静脉注射博来霉素诱导肺纤维化模型小鼠的稳定性评价

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.40.008

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (40): 6436-6443.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.40.008

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静脉注射博来霉素诱导肺纤维化模型小鼠的稳定性评价

涂常力¹，刘香²，郑晓滨¹，余加琳³，朱淑琴⁴，苏敏红¹，邬伟明¹，黄瑾¹

中山大学附属第五医院，¹呼吸内科，³门诊部，⁴病理科，广东省珠海市 519000；²顺德第一人民医院血液风湿科，广东省佛山市 528000

出版日期:2015-09-30 发布日期:2015-09-30
通讯作者: 黄瑾，博士，主任医师，教授，博士生导师，中山大学附属第五医院呼吸内科，广东省珠海市 519000 并列通讯作者：邬伟明，硕士，副主任医师，中山大学附属第五医院呼吸内科，广东省珠海市 519000
作者简介:涂常力，男，1985年生，江西省进贤县人，汉族，2011年中山大学毕业，硕士，主要从事呼吸疾病相关研究及诊疗。
基金资助:
珠海市“十一五”医学重点专科项目(330101020204)

Intravenous injection of bleomycin induces pulmonary fibrosis in mice: a stability evaluation

Tu Chang-li¹, Liu Xiang², Zheng Xiao-bin¹, Yu Jia-lin³, Zhu Shu-qin⁴, Su Min-hong¹, Wu Wei-ming¹, Huang Jin¹

¹Department of Respiratory Medicine, ³Outpatient Department, ⁴Department of Pathology, the Fifth Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Zhuhai 519000, Guangdong Province, China; ²Department of Blood Rheumatology, the First People’s Hospital of Shunde, Foshan 528000, Guangdong Province, China

Online:2015-09-30 Published:2015-09-30
Contact: Huang Jin, M.D., Chief physician, Professor, Doctoral supervisor, Department of Respiratory Medicine, the Fifth Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Zhuhai 519000, Guangdong Province, China Corresponding author: Wu Wei-ming, Master, Associate chief physician, Department of Respiratory Medicine, The Fifth Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, Zhuhai 519000, Guangdong Province, China
About author:Tu Chang-li, Master, Department of Respiratory Medicine, the Fifth Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Zhuhai 519000, Guangdong Province, China
Supported by:
“Eleventh Five-Year Plan”Key Medical Specialty Project of Zhuhai City of China, No. 330101020204

摘要/Abstract

摘要：

背景：建立理想的肺间质纤维化动物模型对探究肺间质纤维化发病机制及筛选有效防治药物尤为重要。

目的：建立一个反映人肺纤维化形成的小鼠模型改良方案。

方法：雄性C57BL/6小鼠56只，随机等分为A，B两组。A组为单次剂量注射模型，一次性尾静脉注入博来霉素200 mg/kg；B组为多次小剂量注射模型，每周经尾静脉注射博来霉素50 mg/kg，连续6周。

结果与结论： Micro-CT扫描显示A组在造模后第4周所形成的肺CT表现最具有代表性，可见周围肺野及肺底网格状阴影，不均匀的斑片状阴影，粗网状不透光影，6周时肺内病变范围有所减少；B组造模后肺CT病变类似A组，但随时间延长纤维化病变逐渐增多。A组肺泡炎、肺纤维化评分于造模后第4周达最高，6周有所下降，而B组于造模后逐渐增加，6周时较A组高。免疫组化显示异常的Ⅰ型胶原蛋白主要沉积在胸膜下、血管周围和肺泡间隔，与Masson染色所见的胶原纤维分布一致；转化生长因子β1和α平滑肌动蛋白在肺泡炎和肺纤维化部位表达明显增多；A组Ⅰ型胶原蛋白、转化生长因子β1、α平滑肌动蛋白的表达在造模后第4周达到峰值，并在第6周有所下降，而B组于造模后逐渐增加，6周时较A组高。A组小鼠肺组织羟脯氨酸含量于造模后第4周达到峰值，第6周有所下降，而B组于造模后逐渐增加，造模后第6周较A组高。说明尾静脉注射博来霉素可有效诱导肺间质纤维化，转化生长因子β1和α平滑肌动蛋白在肺纤维化发生发展中起着重要作用，且多次小剂量博来霉素诱导肺纤维化模型具有部分典型寻常型间质性肺炎特征，尤其在模型稳定性上明显优于单次大剂量博来霉素诱导肺纤维化模型，更加符合特发性肺间质纤维化演变过程。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 实验动物, 心肺及血管损伤动物模型, 肺纤维化, 博来霉素, 动物模型, 静脉注射, 特发性肺间质纤维化, 寻常型间质性肺炎

Abstract:

BACKGROUND: It is particularly important to establish an ideal animal model of pulmonary fibrosis to investigate the underlying pathogenesis and screen effective drugs to prevent and control pulmonary fibrosis.

OBJECTIVE: To establish a modified scheme of establishing mouse models that can reflect pulmonary fibrosis formation in humans.

METHODS: Fifty-six male C57BL/6 mice were randomly divided into two groups: A (a single large-dose injection) and B (multiple small-dose injections). Mice in group A were subjected to a single intravenous injection of bleomycin 200 mg/kg via the tail vein; and mice in group B received intravenous injections of bleomycin 50 mg/kg via the tail vein per week, totally for 6 weeks.

RESULTS AND CONCLUSION: Micro-CT scan images showed that pulmonary manifestations at the 4^th week after modeling was the most representative in group A, including peri-pulmonary field and the grid-like shadows on the lung bottom, uneven patchy shadows, opaque shadow. The range of lung lesions was slightly decreased at the 6^th week. The pulmonary pathological changes displayed on CT scans of mice from the group B were similar to those in group A, but the pulmonary fibrosis was gradually aggravated with time. The scores of alveolitis and pulmonary fibrosis in group A reached the highest level at the 4^th week after modeling, and slightly decreased at the 6^th week, while in group B, the scores of alveolitis and pulmonary fibrosis were gradually increased after modeling, and higher than those in group A at the 6^th week. Immunohistochemistry showed that abnormal type I collagen deposition was mainly distributed in the subpleural region, peri-vascular region and alveolar septa, which was consistent with the distribution of collagen fibers displayed by Masson staining. The expression of transforming growth factor β1 and α smooth muscle actin in the regions developing alveolitis and pulmonary fibrosis was significantly increased. In group A, the expression of type I collagen, transforming growth factor β1 and α smooth muscle actin reached the peak level at the 4^th week after modeling, and slightly declined at the 6^th week. In group B, the expression of typeⅠcollagen, transforming growth factor β1 and α smooth muscle actin was gradually increased after modeling, and was higher than that in group A at the 6^th week. The hydroxyproline content in lung tissue of mice in group A reached the peak at the 4^th week after modeling, and slightly declined at the 6^th week, however, in B group, it was gradually increased after modeling, and was higher than that in group A at the 6^th week after modeling. These results demonstrate that (1) intravenous injection of bleomycin via the tail vein can effectively induce pulmonary fibrosis; (2) transforming growth factor β1 and α smooth muscle actin play an important role in the occurrence and development of pulmonary fibrosis; (3) mouse models of pulmonary fibrosis induced by multiple injections of small-dose bleomycin have more typical characteristics of usual interstitial pneumonia in particular better stability, and are more in line with the evolution of idiopathic pulmonary fibrosis than mouse models of pulmonary fibrosis-induced by a single injection of large-dose bleomycin.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Pulmonary Fibrosis, Bleomycin, Disease Models, Animal

中图分类号:

R318

涂常力，刘香，郑晓滨，余加琳，朱淑琴，苏敏红，邬伟明，黄瑾. 静脉注射博来霉素诱导肺纤维化模型小鼠的稳定性评价[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(40): 6436-6443.

Tu Chang-li, Liu Xiang, Zheng Xiao-bin, Yu Jia-lin, Zhu Shu-qin, Su Min-hong, Wu Wei-ming, Huang Jin. Intravenous injection of bleomycin induces pulmonary fibrosis in mice: a stability evaluation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(40): 6436-6443.

图/表（结果） 5

2.1 造模成功动物数量及过程 A组小鼠死亡5只，主要发生在注射博来霉素后2周内；B组小鼠死亡6只，主要发生在注射博来霉素后第4周；其余小鼠均进入结果分析。造模流程见图1。 2.2 模型方法的改进多次小剂量尾静脉注射博来霉素成功建立小鼠肺纤维化模型。建模耗时较短，模型稳定，复制出部分人特发性肺纤维化特点。 2.3 模型稳定性多次小剂量尾静脉注射博来霉素诱导肺纤维化模型长观察期间模型稳定，病灶分布、病理学组织改变具有部分人特发性肺纤维化特点。 2.4 小鼠的生长情况及体质量变化两组小鼠从注射博来霉素开始出现不同程度的活动能力下降及挠鼻现象，食欲下降，毛发欠光滑，喜成堆蜷缩于笼子角落，注射部位即小鼠尾巴不同程度肿胀坏死。A组小鼠体质量在注射一两周下降明显，8 d时最低，为注射前的63.09%，随后体质量缓慢逐渐回升，造模后6周时与注射前差异无显著性意义(P=0.535)。B组小鼠注射前体质量与A组接近(P=0.301)，注射后小鼠体质量波动下降，11周时降至最低，为注射前的70.56%，造模后6周时有所上升，但仍低于注射前(P < 0.001)。造模后6周2组小鼠死亡率分别为17.86%和21.43%，差异无显著性意义(P=0.737；图2)。 2.5 小鼠肺部影像学结果 Micro-CT扫描显示，两组小鼠造模后早期多见磨玻璃影、支气管血管束增厚，中后期多见实变、索条状影、结节、支气管扩张等，大部分位于周围肺野(胸膜下)和远端肺血管周围，与人特发性肺间质纤维化高分辨CT影像类似。A组小鼠造模后第4周所形成的肺CT表现最具有代表性，可见周围肺野及肺底网格状阴影，不均匀的斑片状阴影，粗网状不透光影，6周时肺内病变范围有所减少，但仍以周围肺野(胸膜下)及肺底区病变为主。B组小鼠造模后肺CT病变类似A组，但随时间延长病变范围逐渐增多(图3)。

2.6 小鼠肺组织病理学表现苏木精-伊红染色显示，两组小鼠注射博来霉素后，胸膜下、血管周围、肺泡内和肺泡间隔内不同程度炎性细胞浸润，以淋巴细胞为主，可见少许浆细胞，部分肺泡腔被破坏或结构消失；Masson染色可见肺泡间隔不同程度的胶原蛋白沉积，甚至出现肺实质大片融合性病变，病变区域及轻度病变区域与正常肺组织的混杂分布(空间异质性)，病变区域主要位于胸膜下和血管。A组造模后2周可见小鼠肺组织出现大量炎症细胞浸润，4周可见广泛纤维化病变，部分可见小灶分布的成纤维细胞灶，6周时纤维化病变较前减轻；B组造模后4，6周时可见小鼠肺组织可见小灶分布的成纤维细胞灶(图4，5)。

A组肺泡炎症程度初期随时间延长而加重，在造模后第2周达到高峰，之后随时间延长各组肺泡炎症程度均呈下降趋势。B组肺泡炎症程度随着时间延长呈上升趋势，在造模后第6周达到高峰。两组小鼠肺泡炎评分差异有显著性意义(P < 0.001；表1)。

A组小鼠肺纤维化程度在初期随时间延长而逐渐加重，在造模后第4周达到峰值，之后肺纤维化程度随时间延长呈下降趋势。B组小鼠肺纤维化程度从开始逐渐加重，至造模后第6周达到高峰，两组小鼠肺纤维化评分差异有显著性意义(P < 0.001；表2)。

2.7 小鼠肺组织中Ⅰ型胶原蛋白、转化生长因子β1、α平滑肌动蛋白的表达免疫组化染色显示，异常的Ⅰ型胶原蛋白主要沉积在胸膜下、血管周围和肺泡间隔，与Masson染色所见的胶原纤维分布一致(图6)。转化生长因子β1和α平滑肌动蛋白的表达部位与Ⅰ型胶原蛋白类似，但在非纤维化部位的肺组织中亦可见少量细胞胞浆内表达转化生长因子β1(图7，8)。两组小鼠肺组织Ⅰ型胶原蛋白、转化生长因子β1、α平滑肌动蛋白的评分见表3。

2.8 小鼠肺组织羟脯氨酸含量高效液相色谱结果显示，A组小鼠肺组织羟脯氨酸含量于造模后第4周达到峰值，第6周有所下降，B组小鼠肺组织羟脯氨酸含量从开始逐渐增加，造模后第6周达到峰值，6周时2组小鼠肺组织羟脯氨酸含量差异有显著性意义(P < 0.05；表4)。

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引言

特发性肺间质纤维化是特发性间质性肺炎最常见的一种，呈慢性、进行性、不可逆性发展。特发性肺间质纤维化多于中老年起病(55-75岁，中位年龄66岁)，病变局限于肺，其组织病理学或影像学表现符合典型的寻常型间质性肺炎^[1-3]。高分辨率CT扫描可见其呈周围性分布，以双肺底更显著的粗大网织样改变伴蜂窝肺形成为特征^[1-3]。特发性肺间质纤维化发病原因不明，因此建立稳定可靠的动物模型对研究肺纤维化发病机制和筛选有效治疗药物至关重要。目前博来霉素气管内一次性滴入给药是最常用的造模方式，其给药次数少、剂量小、纤维化形成时间短，但是这种方法诱导的小鼠肺纤维化在后期有一定自限性^[4-6]。同样，博来霉素气管内多次滴入给药可诱导小鼠肺纤维化，但肺纤维化稳定性尚未完全明确。Chung等^[5]发现1周内气管内滴入博来霉素3次，造模结束后6周肺纤维化程度回到基线水平；Degryse等^[6]每2周一次气管内滴入博来霉素，连续8次，造模结束后10周肺纤维化可持续存在，但造模周期长。博来霉素尾静脉静脉给药诱导小鼠肺纤维化亦是常用造模方式，肖强等^[7]研究说明博来霉素尾静脉内一次性注射给药，6周后肺纤维化明显减轻。然而Peng等^[8]认为博来霉素单次注射较多次注射更有效复制一些与特发性肺间质纤维化有关的分子变化。考虑到特发性肺间质纤维化病因中可能包括反复肺损伤及其病理分布特点，实验拟通过小鼠尾静脉多次注射博来霉素建立一个反映人肺纤维化形成的动物模型。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 造模动物及材料实验于2013年8月至2014年4月在珠海市检验检疫局检验检疫技术中心完成。雄性SPF级C57BL/6小鼠56只，鼠龄8周，体质量18-22 g，由广东省医学实验动物中心提供，动物许可证号SCXK(粤) 20089-0002。实验动物装入可屏除抗原的过滤箱中运送，动物实验过程在珠海市出入境检验检疫局检验检疫技术中心，许可证号SYXK(粤)2013-0128，并按实验动物使用的3R原则给予人道主义关怀。小鼠饲养于屏障环境中，室温22-24 ℃，湿度55%，日照14 h和黑夜10 h交替进行(予SPF级饲料、及纯净水喂养，垫料经高温消毒灭菌)。

肺纤维化动物模型建立使用的主要试剂和仪器
试剂及仪器	来源
注射用盐酸博来霉素	日本株式会社
水合氯醛	大连美仑生物技术有限公司
Masson三原色试剂盒	台湾贝索公司
转化生长因子β1一抗	Sigma公司
Ⅰ型胶原蛋白一抗，α平滑肌动蛋白一抗，DAB显色试剂盒	武汉博士德生物公司
Micro CT	德国西门子公司

1.2 造模方法适应性喂养1周后，随机等分为A，B两组。A组为单次剂量注射模型，以博来霉素200 mg/kg(溶于 200 μL生理盐水中)经尾静脉注入；B组为多次小剂量注射模型，每周经尾静脉等体积注射博来霉素50 mg/kg(溶于200 μL生理盐水中)，连续注射6周^[9-10]。

1.3 造模成功的检测标准肺Micro-CT检测和羟脯氨酸含量升高确定为肺纤维化。

1.4 大体状况观察观察小鼠的活动度、毛发、外部形态、精神状况及体质量变化。

1.5 小鼠肺Micro-CT检查造模结束后第2，4，6周，每组各3只小鼠，腹腔注射4%水合氯醛(0.01 mL/g)麻醉，固定于Micro-CT搭载台上进行胸部CT扫描，扫面参数：管电压80 kVp，管电流500 μA，曝光时间700 ms，扫描时间10 min，角增量0.7°，扫描模式360°，平均帧数1，探测器组件模式4×4，重建图像的算法：FBP。

1.6 小鼠肺病理学观察 Micro-CT扫描后小鼠断头处死，取左肺放入体积分数10%甲醛中固定，按常规病理学方法脱水、包埋、切片、分别进行苏木精-伊红染色及Masson染色。苏木精-伊红染色后切片，每只小鼠随机取6张切片，每片连续观察30个视野观察。

参照Szapiel等^[11]的方法评价肺泡炎程度。0分：无肺泡炎，肺泡结构正常；1分：轻度肺泡炎，单核细胞浸润致肺泡间隔增厚，病变局限于胸膜下，受累面积< 20%；2分：中度肺泡炎，炎症浸润性病变主要位于胸膜下，受累面积为20%-50%；3分：重度肺泡炎，炎症病灶弥漫分布，受累面积> 50%。结果取平均值。

参照Hubner等^[12]的方法对肺纤维化进行评分。0分：无肺纤维化，肺泡结构正常；1分：散在的轻度肺纤维化，肺泡间隔增厚≤ 3倍正常值，部分肺泡腔扩大，肺泡壁变薄，无成团的纤维化灶；2分：明显的纤维化改变，肺泡间隔厚度> 3倍正常值，可见绳结样改变但彼此不相连，部分肺泡腔扩大，肺泡壁变薄，无成团的纤维化灶；3分：视野内主要改变为连续的纤维化(肺泡间隔厚度> 3倍正常值)，部分肺泡腔扩大，肺泡壁变薄，无成团的纤维化灶；4分：出现单个成团的纤维化灶(病变范围< 10%视野)；5分：融合的成团的纤维化(病变范围介于10%-50%视野)，肺形态严重受损；6分：大部分肺泡隔消失，大量连续肺纤维化(病变范围> 50%视野)，大部分肺形态毁损；7分：肺泡隔消失，肺泡内几乎全是成团的纤维组织，但仍有至多5个气泡样改变；8分：成团的纤维组织覆盖满视野。

1.7 免疫组化染色实验步骤按试剂盒说明书操作，参照Chen等^[13]的方法进行评价。每张切片随机选取10个200倍视野。PC：0：阳性细胞比< 5%；1：阳性细胞比5%-25 %；2：阳性细胞比26%-50%；3：阳性细胞比> 50%。I：0：染色强度无/弱；1：染色强度弱-中等；2：染色强度中等-强。免疫组化评分HSCORE=?(I×PC)。

1.8 高效液相色谱法测定羟脯氨酸含量参照郑家概^[14]和Hutson^[15]的方法，取右肺保存于-80 ℃冰箱，经高效液相色谱法测定羟脯氨酸含量。

1.9 主要观察指标小鼠肺部影像学变化、肺组织病理变化、肺组织中Ⅰ型胶原蛋白、转化生长因子β1和α平滑肌动蛋白的表达水平及肺组织羟脯氨酸含量。

1.10 统计学分析应用SPSS 16.0统计软件，计量资料采用x(_)±s表示，组间比较采用t 检验；计数资料用百分比表示，率的比较采用χ²检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

特发性肺间质纤维化仍然是一个病因不明、预后不佳的疾病。在探索和研究其发病机制中实验动物肺纤维化模型有突出的作用。理想的肺纤维化动物模型必须能复制典型寻常型间质性肺炎的组织学特征，纤维化持续进展或至少不可逆，廉价的、可重复、造模时间短^[16]。虽然有许多实验动物肺纤维化模型，涉及猫、狗、马等，但最常用的仍是鼠类动物^[17-21]。诱导肺纤维化主要有博来霉素、二氧化硅、异硫氰酸荧光素、放射线、应用转基因系统或病毒载体转导特殊基因表达^[16^，^21]，这些都有助于人特发性肺间质纤维化的研究。但到目前为止以上所有肺纤维化模型都有所缺陷和不足。二氧化硅雾化吸入诱导肺纤维化模型缺少寻常型间质性肺炎特征，造模时间长(形成肺纤维化结节长达16周)，雾化吸入二氧化硅至小鼠体内操作要求高，费用昂贵^[21-24]。异硫氰酸荧光素气管内给药诱导肺纤维化模型缺少寻常型间质性肺炎特征，重复性差^[16^，^21]。放射线照射诱导肺纤维化模型缺少寻常型间质性肺炎特征，造模时间长(长达6个月)^[16^，^21]。转基因系统或病毒载体转导特殊基因表达模型价格昂贵、造模技术要求高，成功率低^[16^，^21]。博来霉素造模低廉、可重复，目前最为常用^[17-21]。不同种属小鼠对博来霉素致肺纤维化的敏感性不同，以C57BL/6最敏感^[25]。给药途径包括腹腔内、静脉内、皮下、气管内给药，其中最常用有气管内、静脉内给药^[16^，²¹^，²³^，^25]。研究表明，单一剂量博来霉素气管内滴入建立的肺纤维化模型缺少典型寻常型间质性肺炎特征(空间异质性、成纤维细胞灶、肺泡上皮细胞过度增生)^[6^，^21]。Degryse等^[6]多次气管内滴入博来霉素所致肺损伤模型中能有效的引起肺纤维化、空间异质性、上皮细胞向间质细胞转化、肺泡上皮细胞增生、造模后肺纤维化稳定可靠，但造模耗时长达16周，而本研究多次给药造模耗时仅6周。同时有学者认为气管内滴入博来霉素其分布不均匀，其形成的肺纤维化主要分布在肺门和支气管周围，与特发性肺间质纤维化纤维化分布不同^[26]。尾静脉注射给药方式模拟人类应用博来霉素的给药方式，其病灶主要位于胸膜下和血管周围，与特发性肺间质纤维化的病理学改变相似^[7^，^26]，尾静脉注射给药方式已被广泛用于肺纤维化造模。本实验选择C57BL/6小鼠，在预实验中采用了单次注射50，80，250 mg/kg博来霉素以及每周注射50，100 mg/kg博来霉素诱导肺纤维化。其中，单次注射250 mg/kg博来霉素组和每周注射100 mg/kg博来霉素组小鼠分别在10 d内和19 d内全部死亡，而单次注射50，80 mg/kg博来霉素组在28 d内均未复制出明显肺纤维化，故这4种给药方式均不适宜用于复制肺间质纤维化模型。作者既往研究表明单次注射100，150 mg/kg复制部分肺纤维化改变，但无典型寻常型间质性肺炎特点^[7]。故单次注射200 mg/kg及多次小剂量注射50 mg/kg博来霉素均可作为博来霉素有效诱导肺间质纤维化模型的给药剂量。本实验2组小鼠肺Micro-CT扫描示可见不均匀的斑片状阴影及网格状阴影，以周围肺野(胸膜下)及肺底区病变为主。病理示所形成的纤维化改变主要分布于胸膜下及血管周围，与Harrison等^[27]的实验结果相似，类似人特发性肺间质纤维化的常见病理改变，推测是尾静脉注射博来霉素后，博来霉素随血流进入肺循环，而肺循环中近肺门处血流速度较快，肺外周流速明显减慢，故在肺周边更容易形成明显的纤维化^[28]。两组造模后病变均可见空间异质性、小灶分布的成纤维细胞灶，但均未见肺泡上皮细胞增生这一寻常型间质性肺炎特征性病变。一般认为纤维化疾病的发展包括炎症反应和纤维化形成两个阶段。肺纤维化的触发因素尚不清楚，多种因素损伤肺组织，导致肺泡基底膜破裂和转化生长因子β激活^[29]。转化生长因子β是公认的强效促纤维化因子，既可促进成纤维细胞增殖，激活肺成纤维细胞转化为肌成纤维化细胞^[30]，又可在转录或转录后水平调节胶原蛋白等细胞外基质的基因表达并且可以抑制细胞外基质的降解^[31]。在哺乳动物中转化生长因子β包括3个异构体，即转化生长因子β1/2/3，其中转化生长因子β1在调节肺纤维化发生中发挥关键作用，在博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型中其基因及蛋白表达均升高，在特发性肺间质纤维化患者肺中也上调表达^[29]。肌成纤维细胞是细胞外基质的主要来源细胞，也是组织损伤修复过程中炎症因子和促纤维化因子的主要来源细胞。α平滑肌动蛋白是肌成纤维细胞的常用标记物^[32]。本实验两组模型小鼠肺组织中均发现转化生长因子β1、α平滑肌动蛋白上调，而且这两种因子的演变过程大致与肺纤维化的相似，进一步证实在肺纤维化形成及演变过程中，转化生长因子β1、肌成纤维细胞发挥重要作用。本实验表明，两组造模后均可引起不同程度的肺泡炎和纤维化，A组肺泡炎评分、纤维化评分、Ⅰ型胶原蛋白评分、羟脯氨酸含量较B组早达峰值。4周时A组纤维化评分、Ⅰ型胶原蛋白评分大于B组，提示单次大剂量注射模型更易建立肺纤维化模型。造模后期(6周)A组肺泡炎评分、纤维化评分、Ⅰ型胶原蛋白评分、羟脯氨酸含量较造模初期下降，B组肺泡炎评分、纤维化评分、Ⅰ型胶原蛋白评分、羟脯氨酸含量较造模初期增加，均大于A组，提示多次小剂量注射模型更易建立稳定的肺纤维化模型，同肖强等^[7]研究结果类似。考虑注射博来霉素后，先引起肺泡炎进而引起肺组织细胞损伤，随后机体启动损伤修复过程继而引起肺纤维化，B组造模后6周内肺泡炎、纤维化评分、转化生长因子β1评分、α平滑肌动蛋白评分、Ⅰ型胶原蛋白评分、羟脯氨酸含量逐渐上升，有理由相信B组进一步延长观察时间肺纤维化仍将稳定存在。当比较临床疾病与实验动物模型时，需考虑疾病形成时间。人特发性肺间质纤维化发病缓慢，机制尚未完全明确，一种广泛接受的反复肺损伤假说认为肺泡上皮细胞反复受损后出现异常修复，修复过程不能完成正常的再上皮化过程，进而导致肺泡-毛细血管损伤。这一过程诱发细胞因子产生，成纤维细胞表面表达细胞因子受体，在细胞因子作用下聚集到损伤部位并增殖^[16^，^33]。事实上，肺病变空间异质性做为寻常型间质性肺炎特征说明特发性肺间质纤维化可能由慢性或反复损伤造成的^[6^，^34]，因此B组模型所致肺损伤更加符合人肺纤维化疾病发展过程。虽然本实验中A组模型肺组织病理亦见空间异质性，但其造模后期肺纤维化有自限性，同特发性肺间质纤维化自然病程明显不符。事实上，这已成为该模型的主要限制，尤其是作为特发性肺间质纤维化相关研究的动物模型。综上所述，通过本实验已经建立一种小鼠肺纤维化模型，作者认为这将进一步有助于未来研究人肺纤维化的发病机制及干预治疗。在这个模型中，多次小剂量博来霉素诱导肺纤维化模型具有部分典型寻常型间质性肺炎特征，尤其在模型稳定性上明显优于单次大剂量博来霉素诱导肺纤维化模型，更加符合特发性肺间质纤维化演变过程，对研究人肺纤维化，尤其对研究人特发性肺间质纤维化具有重要意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

静脉注射博来霉素诱导肺纤维化模型小鼠的稳定性评价

Intravenous injection of bleomycin induces pulmonary fibrosis in mice: a stability evaluation

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