针刺对一次离心运动模型大鼠白细胞介素6表达的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0540

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
离心运动：运动时骨骼肌进行收缩，在产生张力的同时起止点相互远离被迫拉长，这种运动方式被称为离心运动，也被称为退让工作，在运动的过程中肌肉做负功，一些情况下离心运动方式可以起到保护作用，例如高处下跳时股四头肌的离心收缩。
白细胞介素6：一种糖基化蛋白，相对分子质量在22 000-27 000，带28个信号序列，作为一种细胞因子具有较多的生物学功能，能够刺激细胞生长、促进细胞增殖分化、协同其他因子发挥作用等，其来源广泛包括骨骼肌细胞、中性粒细胞、T细胞、B细胞、造骨细胞等众多类型细胞。

摘要
背景：白细胞介素6是一种细胞因子，其来源广泛，在运动后骨骼肌能够大量产生并对运动功能恢复起到重要作用；运动后进行骨骼肌针刺能够改善骨骼肌的超微结构，降低损伤程度，促进功能恢复。目前尚未见到针刺对运动后白细胞介素6影响的报道。
目的：探究针刺干预对一次离心运动后大鼠白细胞介素6的影响。
方法：114只雄性SD大鼠，随机分为：安静对照组(n=6)、单纯运动组(n=36)、单纯针刺组(n=36)、运动针刺组(n=36)。单纯运动组和运动针刺组均在坡度-16°的跑台上进行一次离心运动，单纯针刺组和运动针刺组进行小腿三头肌的斜刺。各组处理后，除安静组直接取材，其余3组分别在干预后0，2，24，48，72，120 h时间点取材，每个时间点6只。Western Blot法分别检测比目鱼肌、股直肌白细胞介素6的蛋白表达；ELISA法检测血浆中白细胞介素6水平。
结果与结论：①单纯针刺处理后，比目鱼肌和股直肌中白细胞介素6蛋白表达以及血浆中白细胞介素6水平均无明显变化(P > 0.05)；②一次离心运动后，比目鱼肌、股直肌和血浆中白细胞介素6均出现不同程度升高，且比目鱼肌与股直肌间白细胞介素6表达无明显差异(P > 0.05)；③运动后针刺能明显下调比目鱼肌白细胞介素6蛋白峰值表达(P < 0.05)，而股直肌和血浆中白细胞介素6表达无明显变化(P > 0.05)；④结果表明，对骨骼肌进行直接针刺干预不能引起白细胞介素6明显变化，骨骼肌在离心运动后会分泌较多的白细胞介素6，同时进行针刺干预能够降低针刺部位白细胞介素6的峰值量；针刺能够在局部对白细胞介素6产生明显作用，对于其他部位的骨骼肌和血浆未能产生显著效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0001-7152-7676(白胜超)

关键词: 离心运动, 骨骼肌, 血浆, 白细胞介素6, 针刺, 组织构建

Abstract:

BACKGROUND: Interleukin-6, is a cytokine that has wide sources. Interleukin-6 increases in the skeletal muscle after exercise, which plays an important role in motor function recovery. Acupuncture at the skeletal muscle after exercise can improve the ultrastructure of skeletal mscle, alleviate injury and promote functional recovery. However, acupuncture effects on the interleukin-6 post exercise remains unknown.
OBJECTIVE: To explore the influence of acupuncture intervention on interleukin-6 in rats after eccentric exercise.
METHODS: Totally 114 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into four groups: control group (n=6), exercise group (n=36), acupuncture group (n=36) and exercise plus acupuncture group (n=36). The rats in the exercise and exercise plus acupuncture groups were submitted to eccentric exercise on a downward treadmill at 16° decline. The rats in the acupuncture and exercise plus acupuncture groups were subjected to the oblique acupuncture at the triceps surae. Samples except the control group were collected at 0, 2, 24, 48, 72 and 120 hours after treatment (n=6 per group at each time point). Protein expression level of interleukin-6 in the soleus and rectus femoris was detected by western blot assay. The plasma level of interleukin-6 was determined by ELISA.
RESULTS AND CONCLUSION: In the acupuncture group, the protein expression level of interleukin-6 in the soleus and rectus femoris and plasma level of interleukin-6 showed no significant changes (P > 0.05). After eccentric exercise, the interleukin-6 levels in the soleus, rectus femoris and plasma were significantly increased, and the protein expression level of interleukin-6 did not differ significantly between soleus and rectus femoris (P > 0.05). Acupuncture intervention after exercise, the protein expression level of interleukin-6 in the soleus was significantly reduced (P < 0.05), while interleukin-6 levels in the rectus femoris and plasma showed no significant change (P > 0.05). These findings imply that acupuncture cannot markedly change the interleukin-6 level in normal rats. Eccentric exercise can lead skeletal muscle to create more interleukin-6, and acupuncture intervention after eccentric exercise can reduce the amount of interleukin-6 at peak phase in the needling part. But its effect is local, not significant on the skeletal muscle of other parts and plasma.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Muscle, Skeletal, Interleukin-6, Acupuncture, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析实验选用大鼠114只，分为4组，实验过程中无脱失，全部进入结果分析。

2.2 比目鱼肌中白细胞介素6的变化情况分组方式的主体效应检验(P < 0.01)，进行事后多重检验，结果表明，对目前的结果分析而言，尚不能认为安静对照组和单纯针刺组之间差异有显著性意义(P > 0.05)，但安静对照组和单纯运动组、运动针刺组相比差异有显著性意义(P < 0.01)，单纯针刺组和运动针刺组差异显著性显著性意义(P < 0.01)，单纯运动组和运动针刺组差异显著性意义(P < 0.05)，其中安静对照组和单纯运动组的均值差异最大。提示：运动后进行比目鱼肌的针刺对该部位白细胞介素6的表达具有明显作用。取材时相的主体效应检验(P < 0.01)。进一步的事后多重检验，结果显示，0 h与2，24，48，120 h，2 h与24，48，72，120 h等差异都有显著性意义(P < 0.05或P < 0.01)，两因素交互作用检验(P < 0.05)。

实验结果的单因素方差分析结果见表1，相应的蛋白表达见图1。

2.3 股直肌中白细胞介素6的变化分组方式的主体效应检验(P < 0.01)，进行事后多重检验，结果表明，就目前的结果分析而言，尚不能认为安静对照组与单纯针刺组之间、单纯运动组与运动针刺组之间差异有显著性意义(P > 0.05)，但安静对照组和单纯运动组、运动针刺组相比差异有显著性意义(P < 0.01)，单纯针刺组和运动针刺组差异有显著性意义 (P < 0.01)，其中安静对照组和单纯运动组的均值差异最大。提示：运动后进行比目鱼肌针刺对股直肌中白细胞介素6表达并未有显著作用。取材时相的主体效应检验(P < 0.01)，进一步的事后多重检验，结果显示，0 h与2，24，48，120 h以及2 h、120 h与所有时相相比差异都有显著性意义(P < 0.05或P < 0.01)，两因素交互作用检验(P < 0.05)。

实验结果的单因素方差分析结果见表2，相应的蛋白表达见图2。

2.4 离心运动后大鼠比目鱼肌与股直肌中白细胞介素6的比较对单纯运动组大鼠比目鱼肌与股直肌中两组白细胞介素6的蛋白表达情况进行统计学检验，就目前的结果分析而言尚不能认为差异有显著性意义(P > 0.05)。

2.5 大鼠血浆中白细胞介素6的变化分组方式的主体效应检验(P < 0.01)，进行事后多重检验，结果表明，就目前的结果分析而言，尚不能认为安静对照组与单纯针刺组之间、单纯运动组与运动针刺组之间差异有统计学意义，但安静对照组和单纯运动组、运动针刺组相比较差异均有显著性意义(P < 0.01)，单纯针刺组和运动针刺组两组相比差异也同样有显著性意义(P < 0.01)，其中安静对照组和单纯运动组的均值差异最大。提示：运动后进行比目鱼肌针刺对血浆中白细胞介素6质量浓度并未有显著作用。取材时相的主体效应检验(P < 0.01)，进一步的事后多重检验，结果显示，0 h与120 h，2h与24，48，72，120 h等差异均有显著性意义(P < 0.05)，两因素交互作用检验(P > 0.05)。实验结果的单因素方差分析结果见表3。

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引言

材料方法

1.3.1 实验动物动物购买于北京华阜康生物科技股份有限公司(SCXK(京)2009-0007)，均为SPF级别8周龄雄性SD大鼠，共计114只，体质量(199.0±6.8) g。动物饲养、训练等工作均在中国医学科学院药植所标准动物房内进行，室内温度(22±2) ℃，每只鼠笼饲养6只，正常进食饮水。大鼠购买后经过适应性饲养3 d，之后开始正式实验。动物实验所遵循的程序已经过动物伦理委员会的审批。

实验大鼠购买后随机分为安静对照组、单纯运动组、单纯针刺组、运动针刺组，并且单纯运动组、单纯针刺组、运动针刺组根据取材时间的不同又分为相应的0，2，24，48，72，120 h等时相小组，每个小组均为6只大鼠。

1.3.2 主要试剂耗材和实验仪器 BCA试剂盒(23225)，Pierce公司，美国；GAPDH抗体(AB-P-R 001)，杭州至贤生物科技有限公司，中国；白细胞介素6抗体(ab6672)，艾博抗贸易有限公司，美国；HRP标记二抗(ZB-2301)，北京中杉金桥生物技术有限公司，中国；发光液(34080)，赛默飞世尔科技有限公司，美国；白细胞介素6 ELISA试剂盒(大鼠)，北京鑫方程生物技术有限公司，中国。电泳仪(Beomma2301)，LKB公司，瑞典；凝胶成像系统(BIO-RAD)，BIO-RAD公司，美国；酶标仪(BIO-RAD)，BIO-RAD公司，美国；汉医牌针灸针(0.25 mm)，津食药监械(准)字2009第2270002号，中国。

1.4 实验方法

1.4.1 实验模型和取材

一次性大负荷运动方案：大鼠运动方式参照经典的离心运动模型^[12]，正式实验之前大鼠在无坡度跑台进行3 d的适应性训练(16 m/min)，第1天运动5 min，第2天运动时间为10 min；第3天进行休息。之后进行正式实验，方案为：跑速均为16 m/min，跑台坡度为-16°，建立下坡跑模型，训练时间为1.5 h。单纯运动组和运动针刺组大鼠进行运动，安静对照组和单纯针刺组大鼠不进行运动。

针刺方案：运动针刺组大鼠在运动结束后即刻进行针刺，单纯针刺组大鼠同时间进行针刺干预。将大鼠放置于固定器中进行固定，消毒处理双后肢，将针灸针(规格为直径0.25 mm)沿大鼠小腿三头肌以进针角度约为30°的纵向从远端向上斜刺，穿过小腿三头肌的肌腹，针刺大鼠比目鱼肌位置，留针2 min^[4]，运动针刺组和单纯针刺组仅进行一次针刺干预，单纯运动组和单纯安静组不进行针刺。

1.4.2 取材单纯针刺组、单纯运动组、运动针刺组在干预后对应的时相点进行取材，安静组与单纯运动0 h组同时进行取材。在不同时相组，每只大鼠均取骨骼肌和血样，一一对应，血样非连续取样。大鼠腹主动脉采血至抗凝管中，静置10-20 min后进行离心，转速为3 000 r/min，离心时间为20 min，取上清液用于ELISA实验备测。比目鱼肌、股直肌取样后于-80 ℃低温冰箱存储，用于之后的Western Blot检测。

1.5 主要观察指标

1.5.1 Western Blot 按照肌组织与裂解液1 mg∶10 μL的比例加入并匀浆，离心机(4 ℃，14 000 r/min，10 min)进行离心后取上清，BCA试剂盒进行浓度测定，调整样品为统一浓度，加入样缓，煮沸后存低温冰箱备用。制备SDS-PAGE凝胶，电泳(90 V，90 min)，转膜(300 mA，80 min)，5%BSA进行封闭3 h，一抗4 ℃孵育过夜(白细胞介素6：1∶2 000，GAPDH：1∶1 000)，洗膜，二抗室温孵育1.5 h(稀释比例1∶5 000)，洗膜后曝光呈像。Gel-pro蛋白分析软件进行条带灰度值分析，所得数值除以对应内参后的比值为蛋白的相对表达值。

1.5.2 ELISA 血浆恢复室温待用，稀释标准品，加入待测样品及标准品，并设置空白孔，37 ℃条件下温育30 min，之后去掉液体，并洗涤5次，洗涤后加入酶标试剂液，再进行孵育，显色，最后加入终止液，酶标仪测吸光度值并进行浓度计算。

1.6 统计学分析应用SPSS 19.0进行统计分析，结果以x(_)±s的形式表示，对分组方式和取材时相等因素进行多因素方差分析，如主效应检验显著(P < 0.05)则采用LSD方法进行事后多重比较分析，对因素内各观测值之间的数据比较则采用单因素方差分析，方差齐性时用LSD方法，方差不齐性时用Tamhane’s方法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

白细胞介素6作为细胞因子和运动具有重要关系^[13]。早期研究认为白细胞介素6主要来源于炎症细胞，现在研究发现许多细胞都能表达白细胞介素6。安静的情况下，骨骼肌中的白细胞介素6表达量相对较低，而运动时骨骼肌则成为白细胞介素6的主要分泌来源。

对该实验结果进行多因素方差分析，主体间效应检验表明分组方式和取材时间均对白细胞介素6产生重要影响，说明此模型较为成功。事后多重检验表明，比目鱼肌和血浆中白细胞介素6均受时相的影响较大，其中干预后的0 h和2 h时相是该实验中白细胞介素6变化的主要时刻点。

对于单独针刺骨骼肌来研究白细胞介素6变化的实验并不多见，Ameis等^[14]对大鼠进行针刺处理，发现针刺后出现炎症浸润，白细胞介素6短时间增加，并导致部分肌纤维的坏死。该实验中比目鱼肌和股直肌在单纯进行针刺后发现较对照组均无显著性差异，且白细胞介素6的变化趋势并不显著，这应该是和针刺处理手段具有重要关系，或许是针刺比目鱼肌导致白细胞介素6产生的量较少且尚不足以引起显著性变化结果，尤其是入血后血浆白细胞介素6的浓度较低更难被观察到。

对于运动对白细胞介素6的影响，Pedersen等^[15]研究发现在运动员进行马拉松比赛后血清中白细胞介素6上升至安静状态时的50倍。Ullum等^[16]让运动员以75%最大摄氧量强度进行蹬踏功率自行车，持续时间为1 h，并对血浆中单核细胞、白细胞介素6以及其他炎性因子进行了检测，结果发现被试血浆中白细胞介素6的浓度明显升高，并认为在运动过程中血浆白细胞介素6水平的增加不可能是血浆单核细胞激活的结果。Steensberg等^[17]报道，6名健康男子以40% VO_2max强度进行单腿的伸膝运动后，运动腿释放大量的白细胞介素6进入血浆中，而非运动腿的白细胞介素6释放量则基本不变。以上研究结果表明在一定的强度下运动可以使白细胞介素6的表达增多。该研究的事后多重检验结果显示离心运动能够使白细胞介素6显著升高，这与目前较多研究结论相一致^[18-19]。

苏全生等^[18]指出，一次大负荷离心运动后大鼠血浆白细胞介素6显著高于运动前水平，用大蒜素干预处理后能够明显使离心运动后大鼠的血浆白细胞介素6降低，并认为大蒜素对大强度离心运动后肌源性白细胞介素6有抑制的作用效果；赵广高等^[19]人体试验结果也证明，运动员在一次大负荷离心运动后血浆白细胞介素6的浓度在运动后即刻就明显升高，在运动后的24 h和48 h时相下仍然要高于运动前的水平，认为在进行离心运动时机械的牵拉导致骨骼肌细胞膜产生一定的损伤，引起肌细胞膜的通透性变化，使血浆中白细胞介素6水平一直持续较高。结合此次研究的结果，提示一次大负荷离心运动可促使白细胞介素6表达增加。从运动后白细胞介素6峰值的变化情况来看，Rohde等^[20]报道了健康成年男子在功率自行车进行1 h的离心运动，采用一条腿的长时间离心运动，之后进行检测血浆中的白细胞介素6的表达，发现血浆白细胞介素6的浓度在运动之后的2 h就达到峰值，在运动后24 h已经能够恢复至运动前的水平，并且认为细胞因子的应答与骨骼肌的蛋白水解无关。Ostrowski等^[21]对马拉松运动员进行检测，观察到马拉松比赛后即刻已经开始升高，发现被试者血浆中的白细胞介素6浓度达到峰值，在运动后2 h仍然是运动前的14倍表达水平，并且认为运动性骨骼肌肌纤维的破坏能够引发局部产生白细胞介素6。Bruunsgaard等^[22]对9名健康男子以同一运动负荷先向心运动30 min后，间隔2周再进行30 min急性离心运动，分别在两次运动开始后的20 min、30 min及运动后2 h、2 d、4 d和7 d等不同时间点进行取血检测，结果显示只有离心运动组的血浆白细胞介素6在运动开始后2 h有显著升高，而其他未有明显变化。但与Bruunsgaard的结果不同，其原因可能是实验对象和运动模型有较大的不同所致。

对于肌纤维类型和白细胞介素6的分泌之间是否存在关联，Hiscock等^[23]让受试者以55% VO_2max强度连续进行 2 h的自行车运动，并进行肌肉活检，结果发现，运动后白细胞介素6出现升高，并且在2型肌纤维中增加明显，认为在骨骼肌收缩过程中肌肉是产生白细胞介素6的重要部位，白细胞介素6主要来源于快肌纤维。Fischer等^[24]让受试者进行双腿的伸膝运动，进行3 h，对股外侧肌进行肌肉活检采样，在安静组、运动3 h后即刻、运动后3 h恢复期进行检测，却发现在运动3 h组和3 h恢复期的白细胞介素6 mRNA明显增加，并且蛋白含量增多，但白细胞介素6主要来自于慢肌纤维。Pernille等^[25]的人体试验结果表明，通过进行3 h的自行车运动，之后进行活检发现运动后6 h白细胞介素6明显增加，白细胞介素6来源于快肌和慢肌纤维中，且两者的表达量无差异，并且在小鼠中进行验证，发现结果相同。这些实验结果并不相同，且差异较大，王今越等^[26]认为这和运动的时间、强度等关系较大，即运动时被动员的那一类型肌纤维是白细胞介素6分泌的主要来源。大鼠的比目鱼肌主要是慢肌纤维，股直肌主要是快肌纤维，在该实验中发现离心运动后比目鱼肌和股直肌中的白细胞介素6变化趋势基本一致，差异无显著性，提示该研究中大鼠肌源性白细胞介素6主要来源于快肌和慢肌两种肌纤维。

对于运动后针刺干预对白细胞介素6的影响，目前相关的研究较少。林玉敏^[27]用艾灸做过类似研究，首先建立慢性疲劳大鼠模型，之后对足三里组、肾俞组、足三里合肾俞组的大鼠进行相应穴位的艾灸，每穴每天艾灸1次，每次10 min，连续治疗5 d，休息2 d，连续治疗3周，发现艾灸干预后大鼠白细胞介素6水平明显降低，差异有显著性意义(P < 0.05)。该实验结果显示针刺能明显抑制离心运动诱导的比目鱼肌白细胞介素6水平，说明针刺处理对离心运动后针刺部位白细胞介素6蛋白的表达起到了显著作用，但对比股直肌和血浆中白细胞介素6水平，并未见显著性差异，表明针刺对非针刺部位的骨骼肌不具有显著影响，其对比目鱼肌产生的作用效果是局部的，所引起的变化很难使非针刺部位骨骼肌和血液产生明显变化。对于运动针刺后时相变化情况，该实验在运动针刺后0 h时相与单纯运动组无差异，主要原因可能是针刺发挥作用效果需要一定时间上的累积，而2 h组作为峰值时相，此时比目鱼肌中白细胞介素6表达显著低于单纯运动组，提示运动后针刺干预能显著降低白细胞介素6峰值时相的表达量，推测这可能是由于针刺致使骨骼肌胞浆内的钙离子迅速恢复到正常水平以及促使p38的表达下降，最终导致白细胞介素6的生成量减少。

研究还发现，血浆和比目鱼肌中白细胞介素6水平并不完全相同，但变化趋势基本一致，前后时相也未有显著性差异，排除试剂盒灵敏度问题，另一部分原因主要是由于ELISA反映的是全身状况，不同部位骨骼肌的疲劳程度并不完全相同，其所分泌的白细胞介素6在释放入血的时间和量上有所不同，此外，其他组织器官也会分泌白细胞介素6，例如肝脏、脂肪组织等，这些原因都会导致骨骼肌和血浆中的检测结果并不完全一致。

因此，研究认为对骨骼肌进行直接针刺干预不能引起白细胞介素6明显变化，骨骼肌在离心运动后会分泌较多的白细胞介素6，同时进行针刺干预能够降低针刺部位白细胞介素6的峰值量；针刺能够在局部对白细胞介素6产生明显作用，对于其他部位的骨骼肌和血浆未能产生显著效果。

白细胞介素6作为炎症因子具有许多功能^[28]，在运动后机体自我修复以及功能恢复方面发挥了重要作用；针刺作为传统医学中治疗疾病的重要手段，在治疗运动性损伤方面同样获得了很好的效果。目前大负荷运动后针刺对骨骼肌促进恢复的作用是否和白细胞介素6有关，还未有相关报道。该研究发现针刺可以降低运动后白细胞介素6的表达，为探究针刺在运动性骨骼肌损伤方面的作用机制寻找到新突破，由于白细胞介素6具有广泛的作用，今后可以在此基础上继续进行深层次的研究。需要说明的是该研究还存在一定的局限性，仅从运动后针刺对白细胞介素6的影响方面进行了探讨，并未对白细胞介素6/STAT3信号通路进行探究^[29-30]，另外，白细胞介素6来源较为广泛，在运动后骨骼肌和其他细胞均能大量产生，探寻运动及针刺后白细胞介素6的来源同样具有重要意义，受条件限制未能进行此方面的实验，以后可以在这些方面进一步研究，以弥补不足。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程