高脂喂养2型糖尿病下肢缺血模型大鼠的构建

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.40.007

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (40): 6429-6435.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.40.007

• 器官移植动物模型 organ transplantation and animal model • 上一篇下一篇

高脂喂养2型糖尿病下肢缺血模型大鼠的构建

李晓玲¹，刘颐轩²，朱旅云¹，宋光耀³，王振全⁴，王超²

解放军白求恩国际和平医院，1内分泌科，4普通外科，河北省石家庄市 050082；河北省人民医院，2风湿免疫科，3内分泌科，河北省石家庄市 050000

出版日期:2015-09-30 发布日期:2015-09-30
通讯作者: 朱旅云，博士，主任医师，硕士生导师，解放军白求恩国际和平医院内分泌科，河北省石家庄市 050082
作者简介:李晓玲，女，1975年生，汉族，河北省邯郸市人，1999年河北医科大学毕业，博士，副主任医师。
基金资助:
河北省自然科学基金(H2013505067)

Construction of type 2 diabetes rat models of lower limb ischemia by feeding with high-fat diet

Li Xiao-ling¹, Liu Yi-xuan², Zhu Lv-yun¹, Song Guang-yao³, Wang Zhen-quan⁴, Wang Chao²

1Department of Endocrinology, 4Department of General Surgery, Bethune International Peace Hospital of Chinese People’s Liberation Army, Shijiazhuang 050082, Hebei Province, China; 2Department of Rheumatology,3Department of Endocrinology, Hebei General Hospital, Shijiazhuang 050000, Hebei Province, China

Online:2015-09-30 Published:2015-09-30
Contact: Zhu Lv-yun, M.D., Chief physician, Master’s supervisor, Department of Endocrinology, Bethune International Peace Hospital of Chinese People’s Liberation Army, Shijiazhuang 050082, Hebei Province, China
About author:Li Xiao-ling, M.D., Associate chief physician, Department of Endocrinology, Bethune International Peace Hospital of Chinese People’s Liberation Army, Shijiazhuang 050082, Hebei Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Hebei Province of China, No.H2013505067

摘要/Abstract

摘要：

背景：目前普遍采用结扎或切除大鼠后肢股动脉或髂动脉的方法来制备后肢缺血模型，但对于如何建立及评估糖尿病高脂高血糖慢性动脉硬化闭塞症的缺血状态，尚无一个稳定有效慢性缺血模型及方法。

目的：构建及评价高脂喂养2型糖尿病下肢缺血模型大鼠。

方法：将大鼠20只随机分为2组，糖尿病组10只予以高脂喂养6个月，腹腔注射链硫脲菌素50 mg/kg诱发糖尿病模型，对照组10只予以普食喂养6个月，两组大鼠均结扎股动脉建立右下肢缺血模型。

结果与结论：建模后第1天，两组大鼠多普勒血流及CT血管造影均呈显著降低提示缺血造模成功，两组建模后第7，14天行激光多普勒检测发现血流有逐渐恢复趋势，建模后第28天糖尿病组血流恢复较对照组显著迟缓(P < 0.05)。CT血管造影检测显示，建模后第28天，糖尿病组右下肢股动脉结扎处近端仅有少量血管代偿性增加，远心端仍无明显血流。病理组织及免疫组织化学染色染色显示，建模后第28天，糖尿病组缺血部位肌肉组织出现结构组织破坏，炎性细胞浸润，毛细血管密度患侧低于健侧；糖尿病组缺血肌肉组织血管内皮生长因子较对照组的蛋白表达明显增加(P < 0.05)。结果显示，长期高脂喂养糖尿病大鼠，通过股动脉结扎及CT血管造影技术可成功构建糖尿病下肢缺血模型。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

关键词: 实验动物, 心肺及血管损伤动物模型, 糖尿病, 糖尿病血管病变, 高脂饮食, SD大鼠, 下肢缺血, 激光多普勒灌注成像, CT血管成像, 血管新生, 股动脉结扎, 河北省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: The method of ligating or resecting rat lower limb femoral or iliac artery has been widely used to make rat models of lower limb ischemia, but there have been no stable and effective methods used to establish diabetic models of chronic atherosclerotic occlusive diseases and to evaluate the ischemic status of hindlimbs of models.

OBJECTIVE: To establish type 2 diabetes rat models of lower limb ischemia by feeding with high-fat diet and to evaluate them.

METHODS: Twenty rats were randomly and evenly divided into diabetes group (n=10) and control group (n=10). Rats in the diabetes group were fed with high-fat diet for 6 months, and were intraperitoneally injected with streptozotocin (50 mg/kg) to induce diabetes. Rats in the control group were fed with normal diet for 6 months. Rats in these two
groups were subjected to ligation of femoral artery to establish right lower limb ischemia models.

RESULTS AND CONCLUSION: At the first day of modeling, color Doppler flow imaging and CT angiography showed obviously decreased blood flow suggesting the success of establishing ischemia model. At 7 and14 days after modeling, the blood flow of rats in these two groups showed a gradual recovery as detected by color Doppler flow imaging. At 28 days after modeling, blood flow of rats in the diabetes group was significantly slower than that in the control group (P < 0.05). CT angiography showed that at 28 days after modeling, only a small amount of compensatory increase in blood flow of the blood vessels at the ligation position of proximal right lower limb femoral artery was seen in the diabetes group, while no obvious blow was observed in the distal part. Histopathologic and immunohistochemical staining showed that at 28 days after modeling, destroyed tissue structure and inflammatory cell infiltration were observed in the ischemic region and capillary density on the affected side was lower than that on the healthy side. The protein expression of vascular endothelial growth factor in the ischemic muscle tissue of rats in the diabetes group was significantly increased compared with that in the control group (P < 0.05). These results show that diabetic rat models of lower limb ischemia can be successfully established by long term high-fat diet feeding and femoral artery ligation and they can be validated by CT angiography.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

Key words: Tissue Engineering, Diabetes, Model, Animal, Femoral Arteries

中图分类号:

R318

李晓玲，刘颐轩，朱旅云，宋光耀，王振全，王超. 高脂喂养2型糖尿病下肢缺血模型大鼠的构建[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(40): 6429-6435.

Li Xiao-ling, Liu Yi-xuan, Zhu Lv-yun, Song Guang-yao, Wang Zhen-quan, Wang Chao. Construction of type 2 diabetes rat models of lower limb ischemia by feeding with high-fat diet [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(40): 6429-6435.

图/表（结果） 3

2.1 造模成功动物数量及过程糖尿病组8只及对照组10只建立后肢缺血模型成功，糖尿病组1只大鼠注射链硫脲菌素中死亡，1只大鼠手术麻醉意外死亡，成模率为80%，最终18只大鼠进入结果分析。建模流程图见图2。 2.2 模型方法的改进实验采用320排CT血管造影较常用的其他血管造影术操作相对简便易行，扫描时间短，空间分辨率高，立体成像技术客观准确，该技术应用于小动物血管成像国内尚无类似研究。 2.3 模型更接近临床实践研究表明糖尿病下肢动脉闭塞与长期高糖、高脂毒性作用导致动脉粥样硬化密切相关，实验在长期高脂喂养基础上，予以链硫脲菌素诱导高脂喂养糖尿病动物模型，成模鼠血糖长期维持较高水平，手术放大镜下解剖股动脉及其所有分支并在腹壁下动脉上方结扎并离断，以防侧支循环建立，更接近于糖尿病下肢慢性缺血的情况。 2.4 糖尿病下肢缺血模型大鼠的鉴定结果腹腔注射链硫脲菌素以后，SD大鼠在 48 h以后出现多饮、多食、多尿、皮毛松散、活动减少，1只鼠死亡，其他9只鼠中有8只大鼠血糖超过16.8 mmol/L；建模后7 d其血糖仍持续升高，造模成功；成模率为80%。成模鼠手术方法造成右下肢缺血模型后，均完成实验全程。在建模后两三天，SD糖尿病下肢缺血模型大鼠即出现食欲下降，缺血后肢逐渐出现萎缩，后肢活动力降低。建模后28 d，糖尿病组有3只大鼠关节以下区域肌肉轻度萎缩，皮温稍低，活动轻度受限。两组均未出现明显的跛行和肢体溃疡坏死。 2.5 大鼠下肢血流改变的监测结果见表1，图3，4。采用多普勒血流检测建模后1，3，7，14，28 d各组大鼠双下肢血流改变。结果显示，建模后1 d两组大鼠多普勒血流检测提示呈显著降低，提示缺血造模成功。建模后7，14 d，血流逐渐恢复趋势，建模后28 d，对照组缺血患侧提示恢复到为健侧后肢的91%，糖尿病组血流恢复相对迟缓，在建模后第28天恢复为健侧后肢的72%，较对照组血流回复显著迟缓(P < 0.05)。

2.6 大鼠下肢动脉造影检测结果动脉造影检测结果显示，糖尿病组在建模后28 d行CT血管造影提示血流有部分恢复，较对照组相对迟缓。糖尿病组右下肢股动脉结扎处远心端无明显血流，其近端有部分血管代偿性增加，供应膝关节及以下区域。见图5。 2.7 大鼠病理组织及免疫组织化学染色结果见图6。糖尿病组建模后第28天，缺血部位肌肉组织出现结构组织破坏，慢性萎缩性改变，肌间隙明显增加，部分可见炎性细胞浸润；对照组建模后第28天，缺血肌肉组织无明显肌肉萎缩坏死，其间有少量炎性细胞浸润。肌肉组织中CD31免疫组织化学染色结果显示：阳性染色定位于小动脉平滑肌细胞的胞浆内，小动脉染色为深棕色，呈管状结构，分布于肌间隙，糖尿病组毛细血管密度患侧低于健侧；对照组建模后患侧组织中毛细血管密度与健侧比较差异不大。2.8 大鼠肌肉组织中血管内皮生长因子蛋白表达建模后第28天，取大鼠缺血肢体股四头肌和腓肠肌组织，Western blot检测结果显示：糖尿病组缺血下肢(患侧)肌肉组织血管内皮生长因子较对照组表达明显增加。见图7。

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引言

下肢血管闭塞是糖尿病足的重要原因^[1-2]，临床关于糖尿病患者下肢血管缺血的治疗缺乏有效措施^[3-4]，因此对于糖尿病足的早期诊断及对疗效的正确评价能对糖尿病足患者的预后产生非常积极的作用^[5]，近年来通过建立动物后肢缺血模型进行血管新生基因疗法和干细胞移植等研究已成为现代生物医学领域中的研究热点^[6-10]。

如何根据实验目的正确选择肢体缺血模型的制作方法以及如何对该模型的缺血效果进行评价，从而制作出效果确实可靠稳定性良好的肢体缺血模型显得尤为重要。目前国内外肢体急慢性缺血模型主要有血管结扎切断法和血管栓塞法等^[11-12]，血管结扎切断法在暂时阻断动脉法基础上将分离出的某支供血动静脉主干或其分支进行结扎或切断以造成急性血管永久阻断从而引起缺血，因其所引起的血流变化与临床外周动脉疾病相似，缺血现象严重缺血时间长达4周，而被广泛应用为国内外肢体缺血模型中最常用的制作方法^[9-10]。国内外学者造模后多数采用激光多普勒血流成像等方法检验血流变化^[13-15]，近年越来越多的先进技术被应用于侧支循环功能的评价，但各具优缺点，其中放射性同位素灌注扫描简便易行能准确地定量定位但显影所需时间较长；核磁共振成像不需注射对比剂是一种非介入探测技术但扫描时间长，空间分辨率不及CT且价格较昂贵^[16]；动脉注射数字减影法为常用血管造影术，但其空间分辨率不高细小血管显示欠清晰^[17]。而本次实验采用CT血管造影，能够更逼真地显示血管立体形态及其与周围结构关系，相对经济易于操作，除此以外还可结合病理形态学观察缺血组织结构进行多方面评价模型缺血效果^[18]。实验采用股动脉结扎离断制造高脂喂养糖尿病大鼠模型，并采用CT血管造影法观察糖尿病大鼠血管缺血动态变化，以期对糖尿病下肢缺血动物模型的创建提供更多帮助。中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

材料方法

1.1 造模动物及材料健康4-6周龄雄性SD大鼠20只，体质量200-250 g，由河北医科大学动物中心提供，动物许可证号：SCKX(冀)2008-1-003。将20只SD大鼠采用随机数字表的方法随机分为糖尿病组和对照组每组10只。两组大鼠分组别于在河北省人民医院SPF级动物房内标准笼中喂养，试验期间大鼠均自由进食和饮水，对照组进食普通饲料。

糖尿病下肢缺血动物模型的构建相关试剂及仪器：
仪器及试剂	来源
优越(IV)型血糖仪	德国罗氏公司
25倍手术放大镜	德国蔡斯公司
红外线皮温仪PIC2-POLO	瑞士红外线皮温仪
Lecia显微图像分析系统	德国徕卡仪器有限公司
320排动态容积CT血管造影	Aquilion ONE日本东芝公司
激光多普勒血流成像仪系统	PeriScanPIM3瑞典Perimed
佐链脲菌素	美国Sigma公司
CD31单克隆抗体、VWF多克隆抗体	北京中衫公司
血管内皮生长因子抗体	武汉博士德生物公司

1.2 造模方法实验于2013年2至12月在河北省人民医院国家重点中心实验室完成。

糖尿病组：取10只SPF级雄性SD大鼠，以高脂饲料饲养6个月，高脂饮食饲料的热量比例为蛋白质占20%，脂肪占60%，碳水化合物占20%。动物房内自然昼夜照明，室内通风良好，室温18-25 ℃，相对湿度55%-80%。饲养6个月后标记并称质量，禁食12 h，不禁水，4 ℃柠檬酸钠缓冲液(0.1 mol/L，pH 4.5)稀释链硫脲菌素，35 mg/kg剂量一次性腹腔注射；注射时需提起大鼠腹壁进针，避免刺伤大鼠的肝脏，48 h后用罗氏血糖仪测尾静脉随机血糖，以>16.7 mmol/L为造模成功，成模后7 d复测随机血糖>16.7 mmol/L，共9只大鼠造模成功，期间所有大鼠均自由饮水与摄食，监测血糖及体质量，未给予胰岛素治疗。

对照组：普通饲料喂养，给予等量柠檬酸钠缓冲液一次性动物腔注射。

建立下肢缺血模型：所有大鼠都取右下肢造模，左下肢作为自身对照。实验动物称质量经体积分数2%戊巴比妥钠50 mg/kg腹腔注射麻醉，仰卧手术台，四肢牵拉固定，右下肢常规备皮消毒。于右侧腹股沟部切开右下肢正中的皮肤行1.5 cm纵行切口，以自制小拉钩牵开用棉签分离大腿肌肉周围脂肪组织，分离内膜层和肌层，显露包含股动脉股静脉和股神经的血管神经束，在10倍光学显微镜下仔细游离出髂股动脉，腹股沟下分离出股动脉，范围从腹股沟韧带直至膝关节。在腹股沟韧带下切断股动脉，双重结扎近端，随后向远端锐性剥离至膝关节，沿肌间隙钝性分离探查，并探查腘动脉及其属支结扎股动脉于股部的所有分支，并结扎腘动脉及腓动脉，用生理盐水将切口冲洗干净，逐层缝合腹部和切口。

继续喂养大鼠28 d，期间观察大鼠下肢形态、行走情况、皮肤色泽等，用红外线皮温仪PIC2-POLO多功能红外线体温仪，测定大鼠双后肢皮温变化^[11]。

1.3 造模成功的检测标准 PeriScan PIM3激光多普勒血流仪记录双侧血流灌注值，为消除环境中光线和温度的影响，以术肢/健肢血流比率表示术肢的血流灌注程度进行数据分析。一般以股动脉结扎后的一侧肢体血流减少约70%确认建模成功。

1.4 下肢血流改变的检测分别在股动脉结扎建模后1，3，7，14，28 d^[11]，常规麻醉后，保持温度、光线相对恒定下，采用激光多普勒血流成像(laser doppler perfusion imaging，LDPI)监测双下肢血流改变。具体操作方法：予以体积分数2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，分别于大鼠的足底放置激光多普勒探头，用激光多普勒血流成像扫描其双下肢 3 cm×5 cm的面积。利用激光探测皮肤下1 mm以内血管中血细胞运动所产生的多普勒效应，转化为电流值，获得的二维彩色灌注图像，对应于不同的颜色：红色表示最大血流灌流量，而深蓝色则相反，黄色介于两者之间，即颜色越暗提代表灌流量越小。分别于大鼠的足底放置激光多普勒探头，PeriScan PIM3 激光多普勒血流仪记录双侧血流灌注值(perfusion unite，PU)，以术肢/健肢血流比率表示术肢的血流灌注程度进行数据分析，见图1。

下肢动脉CT血管造影检测：于建模后1，3，7，14，28 d常规体积分数2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，切开后腹膜，于腹主动脉留置套管针，注射低分子肝素钠抗凝，以2 mL/s的速率注射370 g/L碘帕醇对比剂共1.5 mL进行320排CT下肢血管造影，用MPR多平面重组和曲面重组技术、VR容积再现技术，MIP最大密度投影技术方法处理造影结果并摄片为依据，观察侧支血管建立的程度。

1.5 组织病理学检查分别于建模后28 d实验结束以后，将动物麻醉处死，取双侧后肢内收肌和腓肠肌标本3-5块，甲醛固定，常规石蜡包埋，切成5 μm厚的组织切片，行苏木精-伊红染色；另取组织进行CD31、vWF免疫组织化学染色测定毛细血管密度：CD31是新生血管内皮细胞的表面标志，每连续3张切片分别取一张进行免疫组织化学染色染色，抗CD31，VWF组织化学染色血管内皮阳性细胞胞浆为棕黄色。用PV法染色，石蜡切片5 μm，常规脱蜡，体积分数3%过氧化氢甲醇液室温浸泡15 min，消除内源性过氧化物酶的活性，用体积分数4%胃蛋白酶消化，室温15 min，抗原修复用高压锅法，冒气2 min，用体积分数1%BSA(小牛血清白蛋白)封闭，室温10-15 min用于封闭组织内电荷，倾去血清(勿洗)，滴加按比例稀释的一抗，置于湿盒中， 4 ℃冰箱过夜，0.01 mol/L PBS震荡洗涤5 min，3次，滴加二抗葡聚糖-酶复合物，37 ℃孵育60 min，0.01 mol/L PBS震荡洗涤5 min，3次；显色：PBS 4 mL，DAB 5 g，H₂O 25 μL，显色5 min(以镜下适度为好)，蒸馏水洗5次，苏木精复染1 min，脱水，二甲苯透明，中性树胶封固；染色后组织切片在100倍显微镜下，随机选取5个视野，辅以Lecia显微图像分析系统观察单位视野内棕色颗粒数即阳性细胞数，以单位视野内阳性细胞数/肌纤维数表示小动脉密度，以此变化为评价指标，观察缺血下肢毛细血管结构的恢复。

1.6 大鼠肌肉组织中血管内皮生长因子蛋白表达的Western blot检测取大鼠双后肢的股四头肌和腓肠肌标本3-5块，分别取对照组健侧和糖尿病组与对照组患侧股四头肌和腓肠肌，按100 g/L加入细胞蛋白裂解液，95 ℃变性5 min，10 000 r/min离心5 min，收集蛋白上清，以15%聚丙烯酰胺凝胶在200 V电泳2 h；用体积分数0.2%的戊二醛固定液固定40 min；用去离子水洗脱3次，加体积分数5%的脱脂奶粉TBST 10 mL封闭2 h；分别以1∶1 000稀释血管内皮生长因子抗体封闭2 h；室温过夜；用TBS洗3次每次5 min；1∶500辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗室温孵育2 h；用Western漂洗液洗3次每次15 min；加1 mL显色液DAB；用吸头吸显色液浸入膜，充分反应；观察照相。以β-actin为内参，结果利用Image J软件测量灰度值，计算出目的蛋白与内参的灰度值的比值。

1.7 主要观察指标两组大鼠激光多普勒行下肢血流监测、CT下肢血管造影结果，两组健侧和患侧股四头肌和腓肠肌行苏木精-伊红染色及CD31免疫组织化学染色、Western- Blot测定血管内皮生长因子含量。

1.8 统计学分析计量资料用x(_)±s表示，应用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，组间数据差异的比较用方差分析，以P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

下肢血管闭塞是糖尿病足的重要原因，临床关于糖尿病患者下肢缺血的治疗缺乏有效措施。治疗性血管生成和干细胞移植是临床下肢缺血研究的新领域^[19-21]，研究尚处于动物实验阶段，目前，普遍采用结扎或切除大鼠后肢股动脉或髂动脉的方法来制备后肢缺血模型^[22-23]，并以急性缺血后期的代偿阶段作为慢性缺血过程，该缺血模型是后肢急性缺血过程，与临床上大量糖尿病慢性下肢缺血过程完全不同，很难真正反映出实际临床面临的比如糖尿病高脂高血糖慢性动脉硬化闭塞症的缺血状态。近年来，国内外学者曾尝试通过其他不同方法如微粒栓塞法或物理缩窄股动脉的方法等来制备动物后肢缺血模型^[24-26]，但是目前尚无一个公认的后肢慢性缺血模型，这也影响了对慢性下肢缺血血管新生机制的研究和治疗。而如何制作出可靠稳定性良好的糖尿病大鼠后肢慢性缺血模型，及如何对该模型的缺血效果进行有效评价显得尤为重要。研究表明糖尿病下肢动脉闭塞与长期高糖、高脂毒性作用导致动脉粥样硬化密切相关^[27]，有研究提示链硫脲菌素诱发大鼠糖尿病模型后3周即可造成下肢截肢^[28]，实验在长期高脂喂养基础上，予以链硫脲菌素诱导高脂喂养糖尿病动物模型，成模鼠血糖长期维持较高水平，手术放大镜下解剖股动、静脉及其分支并在腹壁下动静脉上方结扎并离断，同时务必结扎腹壁下动、静脉，破坏旋股内、外侧动、静脉以防侧支循环建立。比较糖尿病组与对照组缺血肢体的病理损伤特点及缺血代偿情况结果：表明两组缺血区域的炎症细胞浸润、骨骼肌坏死萎缩及促新生血管形成等方面存在不同程度差异。建模后28 d，糖尿病组大鼠下肢未出现萎缩坏死，后肢缺血状态慢、维持时间较长，部分大鼠关节以上区域肌肉轻度萎缩，皮温稍低，活动轻度受限。而对照组在建模后28 d其缺血状态基本恢复，肌肉免疫组织化学染色染色提示糖尿病组缺血部位肌肉组织出现结构组织破坏，慢性萎缩性改变，肌间隙明显增加，部分可见炎性细胞浸润；毛细血管密度患侧低于健侧；对照组无明显肌肉萎缩坏死，患侧组织中毛细血管密度与健侧比较差异不大。血管造影也是常用的评价下肢血管闭塞程度及侧支循环形成情况的标准，测量从股动脉结扎处至膝关节处侧支血管的长度和面积，可客观评价侧枝血管形成的程度，从而反映出微循环功能改善的效果。本次实验CT动脉血管成像显示，糖尿病组右下肢股动脉结扎处远心端无明显血流，其近端有部分血管代偿性增加，供应膝关节及以下区域。这提示，下肢血流恢复可能来自于股动脉新生血管，也可能来自于髂内动脉向下肢分支的代偿性增粗及其远端血管代偿性增加，相对而言，本次实验采用CT血管造影较常用的其他血管造影术更逼真地显示血管立体形态及其与周围结构关系^[29]。结合本次实验实验认为采用股动脉结扎离断研究糖尿病下肢缺血，以新生血管的发生、起源等为主要观察目标时，观察区间应以三四周为限，使用CT动脉造影法检测是准确可靠的。为进一步研究高脂喂养糖尿病大鼠对慢性缺血代偿差异的机制，实验利用Western Blot法对缺血肢体股内收肌的血管内皮生长因子蛋白进行了定量研究，结果表明糖尿病组血管内皮生长因子的表达明显增加，这可能与与糖脂代谢紊乱，氧化应激状态及内皮功能受损，血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子等细胞因子表达异常等有关^[30-31]。缺血组织也可通过基因调控和炎症介质使与血管新生相关的各种细胞生长因子，包括血管内皮生长因子在局部的过度表达，诱导内皮祖细胞的分化增殖迁移和定向定居，分化为内皮细胞，血管内皮生长因子还可发挥抗内皮细胞凋亡作用，提高内皮细胞活性，诱导局部组织中的内皮细胞增殖参与形成新血管促血管形成作用，有利于缺血后机体启动血管新生机制^[32]；从而推断糖尿病下肢缺血的改善可能血管内皮生长因子在缺血下肢肌肉中的表达有关。本次实验在长期高脂喂养SD大鼠基础上，予以少量链硫脲菌素诱导糖尿病模型，结扎血管造成下肢缺血，该手术操作简单，组织的病理学改变及形成缺血的过程更接近临床慢性下肢缺血过程，且较少表现出肌肉的急性坏死。同时结合小动物CT血管造影技术，从而为研究各种治疗手段提供了一个良好的缺血模型基础，在一定程度上模拟了临床慢性下肢缺血，但下肢慢性缺血往往发生在双侧是一个缓慢的逐渐加重的过程。目前动物模型模拟其慢性过程较临床长达数年的下肢血管病变仍相差甚远，因此如何建立可行性高重复性好的糖尿病慢性肢体缺血模型仍有待进一步探索研究开展更完善的动物模型以及对糖尿病慢性缺血病变更有针对性的相关机制探讨。中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

高脂喂养2型糖尿病下肢缺血模型大鼠的构建

Construction of type 2 diabetes rat models of lower limb ischemia by feeding with high-fat diet

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