胶原-生物活性玻璃-聚己内酯复合支架材料促进人牙髓细胞的增殖、迁移和分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0743

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

胶原-生物活性玻璃-聚己内酯复合支架材料：胶原是最常用的天然生物材料，是骨组织和牙本质的天然成分，生物相容性良好，但机械性能差且易收缩，不利于牙髓细胞生长；生物活性玻璃作为一种人工合成材料，其骨诱导性能良好，与胶原共同组成的胶原-生物活性玻璃材料可促进牙本质的形成和修复；但胶原-生物活性玻璃复合材料的缺点是机械性能差，不利于牙髓细胞的迁移、增殖和分化；综合胶原、生物活性玻璃和聚己内酯合成的复合材料胶原-生物活性玻璃-聚己内酯可兼具良好的生物相容性和机械性能。

牙髓细胞：是牙髓中的主要细胞，呈星形，有胞质突起互相连接，核染色深，胞质淡染，均匀，主要功能是可增生，分化新的成纤维细胞或牙本质细胞。

背景：胶原-生物活性玻璃-聚己内酯复合材料具有良好的生物相容性、机械性能及可降解性，对细胞的黏附、增殖及血管生成极为有利。

目的：观察胶原-生物活性玻璃-聚己内酯复合支架材料对人牙髓细胞的增殖、迁移和分化能力的影响。

方法：分离培养人牙髓细胞，接种在胶原-生物活性玻璃-聚己内酯支架材料上，接种前及接种后第1，3，7，14，24天，采用MTT法检测细胞增殖，采用划痕实验检测细胞的迁移能力，采用ELISA法检测细胞上清液中的碱性磷酸酶活性。

结果与结论：①与接种前比较，接种于胶原-生物活性玻璃-聚己内酯支架材料上的细胞增殖能力明显增强(P < 0.01)；随着接种时间的延长，胶原-生物活性玻璃-聚己内酯支架材料上的细胞增殖能力逐渐增强；②与接种前比较，接种于胶原-生物活性玻璃-聚己内酯支架材料上的细胞迁移能力明显增强(P < 0.01)；随着接种时间的延长，胶原-生物活性玻璃-聚己内酯支架材料上的细胞迁移能力逐渐增强；③与接种前比较，接种于胶原-生物活性玻璃-聚己内酯支架材料上的细胞上清液中碱性磷酸酶水平明显增加(P < 0.01)；随着接种时间的延长，胶原-生物活性玻璃-聚己内酯支架材料上的细胞上清液中碱性磷酸酶水平逐渐增强；④结果表明，胶原-生物活性玻璃-聚己内酯复合支架材料可促进人牙髓细胞的增殖、迁移和分化过程。

ORCID: 0000-0001-7869-8072(刘建辉)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 胶原-生物活性玻璃-聚己内酯复合支架材料, 人牙髓细胞, 增殖, 迁移, 分化

Abstract:

BACKGROUND: Collagen-bioglass-polycaprolacton (COL-BG-PCL) composites have good biocompatibility, mechanical properties and biodegradability that are beneficial to cell adhesion, proliferation and angiogenesis.

OBJECTIVE: To study the effect of COL-BG-PCL bioactive scaffold on the proliferation, migration and differentiation of human dental pulp cells (hDPCs).

METHODS: hDPCs were isolated and cultured on the COL-BG-PCL bioactive scaffold. MTT, cell scratch test and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) assay were used to detect the proliferation, migration and differentiation abilities of hDPCs before and at 1, 3, 7, 14, 24 days after inoculation onto the COL-BG-PCL bioactive scaffold.

RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the cells without inoculation onto the COL-BG-PCL bioactive scaffold, (1) the proliferation ability of the cells cultured on the COL-BG-PCL scaffold was significantly enhanced (P < 0.01), and with the prolongation of the inoculation time, the cell proliferation ability was gradually increased; (2) the cell migration ability of the cells cultured on the COL-BG-PCL scaffold was significantly enhanced (P < 0.01), and with the prolongation of the inoculation time, the migration ability of the cells cultured on the COL-BG-PCL scaffold was gradually increased; (3) the level of alkaline phosphatase in the supernatant of the cells cultured on the COL-BG-PCL scaffold was significantly increased (P < 0.01), and with the prolongation of the inoculation time, the level of alkaline phosphatase in the supernatant was gradually increased. In summary, the COL-BG-PCL scaffold can promote the proliferation, migration and differentiation of hDPCs.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Fibroblasts, Collagen, Cell Proliferation, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 6

2.1 人牙髓细胞的培养及鉴定牙髓细胞原代培养第10天，镜下可观察到有单细胞从人牙髓组织中生长出来，培养至第2代的人牙髓细胞生长状态良好，细胞单层生长，呈现出成纤维细胞样形态；培养至第5代，人牙髓细胞呈纺锤状生长，细胞核/质比和细胞分泌明显增多，胞浆均匀，细胞核圆且核仁清晰，细胞生长状态良好(图1)。取第4代的细胞进行免疫组织化学鉴定，结果显示角蛋白染色阳性且波形丝蛋白染色阴性，鉴定该细胞为间充质来源的牙髓细胞(图2)。牙髓细胞在COL-BG-PCL复合支架材料上的生长见图3所示，镜下可观察到人牙髓细胞接种2 h后细胞附着并铺展在支架表面，7 d后人牙髓细胞均匀分布，细胞数明显增加。

2.2 COL-BG-PCL复合支架材料对人牙髓细胞增殖能力的影响 MTT检测结果显示：与接种第0天(即未接种COL-BG-PCL复合支架材料的细胞)相比，接种第1，3，7，14，21天的人牙髓细胞增殖能力均显著增加，且与接种第1天相比，接种第3，7，14，21天的人牙髓细胞的增殖能力显著增加，见图4。

2.3 COL-BG-PCL复合支架材料对人牙髓细胞迁移能力的影响细胞迁移实验结果显示：与接种第0天相比，接种第1，3，7，14，21天的人牙髓细胞迁移能力显著增加；与接种第1天相比，接种第3，7，14，21天的人牙髓细胞细胞迁移能力显著增加，见图5。

2.4 COL-BG-PCL复合支架材料对人牙髓细胞分化能力的影响 ELISA检测人牙髓细胞上清液中碱性磷酸酶浓度的结果显示：与接种第0天相比，接种第1，3，7，14，21天的人牙髓细胞分化能力均显著增加；与接种第1天相比，接种第3，7，14，21天的人牙髓细胞分化能力显著增加，见图6。

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引言

材料方法

1.1 设计体外细胞学观察实验。

1.2 时间及地点实验于2016年5月至2017年4月在沧州医学高等专科学校口腔系实验室完成。

1.3 材料 COL-BG-PCL复合支架材料，由华南理工大学生物医学工程中心研制，包含7%的胶原、23%的生物活性玻璃和70%的聚己内酯；细胞培养用试剂包括DMEM培养基、胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素、L-谷氨酰胺、3%Ⅰ型胶原酶和0.25%胰蛋白酶-EDTA (Gibco，美国)；MTT检测试剂盒(碧云天，广州)；碱性磷酸酶检测试剂盒(康为世纪，北京)；Multiskan MK 3酶标仪(Thermo，美国)。

1.4 实验方法

1.4.1 人牙髓细胞的培养和处理方法　取健康成年人拔出的阻生齿(供者对实验知情同意并签署知情同意书)，取牙髓组织并清洗，无菌小剪刀将组织剪碎成约1 mm× 1 mm×1 mm的小块，2.5 g/LⅠ型胶原酶消化60 min，培养基终止消化后，将消化悬液收集到15 mL离心管中， 1 200 r/min离心5 min，弃上清，加入含2.5 mmol/L谷氨酰胺和含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基，将细胞轻轻吹打混匀，将细胞接种到10 mm培养皿中，置于37 ℃、含体积分数5%CO₂的恒温培养箱内培养，每3 d换1次液，待细胞生长至约90%汇合度时消化传代。取第4代细胞进行免疫组织化学鉴定，结果显示角蛋白染色阳性且波形丝蛋白染色阴性，鉴定该细胞为间充质来源的牙髓细胞。取生长状态良好的第5代细胞用于后续的增殖、迁移及分化实验。

1.4.2 牙髓细胞的增殖、迁移和分化能力检测取第5代人牙髓细胞，调整细胞浓度至10⁹ L^-1，接种到装有COL-BG-PCL复合支架材料的96孔板中，接种第0，1，3，7，14，21天分别进行以下检测。

细胞增殖能力检测：按照说明书进行操作，在加入MTT试剂后读取490 nm处的吸光度值，每个样设置3个复孔，实验重复3次。

细胞迁移能力检测：接种细胞后用200 μL的枪头画一纵行的划痕，根据镜下观察计算划痕面积，初始面积为A₀，接种后1，3，7，14，21 d后的划痕面积为A_n，迁移率计算公式为(A₀-A_n)/A_n，每个样设置3个复孔，实验重复3次。

细胞分化能力检测：收集细胞上清液，按说明书进行操作，将稀释的样品加样并盖上封板膜，轻摇后在37 ℃反应60 min，洗板5次，按顺序分别加入碱性磷酸酶检测试剂，加入显色液A和B，37 ℃下显色10 min后加入终止液， 10 min内读取410 nm处的吸光度值，据此绘制浓度标准曲线(纵坐标为吸光度值，横坐标为标准液浓度)，根据所测吸光度值找出标准曲线上对应的样本浓度，记录实验结果，每个样设置3个复孔，实验重复3次。

1.5 主要观察指标接种第0，1，3，7，14，21天，人牙髓细胞的增殖、迁移及分化能力。

1.6 统计学分析采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，所有实验结果均以x(_)±s的形式来表示。t 检验用于两组间数据比较，单因素方差分析与LSD-t 检验用于多组间数据比较。P < 0.05表示差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

目前临床治疗牙髓损伤的策略是放置支架材料，以模拟牙髓细胞外基质的条件，从而实现对牙髓细胞增殖、迁移及分化过程的支持^[9-10]。临床常用的支架材料包括人工合成材料、复合材料和天然生物材料^[11-12]。支架材料本身的生物学形态、与邻近软硬组织的关系及相互作用是评价支架材料生物学性能的重要因素。目前认为理想的生物支架材料应同时满足以下条件：具有易设计或修饰的基本单元；可特异性促进/抑制支架材料与细胞的相互作用；可引发的免疫或炎症反应小；生物降解速度可控；无细胞毒性；材料的生产、纯化和处理简易且可升级；与生理条件或水具有化学相容性^[13]。

组织工程是修复牙髓损伤的理想方式，生物支架材料的发展发现了许多具有优良特性的材料。胶原作为一种支架材料可特异性识别分子信号，促进细胞的黏附、生长及分化过程，具有良好的生物相容性^[14]。胶原间的孔隙可使细胞在其中生长，其本身所含的细胞黏附信号肽序列可引导细胞对胶原支架的特异性识别，使细胞保持一定的表型和活性。胶原的作用类似于细胞外基质，可吸收性强、不良反应小^[15]。目前胶原被广泛应用于牙髓的再生和修复中，在胶原支架上植入人牙髓细胞后，可促使牙髓样组织的生成^[16]。虽然胶原作为骨组织和牙本质的主要天然成分，具有优良的组织相容性和生物活性，但其机械性能较差，作为支架材料，易发生收缩，对细胞生长极为不利且代谢率也较快^[17]。

生物活性玻璃具有良好的骨引导性和骨诱导性，可激活成骨相关基因，促进血管形成。同时生物活性玻璃也具有良好的抗菌性、可控的生物降解性、良好的机械性能、较高的生物活性，目前生物活性玻璃被广泛应用于骨组织的修复及再生^[18-20]。然而研究显示在体外实验中，细胞会瞬时接触高浓度的生物活性玻璃离子产物，但细胞并不能适应逐渐增加的生物活性玻璃离子浓度，同时生物活性玻璃材料的脆性较大、机械强度低，在生理环境中抗破坏及抗疲劳的强度低，这些缺点使得生物活性玻璃的应用受限^[21-22]。

一般而言，高分子材料可塑性强，抗张能力强。将生物活性玻璃与高分子材料复合可显著提高支架材料的整体性能，并能控制生物活性玻璃离子产物的释放速度。聚己内酯就是一种合成的高分子材料，其生物活性差，但机械性能良好^[23]。研究显示生物活性玻璃的韧性较差，常在生物活性玻璃中加入聚己内酯或羟基磷灰石等材料以改善其机械性能，增加支架材料的孔隙率和孔径，通过该种方法将生物活性玻璃制备成具有特殊表面形态或内部结构的支架材料，可促进细胞的黏附、增殖和分化过程^[24-25]。聚己内酯的机械性能和降解性优良，对细胞的黏附、增殖极为有利，可诱导血管生成，由生物活性玻璃和聚己内酯组成的复合材料生物活性玻璃-聚己内酯可兼具良好的生物相容性和机械性能^[26]。另外，生物活性玻璃的离子产物可促进成骨细胞的分化和骨形成，而牙髓组织和骨组织有许多类似的组成成分，牙髓组织和骨组织对信号传导分子的反应也是类似的，因此生物活性玻璃支架材料也可能具有促进人牙髓细胞的分化和矿化的作用^[27]。研究显示，离子提取的新型纳米尺寸生物活性玻璃支架材料可显著增强人牙髓细胞的分化和矿化^[28]。聚己内酯支架材料虽然缺乏良好的生物活性，但其机械性能和可降解性极为优良。明胶、聚己内酯和磷酸钙形成的复合材料可促进成骨细胞的增殖和黏附能力^[29]，胶原和聚己内酯组成的支架材料可影响细胞的增殖、迁移和黏附功能，还可为血管的形成提供所需的三维空间^[30]。即胶原、生物活性玻璃和聚已内酯构成的支架材料可能兼具三者的优点。

目前，结合不同材料的特性，构建复合支架材料，来满足组织工程学及再生学的要求，是合成和开发新的支架材料的方向。对上述3种支架材料进行总结，即胶原是最常用的天然生物材料，是骨组织和牙本质的天然成分，生物相容性良好，但机械性能差且易收缩，不利于牙髓细胞生长；而生物活性玻璃作为一种人工合成材料，其骨诱导性能良好，与胶原共同组成的胶原-生物活性玻璃材料可促进牙本质的形成和修复^[31]。但胶原-生物活性玻璃复合材料的缺点是机械性能差，不利于牙髓细胞的迁移、增殖和分化^[32]。综合胶原、生物活性玻璃和聚己内酯合成的复合材料COL-BG-PCL可兼具良好的生物相容性和机械性能。

因此，此次研究通过观察体外人牙髓细胞在COL-BG-PCL复合支架材料上增殖、迁移和分化情况，初步探讨复合支架材料COL-BG-PCL是否可成为更适合牙髓再生的组织工程学的支架材料。此次研究中，为明确COL-BG-PCL复合支架材料对牙髓损伤的修复价值，在成功分离和培养人牙髓细胞的基础上，将人牙髓细胞接种在COL-BG-PCL复合支架材料上，并对人牙髓细胞的生长能力(包括增殖、迁移和分化能力)进行分析。当牙髓组织发生损伤时，人牙髓细胞开始向损伤部位迁移并在局部发生增殖和分化，分泌并产生细胞外基质，修复受损的牙髓组织。作者采用MTT细胞活力和细胞划痕迁移率实验分别检测细胞的增殖和迁移能力。人牙髓细胞的分化过程采用碱性磷酸酶来评价，碱性磷酸酶是细胞成骨向分化的分子标志物，在牙损伤的矿化过程中发挥重要作用^[33]。分化的牙髓细胞中碱性磷酸酶的含量显著高于未分化的牙髓细胞，并且分化程度越高，细胞合成和分泌碱性磷酸酶的能力越强，牙髓细胞的局部基质形成能力越强^[34-35]。研究结果显示在COL-BG-PCL复合支架材料的作用下，人牙髓细胞的增殖、迁移和分化能力均发生明显变化。接种COL-BG-PCL复合支架材料后的人牙髓细胞490 nm处吸光度值、迁移率和上清液中碱性磷酸酶浓度均显著增加，且随着接种时间延长，人牙髓细胞的吸光值、迁移率和碱性磷酸酶浓度逐渐增加，以上研究结果与已有研究结果“人牙髓细胞在胶原-生物活性玻璃和COL-BG-PCL复合支架材料上增殖和分化活性优于传统的胶原支架^[3]”与“COL-BG-PCL复合材料可通过增加Oct4A、SDF1、NICD、DMP-1、HMGB1和DSPP的表达，而促进人牙髓干细胞的增殖、迁移和分化^[9]”一致。说明COL-BG-PCL复合支架材料有助于促进人牙髓细胞的增殖、迁移和分化过程，有助于牙髓损伤的修复过程。

另外，已有研究多集中对牙髓干细胞在各种支架材料上的增殖、迁移或分化上，如生物活性玻璃58S/丝素蛋白复合材料可促进人牙髓干细胞的增殖与分化^[22]，该实验通过分别比较人牙髓干细胞在丝素蛋白材料、1 g/L 生物活性玻璃58S/丝素蛋白复合材料和5 g/L生物活性玻璃58S/丝素蛋白复合材料中的增殖和黏附及细胞形态、碱性磷酸酶活性、成牙本质细胞分化相关的特征性基因表达，证明牙髓干细胞在生物活性玻璃58S/丝素蛋白复合材料上可良好地生长、增殖、黏附及向成牙本质细胞分化，利于牙髓损伤的恢复；如通过比较基质细胞衍生因子和粒细胞集落刺激因子对人牙髓干细胞在体外形成牙本质的能力及细胞增殖和迁移能力影响的研究发现，基质细胞衍生因子对人牙髓干细胞细胞的增殖能力影响不显著，但能显著增加人牙髓干细胞细胞的迁移能力和形成牙本质的能力^[36]。而由于纤维样细胞即常说的牙髓细胞是牙髓中最主要的细胞成分，但其中也含有少量的未分化牙髓干细胞，但其数量较少，获取难度较大，培养条件较为苛刻，具体的分化方向目前的技术也存在一定的局限性^[3]。因此此次研究直接采用牙髓细胞，即其中包含了已分化的牙髓细胞，也包含未分化的牙髓干细胞，且已有研究显示直接采用牙髓细胞接种在多种支架材料上效果显著，如单纯的胶原支架材料、聚己内酯支架材料、聚乙交酯支架材料、聚丙交酯支架材料、乙交酯-丙交酯支架材料、生物活性玻璃支架材料或多种支架材料形成的复合材料，均可不同程度地促进细胞的增殖与分化^[3^，^5]。作者在此次研究中首次对COL-BG-PCL复合支架材料对牙髓细胞的体外增殖、迁移和分化能力作出了实验性的研究，证明了在牙髓组织中，由胶原、生物活性玻璃和聚己内酯复合而成的支架材料可显著促进牙髓细胞的增殖、迁移及分化。下一步也将选取更多的支架材料进行复合，在细胞的增殖能力、迁移能力和分化能力等方面与COL-BG-PCL复合支架材料的作用进行比较，为COL-BG-PCL复合支架材料运用于临床上牙髓损伤等多种口腔疾病的治疗提供更加丰富的理论支持。

综合以上分析，COL-BG-PCL复合支架材料可促进人牙髓细胞的增殖、迁移和分化过程，可能在牙髓损伤修复及再生组织工程学中有极大的应用价值。

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