体外诱导外周血造血干细胞分化为成熟红细胞

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1800

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
造血干细胞：是未分化的造血前体细胞，具有自我更新或自我复制能力，在不同造血因子的作用下可分化为各种成熟血细胞。研究发现骨髓、脐血及成人外周血等均含有一定的比例造血干细胞；人类的造血干细胞主要存在于CD34⁺细胞群中。利用造血干细胞定向诱导生产成熟红细胞，为缓解临床供血紧张提供了新思路。
定向诱导分化：利用干细胞具有自我更新及多向分化潜能的特性，在一定条件下，可以定向分化为成熟的功能细胞，是目前干细胞研究的关键环节。该研究正是利用定向诱导分化方法，诱导造血干细胞向成熟红细胞分化，使体外生产成熟红细胞成为可能。

摘要
背景：随着人口老龄化、医疗技术不断的更新，红细胞需求呈增加趋势，血液供应也日趋紧张。体外制备可供临床应用的血液制品成为众多专家关注的热点，而体外诱导造血干细胞向成熟红细胞分化是获得新型血源的可能途径之一。
目的：探讨采用三阶段悬浮培养体系诱导外周血废弃白膜层来源造血干细胞向成熟红细胞分化及体外生产成熟红细胞的可行性。
方法：经河南省红十字血液中心伦理委员会批准，采用外周血废弃白膜层为原料(献血者均知情同意)，分离出CD34+细胞，以此为种子细胞，采用三阶段21 d悬浮培养体系体外诱导造血干细胞向成熟红细胞分化，分别在第4，7，9，11，13，15，17，19，21天进行细胞计数，绘制细胞生长曲线，了解细胞生长情况；在第7，11，15，19，21天进行细胞涂片和瑞氏-吉姆萨染色，显微镜下观察细胞形态学变化；在培养第7天时，采用流式细胞仪检测红系早期分化情况；在第7，11，15，17天时，采用流式细胞仪检测红系终末分化情况；在第15，17，19天时，采用流式细胞仪检测脱核率。
结果与结论：①随着培养天数增加，细胞呈增加趋势，到第17天达高峰，细胞扩增约1 300倍，之后趋于平稳状态；②随着培养天数的增加，细胞从原幼红细胞向嗜碱性幼红细胞、多染幼红细胞、正染幼红细胞分化，培养至21 d时，几乎全部分化为脱核红细胞；③红系早期分化情况：IL-3R/GPA双阴性细胞占(15.8±0.21)%，其中红系爆发集落形成单位(BFU-E)占(0.98±0.21)%，红系祖细胞克隆形成单位(CFU-E)占(8.13±1.42)%；④红系终末分化情况：随着细胞培养天数的增加，GPA表达也逐渐增加，培养至第17天时，接近90%的细胞表达GPA，表明造血干细胞定向红系分化较为成功；⑤随着培养天数的增加，无核红细胞越来越多，至第19天80%以上均为无核红细胞；⑥结果表明，采用三阶段21 d悬浮培养体系，体外诱导来自废弃白膜层的外周血造血干细胞向成熟红细胞分化，可以生产成熟红细胞，且能达到较高脱核率。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-9091-7725(王姣杰)

关键词: 造血干细胞, 外周血, 废弃白膜层, 成熟红细胞, 分化

Abstract:

BACKGROUND: With the aging of the population and the continuous updating of medical technology, the demand for red blood cells is increasing and blood supply intends to be increasingly tight. The preparation of blood products for clinical application in vitro has become a hot spot of many experts, and hematopoietic stem cells differentiating into mature red blood cells in vitro may be an approach for new blood sources.
OBJECTIVE: To explore the practicability of using three-stage suspension culture system to induce the differentiation of peripheral blood hematopoietic stem cells from the abandoned buffy-coat into mature erythrocytes in vitro.
METHODS: The study protocol was approved by the ethics committee of Henan Red Cross Blood Center, China. CD34+ cells were isolated from peripheral blood buffy-coat, and were subsequently induced to differentiate into mature red blood cells in vitro by 21-day three-stage suspension culture system. Cell counts were performed on 4, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, and 21 days of culture, and cell growth curves were then drawn. Cell smear and May-Giemsa staining were performed on 7, 11, 15, 19, and 21 days of culture, for cell morphology observation under a microscope. Flow cytometry was used to detect early erythroid differentiation on 7 days of culture and to detect terminal erythroid differentiation on 7, 11, 15, and 17 days of culture. Denucleation rate of erythroblasts was measured on 15, 17, and 19 days of culture.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) With the increase of culture days, the number of cells showed an increasing trend, reaching a peak on 17 days of culture. The cells expanded to about 1 300 times, and then tended to be stable. (2) With the increase of culture days, the cells differentiated from proerythrocytes to basophilic erythrocytes, polychromatic erythrocytes and positive-stained erythrocytes, and almost all of the cells differentiated into denucleated erythrocytes on 21 days of culture. (3) The percentage of IL-3R/GPA double-negative cells was (15.8±0.21)%, of which erythroid burst-forming units accounted for (0.98±0.21)% and colony-forming units accounted for (8.13±1.42)%. (4) The GPA expression increased gradually with the increase of cell culture days, and about 90% of cells expressed GPA on 17 days of culture, indicating a successful erythroid differentiation of hematopoietic stem cells. (5) With the increase of culture days, the non-nuclear red blood cells increased in number, and accounted for over 80% of the cells until the 19th day of culture. To conclude, in the 21-day three-stage suspension culture system, peripheral blood hematopoietic stem cells from the abandoned buffy-coat can be induced to differentiate into mature red blood cells in vitro, with a high denucleation rate.

Key words: hematopoietic stem cells, peripheral blood, abandoned buffy-coat, mature erythrocyte, differentiation

中图分类号:

王姣杰，安慧娟，单泓，韩小改，别立莉，李建斌. 体外诱导外周血造血干细胞分化为成熟红细胞[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(29): 4662-4667.

Wang Jiaojie, An Huijuan, Shan Hong, Han Xiaogai, Bie Lili, Li Jianbin. Induced differentiation of peripheral blood hematopoietic stem cells into mature erythrocytes in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(29): 4662-4667.

图/表（结果） 1

2.1 细胞在三阶段悬浮培养体系中生长情况 采用三阶段21 d悬浮培养体系，模拟红系发育过程，观察外周造血干细胞向成熟红细胞分化扩增情况。如图1所示，随着培养天数的增加，细胞呈增加趋势，第17天达高峰，细胞扩增到约1 300倍，之后趋于平稳。

2.2 外周血造血干细胞向成熟红细胞分化过程的形态学变化 第7，11，15，19，21天取出细胞，用瑞氏-吉姆萨染色，显微镜下观察并拍照。如图2所示，随着培养天数的增加，细胞从原幼红细胞向嗜碱性幼红细胞、多染幼红细胞、正染幼红细胞分化，培养至21 d时，几乎全部分化为脱核的红细胞。整个培养体系的脱核率达到90%以上。

2.3 红系早期分化情况 用流式分析仪检测样本，首先选取7AAD阴性群细胞(活细胞)，在活细胞的基础上选取IL-3R^-GPA^-细胞，然后在这群双阴性的细胞群中选取CD34⁺CD36^-和CD34^-CD36⁺细胞群，即为红系爆发集落形成单位(BFU-E)和红系祖细胞克隆形成单位(CFU-E)细胞群。培养至第7天时，IL-3R/GPA双阴性细胞占(15.8±0.21)%，其中红系爆发集落形成单位(BFU-E)占(0.98±0.21)%，红系祖细胞克隆形成单位(CFU-E)占(8.13±1.42)%，见图3。

2.4 红系终末分化情况 第7天开始流式细胞仪检测红系终末分化情况，第7，11，15，17天细胞GPA表达率分别为(62.90±6.17)%，(90.40±6.44)%，(92.70±5.79)%，(96.10±2.63)%；随着细胞培养天数的增加，GPA表达也逐渐增加，培养至第17天时，接近90%的细胞表达GPA，表明造血干细胞定向红系分化较为成功。为进一步了解红系终末分化情况，在GPA阳性细胞的基础上，检测细胞膜表面分子Band3和α4-integrin的表达。结果发现膜表面标记分子Band3的表达逐渐升高，α4-integrin的表达逐渐降低，至第17天时，α4-integrin^lowband3^hi细胞数达90%左右，见图4。

2.5 红系晚期脱核情况 Syto16是一种核酸染料，能够透过完整的细胞膜将细胞核染上颜色。为了解细胞增殖分化过程中细胞脱核情况，在红系分化的第15，17，19天，通过流式细胞仪检测Syto16阳性细胞比例来判定红系晚期细胞脱核情况，第15，17，19天的脱核率分别为(53.98±3.49)%，(82.5±3.56)%，(91.8±2.18)%，表明随着培养天数的增加，无核红细胞越来越多，至第19天80%以上均为无核红细胞，见图5。

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞学基础实验研究。

1.2 时间及地点 实验于2017年9月至2018年9月在郑州大学生命科学院红系发育研究实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 外周血白膜层 自2017年8月至2018年6月期间河南省红十字血液中心400 mL规格全血白膜法制备血小板后的废弃白膜层，献血者均知情同意。

1.3.2 实验仪器与试剂 CO₂培养箱(Thermo Scientific，USA)；流式细胞分析仪(BD，LSRFortessa，USA)；倒置显微镜(Zeiss，Germany)；一次性含生理盐水多联采血袋(规格：165 mL，山东威高)；淋巴细胞分离液(GE Healthcare，USA)；CD34⁺ beads (Miltenyi Biotec，Germany)；MACS细胞分选柱(Column LS) (Miltenyi Biotec，USA)；MACS细胞分选器 (MACS Separator) (Miltenyi Biotec，USA)；IMDM培养基(Gibco，USA)；胎牛血清(Hyclone，USA)；人AB血浆(由河南省红十字血液中心提供)；促红细胞生成素(Thermo Scientific，USA)；干细胞生长因子(Stem Cell，USA)；白细胞介素3(Stem cell，USA)；转铁蛋白(Sigma，USA)；PE-Cy7-IL3R (eBioscience，USA)；PE-CD34、FITC-CD36、APC-GPA (BD Pharmigen，USA)；PE-Cy7-GPA(Beckman CoμLter，USA)；APC-CD36(BD Pharmigen，USA)；7AAD(BD Pharmigen，USA)；APC-α4(Miltenyi Biotec，Germany)；FITC-Band3、PE-GPA(BD Pharmigen，USA)；FITC- SYTO16(Thermo Scientific，USA)；PE-Cy7-Annexin V (eBioscience，USA)等。

1.4 方法

1.4.1 外周血单个核细胞的分离 采用河南省红十字血液中心多联袋无菌分离单个核细胞分离方法：①将每份含有白膜层(30-50 mL)的血袋，利用无菌接驳机对接含有淋巴细胞分离液及生理盐水的多联袋，先用生理盐水1∶1稀释白膜层，再缓慢加入含有约100 mL淋巴细胞分离液的转移袋内，然后用止流夹夹闭管路；②离心：将上述多联袋轻轻装入离心杯，配平后置入大容量低温离心机，4 ℃，2 000 r/min离心20 min；③分离单个核细胞：离心后，取出多联袋，将含有淋巴细胞分离液和白膜层的血袋，轻轻置入分浆夹内，打开止流夹，分离出血浆层，距离单个核细胞层约2 cm时，夹闭转移袋管路，再打开另一空转移袋，将少量血浆连同单个核细胞层一起转移至空转移袋内；④生理盐水洗涤单个核细胞：将约100 mL生理盐水加入含有单个核细胞的血袋内，轻轻混匀，再次置入离心机，4 ℃，2 770 r/min离心5 min，离心后置入分浆夹内，分离出上清，血袋内沉淀即为单个核细胞。

1.4.2 CD34⁺细胞的纯化 利用免疫磁珠分选法分离CD34⁺细胞。具体步骤：①将上述单个核细胞以1×10⁸个细胞为1个单位，每单位细胞加入300 μL缓冲液[缓冲液配方：500 mL 1×PBS+2.5 g BSA+0.5 mol/L EDTA(pH值8.0)+体积分数为2%新生牛血清]和Fc封闭液100 μL，充分混匀后，4 ℃孵育10 min，然后加入CD34 microbeads 100 µL，4 ℃孵育30 min；②孵育完成后，加入50 mL缓冲液，4 ℃，1 200 r/min离心10 min，弃上清；③加入缓冲液3-5 mL重悬单个核细胞；④将分离柱置于磁力架上，先用2 mL缓冲液平衡柱子，然后加入细胞悬液，待分离柱中的细胞悬液微量时，再加入2 mL缓冲液洗涤分离柱3次；⑤取下分离柱，放置到新的15 mL离心管中，加入2 mL缓冲液，推动手柄，将细胞吹下；⑥取一支新的分离柱，重复④和⑤。

1.4.3 CD34⁺细胞的培养 每份白膜层可分离出约0.5×10⁶个CD34⁺细胞，按照1×10⁸ L^-1密度，采用三阶段悬浮培养法，在37 ℃，含体积分数为5%CO₂的培养箱中培养，基础培养基是在IMDM中加入体积分数为3%胎牛血清、2%人AB血浆、10 mg/L胰岛素、1%青链霉素等成分。

具体培养方案：①第0-7天，基础培养基中加入3 IU/mL肝素、200 mg/L人转铁蛋白、3 IU/mL红细胞生成素、10 µg/L干细胞因子、1 µg/L白细胞介素3；②第7-10天，基础培养基中加入1 IU/mL肝素、200 mg/L人转铁蛋白、1 IU/mL红细胞生成素、10 µg/L干细胞因子；③第11-14天，基础培养基中加入1 IU/mL肝素、1 g/L人转铁蛋白、1 IU/mL红细胞生成素；④第15-21天，基础培养基中加入1 g/L人转铁蛋白。

1.4.4 细胞计数 分别在第4，7，9，11，13，15，17，19，21天在倒置显微镜下进行细胞计数，绘制细胞生长曲线，了解细胞生长情况。

1.4.5 细胞形态学观察 分别在第7，11，15，19，21天取1×10⁵个细胞进行细胞涂片，瑞氏-吉姆萨染色，显微镜下观察并拍照。

1.4.6 流式细胞仪检测红系早期分化 在培养第7天时，采用流式细胞仪检测红系早期分化情况。取1×10⁵个细胞至1.5 mL EP管中，4 ℃，300×g离心5 min，弃上清，加入1 mL PBS+0.5%BSA缓冲液重悬细胞，4 ℃，300×g离心5 min，弃上清，加入22.5 μL PBS+0.5%BSA缓冲液重悬细胞，依次向细胞悬液里加入以下几种抗体：APC-GPA (1∶50)，1 μL；PE-CD34，2 μL；FITC-CD36，1 μL；PE-Cy7-IL3R，2 μL；充分混匀后，室温避光孵育15 min，加入1 mL PBS+0.5%BSA缓冲液，4 ℃，300×g离心5 min，弃上清，加入200 μL PBS+0.5%BSA缓冲液重悬细胞，将细胞悬液转移至含有3 μL 7AAD的流式管中，上流式分析仪检测，首先选取7AAD阴性群细胞(活细胞)，在活细胞的基础上选取IL-3R^-GPA^-细胞，然后在这群双阴性的细胞群中选取CD34⁺CD36^-和CD34^-CD36⁺细胞群，即为红系爆发集落形成单位(BFU-E)和红系祖细胞克隆形成单位(CFU-E)细胞群。

1.4.7 流式细胞仪检测红系终末分化 在第7，11，15，17天时，采用流式细胞仪检测红系终末分化情况。取1×10⁵个细胞至1.5 mL EP管中，按上述步骤处理细胞后，依次向细胞悬液里加入以下几种抗体：PE-GPA(1∶20)，1 μL；FITC-Band3，1 μL；APC-α4-integrin，1.3 μL；充分混匀后，室温避光孵育15 min，加入1 mL PBS+0.5%BSA缓冲液，4 ℃，300×g离心5 min，弃上清，加入200 μL PBS+0.5%BSA缓冲液重悬细胞，将细胞悬液转移至含有 3 μL 7AAD的流式管中，上流式分析仪检测，首先选取7AAD阴性群细胞(活细胞)，然后在活细胞的基础上选取GPA⁺细胞群，检测细胞膜表面分子Band3和α4-integrin的表达。

1.4.8 流式细胞仪检测红系晚期细胞脱核 在第15，17，19天时，采用流式细胞仪检测脱核率。取1×10⁵个细胞至1.5 mL EP管中，4 ℃，300×g离心5 min，弃上清，加入1 mL PBS+0.5%BSA缓冲液重悬细胞，4 ℃，300×g离心5 min，弃上清，加入30 μL PBS+MgCl₂缓冲液重悬细胞，加入0.6 μL Syto16，充分混匀后，室温避光孵育15 min，加入1 mL PBS+0.5%BSA缓冲液重悬细胞，4 ℃，300×g离心5 min，弃上清，加入200 μL PBS+0.5%BSA缓冲液重悬细胞，将细胞悬液转移至含有3 μL 7AAD的流式管中，上流式分析仪检测，首先选取7AAD阴性细胞群，在此基础在检测Syto16的表达水平，Syto16⁺为有核红细胞，Syto16^-为网织红细胞。

1.5 主要观察指标 ①细胞生长曲线；②细胞形态学；③早期红系分化情况；④晚期红系分化情况；⑤红系晚期脱核率。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

干细胞领域的研究为人们提供了一个潜在血液替代来源的选择，随着干细胞研究及其相关领域生物学技术的快速发展，体外生产红细胞为临床输血带来了新希望。目前为止，人们利用多种来源干细胞/祖细胞进行体外培养，试图大规模生产红细胞，其中包括应用脐血、骨髓和外周血动员的CD34⁺细胞以及人胚胎干细胞、诱导多潜能干细胞^[11-21]，但是学者们较少关注外周血废弃白膜层来源的造血干/祖细胞。而采供血机构有大量废弃白膜层，如果能利用起来可以变废为宝。该研究以血站废弃白膜层中单个核细胞为原料，从中分离纯化出CD34⁺造血干细胞进行培养，诱导分化为成熟红细胞，探讨此过程中细胞增殖分化情况，为体外生产红细胞探索技术路线。

造血干细胞向成熟红细胞分化要经历多阶段分化发育，成年期骨髓造血红系发育可大致分为3个阶段：早期红系发育阶段、红系终末分化阶段和网织红细胞成熟阶段。红系早期发育阶段起始于造血干细胞分化为红系祖细胞，包括早期红系祖细胞集落形成单位(BFU-E)和晚期红系祖细胞克隆形成单位(CFU-E)，晚期红系祖细胞克隆形成单位历经增殖分化进入红系终末发育阶段：原始红细胞、早期早幼红细胞和晚期早幼红细胞、中幼红细胞、晚幼红细胞4个时期，然后脱核形成网织红细胞，进入到外周血后进一步发育为成熟的红细胞。

目前体外诱导造血干细胞分化为成熟红细胞的培养体系一直处于探索优化中，根据培养体系中有无血清大致分为2类，含血清培养体系和无血清培养体系，含血清培养体系又根据血清来源分为胎牛血清和人AB血清。目前大多文献报道体外诱导扩增生产成熟红细胞的培养体系为无血清培养体系^[6^，^22-25]，但无血清培养体系价格昂贵，不利于体外大规模生产成熟红细胞。Hu等^[26]采用三阶段21 d含血清培养体系诱导脐血造血干细胞向红系分化，成功生产出红细胞，并达到平均脱核率达60%以上。廖基灵等^[27]探讨人AB血清对终末期红系分化进程的影响，其认为在体外红系发育培养体系中，AB血清对终末期红系分化进程有一定的促分化、促脱核作用。因此该研究拟采用三阶段21 d含血清培养体系，模拟红系发育过程，期望能达到预期目的。研究结果显示：从细胞增殖情况来看，随着培养天数的增加，细胞呈增加趋势，到第17天达高峰，细胞扩增到约1 300倍，之后趋于平稳；从细胞形态学来看，随着培养天数的增加，细胞从原幼红细胞向嗜碱性幼红细胞、多染幼红细胞、正染幼红细胞分化，培养至21 d时，几乎全部分化为脱核的红细胞，整个培养体系的脱核率达到90%以上。

同时，利用流式细胞技术检测了不同培养时间的红系分化情况。研究发现在红系发育的早期祖细胞阶段，除了依靠红系祖细胞集落形成单位和红系祖细胞克隆形成单位形成的集落形态来区分之外，还可通过筛选不同的表面标记分子组合来区分，人的红系祖细胞集落形成单位的细胞表面标记分子组合为CD45⁺GPA^-IL-3R^-CD34⁺CD36^-CD71^low，而人的红系祖细胞克隆形成单位的细胞表面标记分子组合为CD45⁺GPA^-IL-3R^-CD34^-CD36⁺CD71^high，通过此方法筛选出来的红系祖细胞集落形成单位和红系祖细胞克隆形成单位，再通过集落形态鉴定纯度在85%以上^[28]。因此，该研究选用GPA、CD34、CD36和IL-3R四个标志物来了解早期红系分化情况，在培养第7天时流式细胞仪检测上述抗体标记细胞，先选取IL-3R^-GPA^-细胞，然后在这群双阴性的细胞群中选取CD34⁺CD36^-和CD34^-CD36⁺细胞群，即为红系祖细胞集落形成单位和红系祖细胞克隆形成单位细胞群。结果提示，双阴性细胞群约占15.9%，其中红系祖细胞集落形成单位含量较低，约占1%，红系祖细胞克隆形成单位较红系祖细胞集落形成单位含量高，约占9%，表明该阶段造血干/祖细胞仅有一小部分处于红系早期分化阶段，其余大部分已进入红系终末分化阶段。

GPA为红系特异性的标记物，并且它的出现标志着分化中的早期细胞进入了原始红细胞阶段。对于人红细胞的分化来说，造血干/祖细胞和早期红系细胞不表达GPA，随着细胞不断向成熟红细胞分化，GPA阳性细胞所占比例不断升高。研究发现，GPA是红系发育早期和终末的分界点，单一依靠GPA并不能区分红系终末分化的各个阶段的细胞。Hu等^[²⁶^]研究发现人红系终末分化过程中膜表面标记分子Band3的表达水平逐渐升高，然而另一个膜表面分子α4- integrin的表达水平则逐渐下降。根据人红系终末分化各期细胞的膜表面分子的不同表达水平，筛选出各期的膜表面标记分子组合：Pro-E(α4-integrin^hiband3^neg)，EB (α4-integrin^hiband3^low)，LB(α4-integrin^hiband3^med)，Poly (α4-integrin^medband3^med)，Ortho(α4-integrin^lowband3^hi)。该研究分别在第7，11，15，17检测了GPA、band3和α4-integrin的表达，以期了解外周造血干细胞向红系终末分化进程变化，结果显示培养至第7天时，GPA阳性细胞已达62.7%，随着细胞培养天数的增加，GPA表达也逐渐增加，至第17天已近90%。为进一步了解晚期红系分化各阶段细胞比例变化，该研究还检测了band3和α4-integrin的表达，第7天时Pro-E(α4-integrin^hiband3^neg)约占7.58%，绝大部分为早幼红细胞，占90%以上；第11天时以早幼红细胞为主，高达80%以上；至第17天时，几乎均为晚幼红细胞，这个变化进程与细胞形态学观察一致。

红系晚期脱核是体外生产红细胞的一个重要环节，脱核率较高说明体外诱导生产细胞的整体分化程度较高。细胞的脱核情况可通过细胞甩片和瑞氏-吉姆萨染色观察，也可以借助SYT016等染料对DNA染色，进而通过流式细胞术检测细胞的脱核率^[29-30]。该研究一方面利用细胞形态学观察细胞脱核情况，一方面采用流式细胞术检测细胞培养晚期脱核情况，在红系分化的第15，17，19天，通过流式细胞术检测Syto16阳性细胞的比例来判定红系晚期细胞脱核情况，脱核率分别为(53.98±3.49)%，(82.5±3.56)%，(91.8±2.18)%，表明随着培养天数的增加，无核红细胞越来越多，至第19天80%以上均为无核红细胞，这个结果也与细胞形态学表现一致，表明该培养体系下红系脱核率较高。

综上所述，该研究采用三阶段21 d含血清培养体系，利用废弃白膜层来源外周造血干细胞体外定向红系诱导，可以生产出成熟红细胞，并能获得较高脱核率。不足之处是扩增倍数有限，下一步研究重点改良培养条件，关注干/祖细胞等早期细胞的扩增，期望获得更高的扩增倍数，提高红细胞产率。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程