化转变是指其非晶部分所发生的由高弹态向玻璃态(或者玻璃态向高弹态)的转变。因此，玻璃化转变是高分子中普遍存在的现象。但是玻璃化转变现象并不局限于高分子，一些小分子化合物也存在玻璃化转变。

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玻璃化冻存则是指利用多种高浓度的冷冻保护剂联合形成的玻璃化冷冻保护液保护悬浮细胞，直接投入液氮进行冻存的方法，以该种方法冻结的细胞悬液没有冰晶的形成，细胞冻存是最常用的仍是前一种方法。

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