Survivin基因沉默鼻咽癌G666-1细胞的生物学特性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.28.015

摘要/Abstract

摘要：

背景：Survivin基因是迄今发现的最强效的凋亡抑制因子，能够抑制肿瘤细胞的增殖、迁移能力，成为近年有关肿瘤研究的热点之一。

目的：探讨Survivin基因沉默对鼻咽癌G666-1细胞生物学特性的影响。

方法：设计及合成Survivin的siRNA序列，Lipofectamine^TM 2000转染G666-1细胞，利用RT-PCR、Western blot检测Survivin基因沉默后的G666-1细胞Survivin mRNA及蛋白的表达，流式细胞仪检测G666-1细胞中肿瘤干细胞标志物CD44⁺CD133⁺的表达变化。另外还采用CCK-8增殖实验、划痕愈合实验、细胞侵袭实验评价Survivin基因沉默对鼻咽癌G666-1细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响。

结果与结论：与对照组、空白组比较，实验组Survivin 基因沉默后的鼻咽癌G666-1细胞Survivin mRNA及蛋白表达显著降低，差异有显著性意义(P < 0.05)；与对照组、空白组比较，实验组Survivin 基因沉默后的鼻咽癌G666-1细胞的生长速度明显减慢，增殖能力受到抑制，迁移能力和侵袭能力显著下降，差异有显著性意义(P < 0.05)；肿瘤干细胞标志物CD44⁺CD133⁺的表达比例显著降低(P < 0.05)。结果表明特异性干扰Survivin基因表达可抑制鼻咽癌G666-1细胞的增殖、迁移和侵袭能力，使具有CD44⁺CD133⁺肿瘤干细胞特性的细胞比例降低，因此，Survivin基因沉默可能成为有效治疗鼻咽癌的新靶点。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 鼻咽癌, Survivin, 基因, siRNA, G666-1, 细胞增殖

Abstract:

BACKGROUND: Survivin gene is the most potent anti-apoptosis factor, which can inhibit tumor cell proliferation and migration. It has become a hot topic related to cancer research in recent years.

OBJECTIVE: To explore the effect of Survivin gene silencing on the biological characteristics of G666-1 nasopharyngeal carcinoma cells.

METHODS: siRNA sequence of Survivin was designed and synthesized and then transfected into G666-1 cells using LipofectamineTM 2000. After Survivin gene silencing, Survivin mRNA and protein expressions were detected by RT-PCR and western blot assay, respectively. Expression of CD44⁺CD133⁺ cells was detected by flow cytometry. In addition, the effects of Survivin gene silencing on the proliferation, migration and invasion of G666-1 cells were evaluated through cell counting kit-8 test, scratch healing assay and cell invasion assay.

RESULTS AND CONCLUSION: After Survivin gene silencing, the expressions of Survivin mRNA and protein were significantly reduced (P < 0.05); the growth of G666-1 cells was slowed dramatically, indicating the proliferation ability was inhibited, and the migration and invasion abilities were both decreased significantly (P < 0.05); the expression ratio of CD44⁺CD133⁺ cells was significantly lowered (P < 0.05). These findings indicate that the proliferation, migration and invasion of G666-1 nasopharyngeal cancer stem cells can be suppressed after Survivin gene silencing, and the proportion of CD44⁺CD133⁺ cells is reduced, thus indicating Survivin gene silencing may be a new effective target for treatment of nasopharyngeal carcinoma.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Nasopharyngeal Neoplasms, Neoplastic Stem Cells, Gene Silencing, Cell Proliferation

中图分类号:

R394.2

王慧. Survivin基因沉默鼻咽癌G666-1细胞的生物学特性[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(28): 4508-4513.

Wang Hui. Biological characteristics of G666-1 nasopharyngeal cancer stem cells in Survivin gene silencing[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(28): 4508-4513.

图/表（结果） 6

2.1 Survivin基因在鼻咽癌G666-1细胞中mRNA水平的表达通过RT-PCR检测siRNA抑制Survivin mRNA的表达，结果显示，与对照组(G666-1/control组)、空白组(G666-1组)相比较，实验组(G666-1/Survivin-siRNA组)Survivin基因沉默后鼻咽癌G666-1细胞Survivin mRNA的表达显著降低，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图1。

2.2 Survivin基因在鼻咽癌G666-1细胞中蛋白水平的表达通过Westem blot检测siRNA抑制Survivin蛋白的表达，结果显示，与对照组(G666-1/control组)、空白组(G666-1组)相比较，实验组(G666-1/Survivin-siRNA组)Survivin基因沉默后鼻咽癌G666-1细胞Survivin蛋白的表达明显降低，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图2。

2.3 鼻咽癌G666-1细胞的细胞周期变化流式细胞仪检测鼻咽癌G666-1细胞的细胞周期变化，其结果显示，实验组(G666-1/Survivin-siRNA组)Survivin基因沉默后鼻咽癌G666-1细胞的生长速度明显减慢，细胞停滞在G₀/G₁期，在S期细胞数减少，M期细胞无明显变化，与对照组(G666-1/control组)、空白组(G666-1组)比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见表1。

2.4 siRNA对鼻咽癌G666-1细胞增殖的影响通过CCK-8增殖实验检测siRNA对细胞增殖的影响，其结果显示，与对照组(G666-1/control组)、空白组(G666-1组)相比较，实验组(G666-1/Survivin-siRNA组)G666-1细胞的增殖受到明显的抑制，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图3，表2。

2.5 鼻咽癌G666-1细胞的迁移能力划痕愈合实验结果显示，与对照组(G666-1/control组)、空白组(G666-1组)相比较，实验组(G666-1/Survivin-siRNA组)经Survivin基因沉默后的鼻咽癌G666-1细胞划痕愈合缓慢，说明细胞迁移能力显著下降，见图4。

2.6 鼻咽癌G666-1细胞体外侵袭力的变化通过Transwell小室法检测G666-1细胞体外侵袭力的变化，结果显示，实验组(G666-1/Survivin-siRNA组)Survivin基因沉默后鼻咽癌G666-1细胞的穿膜细胞数量有显著降低(28.36±2.56)，表明其侵袭能力显著下降，与对照组(G666-1/control组)、空白组(G666-1组)的穿膜细胞数量(48.34±3.42，47.39±4.14)相比较，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图5。

2.7 流式细胞术法检测肿瘤干细胞标志物CD44⁺CD133⁺的表达与对照组(G666-1/control组)、空白组(G666-1组)相比较，实验组(G666-1/Survivin-siRNA组)G666-1细胞的CD44⁺CD133⁺的表达比例显著降低，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表3。

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引言

材料方法

设计：细胞学体外对比观察实验。

时间及地点：实验于2014年2月至2015年1月在天津医科大学中心实验室完成。

材料：

细胞：鼻咽癌G666-1细胞采购自大连宝生物科技公司。

Survivin基因沉默鼻咽癌G666-1系细胞的生物学特性检测所用主要试剂：
试剂	来源
DMEM培养基、Opti-MEM、G418	华美生物工程公司
胰蛋白酶、胎牛血清	Gibco BRL公司
L质粒提取试剂盒、RNA 提取试剂Trizol、DNA凝胶纯化回收试剂盒	Hyclone公司
脂质体转染试剂Lipofectamine2000^TM	Santa cruz公司，美国
DNA marker、T₄ DNA连接酶	大连宝生物工程公司
RT-PCR两步法试剂盒、AMV反转录试剂盒	上海炎彬化工公司
PCR 引物序列	北京天根生化有限公司
CCK-8	美国Abcam公司
cDNA合成试剂盒	杭州博日科技有限公司
HRP 标记的兔抗羊IgG，ECL化学发光试剂盒	美国BD公司
PVDF膜	华美生物工程公司
Matrigel	美国Hyclone公司

实验方法：

siRNA的设计、合成及转染：根据参考文献设计针对Survivin基因的siRNA片段^[9]，Survivin的siRNA序列，其正义链为：5’-GAA GCA GUU UGA AGA AUU ATT-3’；反义链为：5’-UAA UUC UUC AAA CUG CUU CTr-3’。阴性对照的siRNA正义链为：5’-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTr-3’；反义链为：5’-ACG UGA CAC GUU CGG AGA Arr-3’。设计的Survivin基因的siRNA序列和1条荧光标记的阴性对照siRNA序列(用NC表示)均由杭州四季青生物工程公司合成。

将鼻咽癌G666-1细胞转移至含体积分数为10%小牛血清的DMEM培养基的低黏附75 cm²培养瓶里，将其放置到体积分数为5%CO₂、37 ℃的密闭式细胞培养箱中培养，24 h换液，细胞经消化传代，选取对数生长期的细胞进行实验实施。以每孔2×10⁵鼻咽癌G666-1细胞悬液放入铺被好的6孔培养板中，观察其融合到80%时，以脂质体法实施转染。

分组：转染时分为3组：转染Lipofectamine^TM 2000- Survivin-siRNA载体的细胞作为实验组(G666-1/Survivin-siRNA组)，转染NC siRNA载体的细胞作为对照组(即G666-1/control组)，没有进行转染的鼻咽癌G666-1细胞作为空白组(即G666-1组)。在转染后48 h实施RNA干扰效应的检测。

PCR检测Survivin基因在鼻咽癌G666-1细胞中mRNA水平的表达：选择于对数生长期的细胞，采用胰酶消化后接种入新细胞培养皿中，用Trizol试剂盒提取总RNA，经cDNA合成试剂盒反转录合成cDNA，同时用肌动蛋白(β-actin)作为内参照，分别扩增Survivin和内参β-actin。Survivin引物序列：上游：5’-GGA CCA CCG CAT CTC TAC AT-3’，下游：5’-GCA CTT TCT TCG CAG TTT CC-3’，扩增产物大小为338 bp。β-actin上游引物为5’-TAT CGG ACG CCT GGT TAC-3’，下游引物为5’-CTC AGC CTT GAC TGT GCC-3’，扩增产物大小为151 bp。PCR反应条件：95 ℃变性5 min，90 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s， 72 ℃进行延伸30 s，共计36周期的循环，最后72 ℃ 5 min，于4 ℃下保温。每一PCR反应实验重复进行3次。用Survivin/β-actin代表Survivin mRNA的相对表达量。

Westem blot检测Survivin基因在鼻咽癌G666-1细胞中蛋白水平的表达：用冰预冷的PBS冲洗掉残余在细胞培养皿中的培养液，冲洗重复进行3次后加入1 mL的PBS，应用细胞刮将细胞刮下，将细胞收集置EP管，1 500 r/min，离心5 min；吸弃上清液，加入1 mL细胞裂解液进行细胞的裂解，摇匀后放置冰上保持45 min及以上，然后置于低温超高速离心机上以9 000 r/min，4 ℃下离心5 min，提取总蛋白，分装并通过BCA法测定蛋白质浓度。吸取总蛋白50 μg，置入等体积的2×上样缓冲液中，98 ℃变性10 min。上离心机离心后抽取上样30 μL，分离，经半干法电转移至PVDF膜上，用5%的脱脂奶粉在37 ℃下行2 h的封闭，然后加入HRP标记的兔抗羊IgG(以1∶1 000比例稀释)，4 ℃下孵育过夜，应用TBST洗膜5 min×4次，37 ℃孵育2 h，PBS洗膜2次，ECL法检测信号。应用UVI凝胶成像系统进行摄像以Image-Pro Plus 8.0软件分析条带的灰度值。以目的条带与β-actin条带吸光面积积分比值表示蛋白的相对表达水平。

流式细胞术法检测肿瘤干细胞标志物CD44⁺和CD133⁺的表达：镜下观察G666-1细胞的生长状态，待细胞融合率为70%时，消化细胞，离心，弃掉上清液，PBS洗膜2次后，加入1∶50的HRP标记的兔抗羊IgG，在4 ℃下孵育60 min后，再经PBS洗膜2遍，离心，分装入5 mL的流式检测管，每管300 μL；CD44、CD133抗体溶液(1 g/L)按1∶20的比例稀释后加入样本中，轻轻摇匀后冰上孵育20 min；经PBS重新悬浮细胞后，保持避光，常温下放置30 min，用流式细胞仪器自带的Modifit软件系统进行分析，计算出CD44和CD133的阳性率。

流式细胞仪检测细胞周期：将3组细胞收集起来并调整细胞浓度为1×10⁶ L^-¹，冷PBS洗涤2遍，用体积分数为70%的冷乙醇(4 ℃)进行细胞沉淀后摇匀备用，冲洗细胞，采用PBS调至细胞浓度为1×10⁶ L^-¹，将Tris-HCl缓冲液(含50 mg/L RNA 酶；pH=7.4)与调好浓度的细胞在室温下共同培育35 min，避光。采用100 mg/L碘化丙啶进行细胞的DNA染色，放置暗室中1 h后，应用流式细胞仪检测细胞的DNA含量分布，并计算各个细胞周期所占的百分率。

CCK-8法检测鼻咽癌G666-1细胞的增殖能力：选择处于指数生长期的3组细胞，经胰酶消化后，采用有血清培养皿配制成单细胞悬液。接种细胞于96孔板中，每孔1×10³个细胞，每组设6个复孔，培养24 h后，加入20 μL融化的CCK-8试剂，温育4 h后，以不加细胞空白孔为对照，在酶联免疫检测仪上测定培养48，72，96，120 h时各孔吸光度值，以细胞吸光度值的平均值作为纵坐标，培养时间作为横坐标来绘制生长曲线。

细胞划痕损伤实验观察G666-1细胞的迁移能力：选择处于对数生长期的上述3组细胞，分别以5×10³/孔的密度接种于6孔板中，观察到各组细胞生长形成单层后，取用无菌牙签或10 μL移液枪头做“一”字型的划痕于单层细胞上。经PBS柔缓洗膜，加入2 mL不含血清的DMEM培养液继续培养，培育48 h后，在倒置显微镜(100倍)下观察并分析细胞迁移能力的变化。

Transwell小室侵袭实验分析G666-1细胞的转移能力：在Transwell小室上室聚碳酸酯微孔滤膜上铺一层基质胶，用以模仿体内细胞外基质，在Transwell小室下室中加入体积分数为10%胎牛血清，以便做条件培养液。经处理过的G666-1细胞悬液100 μL(3×10⁵ L^-¹)加入上室中，4 ℃下培养24 h，用PBS冲洗小室，待自然风干后，将上室的聚碳酸酯滤膜沿边缘用眼科小剪刀将其小心取下，再用树脂胶固定在载玻片上，固定时膜内面朝上，进行封固后干燥，×200光镜下每膜分别于上、下、左、右、中计数5个视野的侵袭细胞数目，并计算出其平均值。实验要重复进行3次，每组设3个平行小室。

主要观察指标：①G666-1细胞Survivin mRNA的表达。②G666-1细胞Survivin蛋白的表达。③G666-1细胞的细胞周期变化。④G666-1细胞的增殖、迁移能力。

统计学分析：采用SPSS 17.0统计软件分析，计量资料以x(_)±s表示。多组间比较采用单因素方差分析法，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

近些年来，人们对肿瘤的发生和发展有一个重新认识，对肿瘤干细胞的研究为肿瘤治疗提供了新的临床指导方向^[16-18]。肿瘤干细胞是存在于肿瘤组织中具有干细胞样能力的肿瘤细胞亚群，它是形成不同分化程度肿瘤细胞和肿瘤增长、复发及转移的根源，有研究发现，肿瘤干细胞是一种增殖特性失控、能够形成肿瘤、具有干细胞特性的肿瘤细胞，因此被称为肿瘤干细胞^[19-21]。目前已从乳腺癌、白血病、中枢神经系统肿瘤等数种器官中成功的分离出肿瘤干细胞^[22-24]。肿瘤干细胞可以通过不对称分裂形成两类异质细胞，一类是与其性质相同的肿瘤干细胞，另一类是数目较多的非致瘤肿瘤细胞^[25]。肿瘤干细胞的数量虽不多，但其具有较强的DNA损伤修复能力和多药耐药相关蛋白高表达等特性，是致使放、化疗失败的关键因素，但它却在肿瘤的发生、发展、以及复发、转移和耐药中起着重要作用，所以被认作为肿瘤起源细胞^[26]。另有研究发现，在肿瘤组织中仅有少量细胞在不断的增殖，其余大部分肿瘤细胞不增殖或处于有限增殖的态势，而肿瘤干细胞才是肿瘤发生及发展的重要因素。

近些年来新近发现的Survivin凋亡抑制因子，是IAP家族中最小但抗凋亡能力最强的成员^[27]。有研究发现，Survivin的表达与肿瘤的发生发展、预后及对放、化疗的敏感性有关联^[28]。Survivin在正常细胞内尤其是高分化的细胞内呈现低表达或无表达，而在肿瘤细胞内呈现特异性的高表达^[29]。有研究发现，Survivin在肺癌、乳腺癌、胰腺癌、直肠癌、前列腺癌等人类多数肿瘤中均呈现出高表达。关于鼻咽癌与Survivin表达的关联性在国外鲜有报道^[30]。本研究检测沉默Survivin基因鼻咽癌G666-1细胞的生物学特性改变。

CCK-8法是一种广泛应用于检测细胞增殖以及细胞毒性的方法，其具有检测过程快速、灵敏度高等优点^[31]。本实验通过CCK-8增殖实验检测了鼻咽癌G666-1细胞的增殖情况，其结果表明，G666-1细胞的增殖受到了明显的抑制。肿瘤细胞是基于其具有的侵袭和迁移能力，才可向周围组织浸润，以及向周围血管、淋巴管及远处转移，因此研究迁移和侵袭这一机制是一个连续的过程，它为肿瘤转移的治疗提供了新思路。本研究通过划痕愈合以及Transwell小室实验，证明了经Survivin基因沉默后实验组的鼻咽癌G666-1细胞迁移能力、侵袭能力均出现了显著下降，组间比较差异有显著性意义。经流式细胞术法检测到肿瘤干细胞标志物CD44⁺CD133⁺的表达比例出现显著降低，差异有显著性意义。另外对细胞周期的检测结果显示，实验组鼻咽癌G666-1细胞的生长速度有明显减慢，细胞周期被阻滞在G₀/G₁期，S期的细胞数目也有减少。

综上所述，Survivin基因沉默能够抑制鼻咽癌G666-1细胞增殖、迁移的能力，且能使CD44⁺CD133⁺肿瘤干细胞特性的细胞比例得到下降，因此认为，Survivin基因沉默可能成为有效治疗鼻咽癌新的靶点，此外肿瘤干细胞可为鼻咽癌开发特异有效的靶向性治疗方法提供新的思路。

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