酸性成纤维细胞因子基因体外转染肌卫星细胞

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.15.015

中国组织工程研究

• 组织构建与生物活性因子 tissue construction and bioactive factors • 上一篇下一篇

酸性成纤维细胞因子基因体外转染肌卫星细胞

杨绍安¹，蔡进奎¹，周初松¹，肖晓桃^{1, 2}，肖莎¹，邹晓英¹

1南方医科大学附属珠江医院骨科中心，广东省广州市 510282
2广州市海珠区石溪中医医院针灸科，广东省广州市 510288

收稿日期:2012-09-05 修回日期:2012-11-14 出版日期:2013-04-09 发布日期:2013-04-09
通讯作者: 肖晓桃，主治医师，广州市海珠区石溪中医医院针灸科，广东省广州市 510288 yangshaoan@hotmail.com
作者简介:杨绍安☆，男，1965年生，湖南省邵东县人，汉族，2007年解放军第一军医大学毕业，博士，主任医师，主要从事周围神经损伤的研究。yangshaoan@hotmail.com
基金资助:
2010年广东省自然科学基金项目(10151051501000088)。

Muscle satellite cells transfected with acidic fibroblast growth factor gene in vitro

Yang Shao-an¹, Cai Jin-kui¹, Zhou Chu-song¹, Xiao Xiao-tao^{1, 2}, Xiao Sha¹, Zou Xiao-ying¹

1 Department of Orthopedic Center, Zhujiang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510282, Guangdong Province, China
2 Department of Acupuncture and Moxibustion, Shixi Hospital of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510288, Guangdong Province, China

Received:2012-09-05 Revised:2012-11-14 Online:2013-04-09 Published:2013-04-09
Contact: Xiao Xiao-tao, Attending physician, Department of Acupuncture and Moxibustion, Shixi Hospital of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510288, Guangdong Province, China yangshaoan@hotmail.com
About author:Yang Shao-an☆, Doctor, Chief physician, Department of Orthopedic Center, Zhujiang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510282, Guangdong Province, China yangshaoan@hotmail.com
Supported by:
the Natural Science Foundation of Guangdong Province in 2010, No. 10151051501000088*

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究报道外源性酸性成纤维细胞生长因子既可调节肌卫星细胞增殖和分化，又具有预防运动终板退变及肌萎缩的作用。
目的：通过酸性成纤维细胞因子基因转染大鼠骨骼肌卫星细胞，检测目的基因转染肌卫星细胞效果及基因表达情况，探讨建立有效预防运动终板退变及肌萎缩种子细胞可行性。
方法：取Wistar成年大鼠后肢肌肉，差速贴壁培养法分离纯化肌卫星细胞，观察细胞生长特性并做免疫组织化学鉴定；取第2代细胞，LipofectamineTM2000 Reagent转染试剂介导，将重组真核表达质粒pEGFP-N1-aFGF转染肌卫星细胞为实验组；阴性对照组转染空载质粒pEGFP-N1；空白对照组仅加入转染试剂。转染后24-72 h和传代后分别用倒置荧光显微镜观察细胞绿色荧光蛋白表达情况，计算转染效率。转染细胞行Western Blot检测酸性成纤维细胞因子表达。提取转染后72 h 细胞总RNA, 实时荧光定量PCR检测酸性成纤维细胞因子基因mRNA表达。
结果与结论：分离纯化细胞经免疫组织化学鉴定为肌卫星细胞。荧光显微镜观察到细胞转染6 h后即有绿色荧光发出，荧光强度和表达细胞总数在72 h达到高峰，传代后仍可观察到绿色荧光蛋白表达。实时荧光定量PCR证实目的基因mRNA表达水平远远高于对照组，Western Blot检测实验组有大量酸性成纤维细胞因子产生。提示酸性成纤维细胞基因转染肌卫星细胞可表达基因产物，有望作为基因工程种子细胞预防失神经支配后运动终板退变及肌萎缩。

关键词: 组织构建, 组织构建生物活性因子, 酸性成纤维细胞生长因子, 基因, 肌卫星细胞, 转染, 质粒, 绿色荧光蛋白, 运动终板, 肌萎缩, 神经损伤, 失神经支配, 省级基金

Abstract:

BACKGROUND: It has been reported that acidic fibroblast growth factor (aFGF) not only can mediate cell division and differentiation, but also can prevent motor endplate degeneration and muscular atrophy.
OBJECTIVE: To calculate gene transfection efficiency and detect the target protein expression of muscle satellite cells which were transfected with aFGF gene, in purpose to further study the method to set up cell bank for preventing motor endplate degeneration and muscular atrophy.
METHODS: Muscle satellite cells were extracted from adult Wistar rat, purified by difference-speed adherence method and identified by immunohistochemical assay. The recombinant eukaryotic expression plasmid pEGFP-N1-aFGF was transfected into cells by LipofectamineTM2000 Reagent as experimental group. Muscle satellite cells transfected with pEGFP-N1 served as negative controls. Blank control group was set by adding transfection reagent. Inverted fluorescent microscope was applied to observe green fluorescent protein expression in the cells to calculate transfection efficiency at 24-72 hours after transpection and passaging. Western Blot of aFGF was performed to detect the target protein. Total RNA was extracted at 72 hours after transfection. Real-time fluorescent quantitative PCR was employed in order to find out the changes of cells after transfection on mRNA level.
RESULTS AND CONCLUSION: The immunohistochemical results showed that cultivated cells were muscle satellite cells. The expression of green fluorescent protein appeared as early as 6 hours after transfection, and the amount and intensity peaked at 72 hours. Green fluorescent protein was still seen in the subculture cells. Real-time fluorescent quantitative PCR proved stronger aFGF mRNA expression in the transfected cells with aFGF gene, while a little in the control groups. aFGF protein was highly expressed in the cells transfected with target gene detected by Western Blot. All the results indicate that the aFGF gene can be transfected efficiently and safely into muscle satellite cells and expressed normally, which can serve as the new seed cells for tissue engineering to prevent motor endplate degeneration and muscular atrophy.

Key words: tissue construction, tissue construction and bioactive factors, acidic fibroblast growth factor, gene, muscle satellite cells, transfection, plasmid, green fluorescent protein, motor endplate, muscular atrophy, nerve injury, denervation, provincial grants-supported paper

中图分类号:

R318

杨绍安，蔡进奎，周初松，肖晓桃，肖莎，邹晓英. 酸性成纤维细胞因子基因体外转染肌卫星细胞[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.15.015.

Yang Shao-an, Cai Jin-kui, Zhou Chu-song, Xiao Xiao-tao, Xiao Sha, Zou Xiao-ying. Muscle satellite cells transfected with acidic fibroblast growth factor gene in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.15.015.

图/表（结果） 5

2.1 肌卫星细胞形态、生长特性及分化见图1。

倒置显微镜下观察，刚分离出肌卫星细胞呈球形、散在分布、折光性强，培养24 h后细胞开始贴壁，48- 72 h后完全贴壁，细胞逐渐延展成梭形或纺锤形，见图1A。随培养时间延长和细胞增殖，梭形细胞排列出现方向性、长轴互相平行。当细胞融合到70%-80%以上不传代继续培养或更换分化培养基培养，部分细胞之间开始出现融合，形成多核细胞并有肌管形成，肌管呈光滑长条形，多核，呈平行排列趋势，见图1B。

2.2 肌卫星细胞免疫细胞化学染色鉴定 PP4细胞用α-sarcometric actin和myosin一抗行细胞免疫化学染色均观察到阳性结果，且肌卫星细胞为弱阳性，融合成肌管后染色显示为强阳性，肌管中可见多个细胞核形成核链，见图2A，B。

2.3 细胞转染后绿色荧光蛋白表达检测结果见图3。在490 nm激发波长条件下通过荧光显微镜观察到转染 6 h后细胞即有绿色荧光蛋白表达，转染72 h达到表达高峰，见图3。通过计算绿色荧光染色细胞数占总细胞数百分比，6，12，24，48，72，96，120h 酸性成纤维细胞因子基因转染效率分别为8.5%，10.5%，12.7%，13.0%，14.6%，16.6%，13.2%，与对照组比较差异无显著性意义，见图4。

2.4 酸性成纤维细胞因子基因mRNA表达量检测结果实时荧光定量PCR扩增曲线见图5，实验组酸性成纤维细胞生长因子基因mRNA表达量明显高于对照组，实验组CT值23.96，阴性对照组 CT值1.016，空白对照组 CT值1.000，见图6，mRNA表达实验组与对照组之间差异有显著性意义(P < 0.05)，两对照组之间差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.5 酸性成纤维细胞因子蛋白表达检测结果 Western Blot蛋白免疫印迹检测结果，见图7。可见实验组细胞酸性成纤维细胞因子蛋白表达量明显高于对照组，其相对于内参GAPDH吸光度值(即净吸光度值)为123.3，而阴性对照组、空白对照组分别为1.909，1.606，差异有显著性意义(P < 0.01)；对照组之间酸性成纤维细胞因子表达量净吸光度值差异无显著性意义(P > 0.1)。

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引言

材料方法

设计：细胞分子学水平体外基因重组实验。
时间及地点：于2011年9月至2012年4月在南方医科大学南方医院中心实验室完成。
材料：
实验动物：SPF级Wistar大鼠，体质量(200±10)g，雌雄各半，由南方医科大学动物实验中心提供，动物许可证号：SCXK粤2006-0015。
试剂与仪器：
Reagents and instruments:

实验方法：
原代肌卫星细胞取材、分离、纯化：体积分数1%水合氯醛(300 mg/kg)大鼠腹腔注射麻醉，无菌条件下切取后肢肌肉，剔除结缔组织并称质量，4 ℃预冷PBS漂洗3次，剪成1 mm×1 mm×1 mm肌肉碎屑，离心，PBS漂洗3次，每次静置1 min；每克组织加入4 mL 1 g/L   Ⅰ型胶原酶，37 ℃振荡消化1.5 h，当肉眼观察到肌肉呈絮状、肌束分离、肌肉不再贴附试管壁时说明消化合适；按1∶5体积加入含EDTA 2.5 g/L胰蛋白酶，混匀，37 ℃振荡消化30 min，加入生长培养基终止消化；依次经100，200，400目不锈钢筛网滤过，收集滤液，     1 000 r/min离心5 min，弃上清，生长培养基(含体积分数10%胎牛血清DMEM高糖)重悬细胞，均匀吹打，制备单细胞悬液，接种于培养瓶1(pp1), 37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养2 h后，弃去贴壁细胞，将未贴壁细胞移入另一经多聚赖氨酸处理的培养瓶2(pp2)；孵育24 h之后，pp2中未贴壁细胞移入培养瓶3(pp3)，以24 h为间隔进行系列贴壁, 重复上述步骤3次至培养瓶4(pp4)。
肌卫星细胞免疫组织化学鉴定：取PP4中细胞制备多个细胞爬片，生长培养基培养四五天，当细胞融合度达70%-80%时改用分化培养基(含体积分数2%胎牛血清DMEM高糖)继续培养，光镜下观察到肌管形成时停止培养。PBS洗涤3次，40 g/L多聚甲醛室温固定30 min，PBS洗5 min，3次；体积分数3%H2O2室温浸泡30 min灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水洗5 min，3次；滴加5%BSA封闭液常温静置1 h，甩干不洗。滴加α-sarcometric actin或myosin一抗，4 ℃过夜；PBS洗   5 min，3次；滴加山羊抗大鼠二抗，室温孵育20 min；PBS洗5 min，3次；DAB显色，显微镜下控制显色时间，观察拍照。
实验分组：取免疫组织化学鉴定后同批次肌卫星细胞，随机分为3组：实验组转染携带有目的基因重组质粒pEGFP-N1-aFGF；阴性对照组转染空载质粒pEGFP-N1；空白对照组仅加入转染试剂。
大鼠肌卫星细胞基因转染：①细胞准备：转染前1 d将(2-4)×105细胞接种于6孔培养板，并加入2 mL不含抗生素的完全培养基，37 ℃，体积分数5%CO2培养，保证细胞处于活力较好的对数生长期。②转染液制备：在聚苯乙稀管中制备以下两液(转染每一个孔细胞所用的量)A液：用Opti-MEM培养液稀释1-10 μg 质粒(实验组加入pEGFP-N1-aFGF质粒、阴性对照组加入pEGFP-N1质粒，空白对照组加入等量opti-MEM培养液)，终量100 μL，B液：用不含血清opti-MEM培养液稀释2-50 μg LipofectamineTM2000 Reagent，终量   100 μL，轻轻混合A、B液，室温中置10-15 min。③转染准备：用2 mL不含血清培养液漂洗细胞2次，再加入1 mL opti -MEM培养基。④转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中，摇匀，37 ℃，体积分数5%CO2温箱置6-8 h，吸除培养板培养基，换入无抗生素正常培养液继续培养。⑤转染后观察：转染后6，12，24，48，72，96，120 h荧光显微镜观察，计数10个高倍视野中绿色荧光染色细胞，以绿色荧光染色细胞数占总细胞数百分比代表转染效率。
实时荧光定量检测酸性成纤维细胞因子基因mRNA表达：①细胞总RNA提取：收集转染后72 h各组细胞，用冷PBS缓冲液洗2次，每1×109 细胞加入      1 mL Trizol试剂，在冰浴条件下裂解细胞，室温放置    5 min。按体积比氯仿∶Trizol试剂=1∶5比例加入氯仿，剧烈振荡混合后于室温放置10 min，以12 000 r/min于 4 ℃离心15 min。转移上层水相至新的RNase free的PCR管，按体积比异丙醇∶TRIZOL试剂=1∶2比例加入异丙醇，于室温放置10 min，12 000 r/min 于4 ℃离心15 min。去除上清后，以体积分数为75%的乙醇漂洗RNA 沉淀。真空干燥5-10 min 后，重溶RNA于无RNA 酶的去离子水中。取1.0-2.0 μg 样品稀释后，测A260和A280，定量检测RNA纯度和浓度。②反转录：在RNase free的PCR管中加入1 μg RNA，加DEPC水补充至     12 μL，吹打均匀后，置65 ℃保温5 min，使RNA变性。随后立即冰上致冷，以防止RNA复性。在上述PCR管中加入8 μL混合物(混合物成分：Oligo (d)引物，0.5 μL、0Random primer，0.5 μL、dNTP，2.0 μL、Rnase inhibitor，0.5 μL、5×Buffer，4.0 μL、MLV反转录酶，0.5 μL)，建立总体积20 μL反应体系，将其置于液30 ℃保温10 min，42 ℃保温60 min，72 ℃保温10 min。③PCR反应：以GAPDH做内参，酸性成纤维细胞生长因子基因上游引物：5’- ACA CCG ACG GGC TTT TAT ACG-3，下游引物：5’- CCC ATT CTT CTT GAG GCC AAC-3’。反应条件：94 ℃变性40 s，55 ℃退火30 s，    72 ℃延伸2 min，共持续25个循环，72 ℃ 32 s收集荧光信号，美国ABI7500荧光PCR仪及其分析软件进行PCR扩增及定量分析。
Western blot检测酸性成纤维细胞因子表达：①蛋白抽提：细胞转染72 h后用PBS冲洗3遍，加入RIPA(细胞裂解液)和PMSF(蛋白酶抑制剂)混合液(100∶1)冰上裂解30 min，裂解过程中轻轻震荡培养板，使裂解充分，12 000 r/min，离心10 min取上清液加入上样缓冲液煮沸5 min。-70 ℃保存备用。②SDS-PAGE电泳：比色法测定蛋白浓度，测完蛋白浓度后，计算每个样品取   40 μg 蛋白，加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×，沸水浴加热3-5 min使蛋白变性，冷却后定量上样，电泳1.5-2.0 h。③转膜：在蛋白Marker对照下切下蛋白目标条带，用半干转膜仪将蛋白质条带转移到硝酸纤维素膜上。④免疫反应：将上述硝酸纤维素膜用TBST中漂洗3次，5 min/次。漂洗后将硝酸纤维素膜放入加有BSA封闭液的平皿中，室温下摇床2 h，或者4 ℃冰箱过夜。将封闭后的硝酸纤维素膜放入含有TBST的洗缸中漂洗3次，5 min/次。洗完后将TBST尽可能沥干，放入加有一抗的平皿中侧摆摇床上缓慢摇动孵育2 h。然后再将硝酸纤维素膜在TBST洗缸中室温摇床漂洗3次，5min/次。最后将漂洗过的硝酸纤维素膜放入加有二抗的平皿中，避光室温孵育1 h。孵育后将硝酸纤维素膜在TBST洗缸中洗3次，5 min/次。⑤曝光、显影与图像分析：将硝酸纤维素膜转入暗室，在保鲜膜上将素膜沥干。将化学发光试剂加到硝酸纤维素膜上，显色大约1 min后，去尽残液，放入X射线片夹中。在暗室中，剪相同大小的X射线感光胶片，置硝酸纤维素膜上，作好标记，关上暗盒发光。开始计时，根据信号的强弱适当调整曝光时间，曝光3-5 min，打开X射线片夹，取出X射线片，迅速浸入显影液中显影1 min(20-    25 ℃)，显影结束后，把X射线片立即浸入超纯水中洗涤1min，然后再放入定影液中，定影1 min，最后在超纯水中洗涤1 min，洗掉多于定影液，取出室温下晾干。以GAPDH为内参，未转染肌卫星细胞作为对照，用EC3统凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。
主要观察指标：①原代培养细胞形态、生长状态。②传代培养后细胞形态、生长状态，细胞融合后形态及免疫组织化学染色后细胞形态特征。③荧光显微镜下转染后细胞GFP表达情况及转染效率。④实时荧光定量PCR检测酸性成纤维细胞因子基因扩增曲线，比较各组mRNA表达水平差异性。⑤Western blot蛋白免疫印迹检测酸性成纤维细胞因子蛋白在各组表达量。
统计学分析：采用SPSS 13.0统计软件对数据进行统计学处理，数据用x(_)±s表示，组间比较采用t 检验，   P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

周围神经损伤是临床上极为常见的一种疾病，即使及时修复损伤神经，恢复神经的连续性，受损神经所支配骨骼肌发生不同程度运动终板退变及肌萎缩也常常不可避免，其发生与受损神经对所支配的骨骼肌营养不足有关。已有大量研究证实，神经对肌肉兼有运动支配和营养作用[9-12]。外科手术修复神经仅仅是恢复了神经物理上的连续性，由于神经生长异常缓慢，因此其功能恢复则需要等待漫长的过程，这将会导致神经对肌肉长时间丧失营养作用[13-14]。

失神经支配期间神经断端发生Waller变性、运动终板退变或消失，同时肌组织产生念珠状变性、横纹消失、肌肉萎缩，甚至坏死[15- 17]。有研究者对失神经支配后肌萎缩产生机制做了详尽研究，发现肌萎缩发生与骨骼肌肌卫星细胞数量变化密切相关，发现失神经支配后初期肌卫星细胞数量增加,但以后其数量明显减少、增生潜力显著降低、凋亡比例增加，认为初期肌卫星细胞增加原因是由于参与肌组织损伤性修复，后期肌卫星细胞数量减少、增生潜力下降、凋亡增加的原因与神经营养因子逐渐耗尽、作用不足有关[18- 19]。因此寻找一种能够维持肌卫星细胞数量可望成为解决失神经支配后运动终板退变及肌萎缩的有效方法。

酸性成纤维细胞因子系成纤维细胞生长因子家族最重要成员之一，具有广泛的生物学效应，如促进细胞增殖与分化，促进组织修复，也是一种形态发生因子；其靶细胞有成肌细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞等[20-22]。已有研究证实酸性成纤维细胞因子不仅调节细胞钙离子内流、促进黄嘌呤脱氢酶转变为黄嘌呤氧化酶、清除自由基而达到保护受损的膜性结构如运动终板，而且在重建神经肌肉接头时能激活静止的未分化神经靶细胞形成基底膜，促进血管生成改善局部微循环等作用，从而起到延缓运动终板退变或促进运动终板生成的作用[23]。

关于酸性成纤维细胞因子与肌卫星细胞的相互作用，Kastner等[24]报道酸性成纤维细胞因子能促进肌卫星细胞增殖和分化，而Dong等[25]则具体探讨了不同浓度人重组酸性成纤维细胞因子对肌卫星细胞增殖和分化的影响，发现人重组酸性成纤维细胞因子浓度为20 - 60 μg/L对兔肌卫星细胞增殖作用最明显。因此作者设想构建酸性成纤维细胞因子基因转染肌卫星细胞将成为一种能够维持肌卫星细胞数量的有效种子细胞，同时具有预防运动终板退变的作用。

关于肌卫星细胞分离纯化方法较多，常见的有酶消化结合差速贴壁法、肌速分离法、密度梯度离心法等[26]，各种方法具有不同优势，适用范围也不一样。酶消化结合差速贴壁法操作时间相对短且程序简单，且获取细胞活性较高，但细胞纯度稳定性稍差，即每次获得细胞肌卫星细胞所占比例不一致；肌束分离法操作周期较长，获取细胞量较少，不适用于大规模获取肌卫星细胞；密度梯度离心法可获取较高纯度肌卫星细胞，对实验要求较高纯度肌卫星细胞有显著优势，但是高速长时间离心破坏了细胞内外环境，获取的细胞活力往往不高。实验中发现，脂质体转染需要大量高活性细胞，因此酶消化法结合差速贴壁法获取细胞适合运用于基因转染。

实验获取的肌卫星细胞，经锥虫蓝染色显示细胞活性高达97%。而对于其鉴定，早期研究者习惯于通过检测结蛋白(desmin )来鉴定肌卫星细胞，而本实验采用更具骨骼肌特异性表面标志物ɑ-sarcometric actin和myosin作为检测指标，因为近年来研究者发现结蛋白(desmin)不仅在骨骼肌组织中有表达，在血管平滑肌和一些非肌组织中也有少量表达，所以仅仅具有相对特异性，而ɑ-sarcometric actin和myosin则是骨骼肌特有标志物[27]。免疫组织化学鉴定技术本身存在一定的假阳性率，所以实验中鉴定阳性标准采取同时检测ɑ-sarcometric actin和myosin，当使用当两者鉴定同一批次细胞，观察到两种标志物染色均为阳性，才认为所培养细胞为肌卫星细胞，这与既往单纯鉴定一个标志物相比，很大程度上降低了假阳率，即把非肌卫星细胞被鉴定为肌卫星细胞。

实验还通过真核表达质粒pEGFP-N1-aFGF转染体外培养的肌卫星细胞，结果显示：荧光显微镜下可观察到细胞转染后肌卫星细胞表达绿色荧光蛋白，并随着时间延长表达量逐渐增加，转染后72 h达高峰；实时荧光定量PCR检测实验组mRNA表达量与对照组有明显差异，Western Blot检测提示实验组酸性成纤维细胞因子表达明显增加，与阴性对照组和空白对照组比较差异具有显著性意义，这说明酸性成纤维细胞因子基因成功转染到肌卫星细胞中并在转录水平及翻译水平得以表达。

综上所述，酸性成纤维细胞因子基因转染肌卫星细胞有望成为预防失神经支配后运动终板退变及肌萎缩的新型种子细胞。

酸性成纤维细胞因子基因体外转染肌卫星细胞

Muscle satellite cells transfected with acidic fibroblast growth factor gene in vitro

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