小鼠腹白线组织中Sca-1+成体干细胞的分布

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1721

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (17): 2672-2677.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1721

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

小鼠腹白线组织中Sca-1⁺成体干细胞的分布

郝宇卉¹，刘志贞²，刘丹²，冯玉娟¹，解军²

¹忻州职业技术学院医学系，山西省忻州市 034000；²山西医科大学生物化学与分子生物学教研室，山西省太原市 030001

修回日期:2019-02-16 出版日期:2019-06-18 发布日期:2019-06-18
通讯作者: 解军，教授，山西医科大学生物化学与分子生物学教研室，山西省太原市 030001
作者简介:郝宇卉，女，1973 年生，山西省偏关县人，汉族，2013年山西医科大学毕业，硕士，讲师，主要从事生物化学、病理学教学工作，主要研究方向是干细胞与经络的相关性。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81671462)，项目负责人：解军；山西省重点实验室建设项目(2015012001-16)，项目负责人：解军；山西省“1331工程”重点学科建设计划经费资助(晋教科[2017]6号)，项目负责人：解军；山西省回国留学人员重点科研资助项目(2013-重点5)，项目负责人：解军；山西省回国留学人员科研资助项目(2016-051)，项目负责人：刘志贞；忻州市科技计划项目(20180103)，项目负责人：郝宇卉

Distribution of Sca-1⁺ adult stem cells along the linea alba of mice

Hao Yuhui¹, Liu Zhizhen², Liu Dan², Feng Yujuan¹, Xie Jun²

¹Department of Medicine, Xinzhou Vocational and Technical College, Xinzhou 034000, Shanxi Province, China; ²Teaching and Research Department of Biochemistry and Molecular Biology, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China

Revised:2019-02-16 Online:2019-06-18 Published:2019-06-18
Contact: Xie Jun, Professor, Teaching and Research Department of Biochemistry and Molecular Biology, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China
About author:Hao Yuhui, Master, Lecturer, Department of Medicine, Xinzhou Vocational and Technical College, Xinzhou 034000, Shanxi Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81671462 (to XJ); Shanxi Provincial Key Laboratory Construction Project, No. 2015012001-16 (to XJ); the “1331 Engineering” Key Discipline Construction Project of Shanxi Province, No. [2017]6 (to XJ); the Key Scientific Research Project for the Returned Overseas Students of Shanxi Province, No. 2013-5 (to XJ); the Scientific Research Project for the Returned Overseas Students of Shanxi Province, No. 2016-051 (to LZZ); the Science and Technology Plan Project of Xinzhou, No. 20180103 (to HYH)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
成体干细胞：在机体的各种组织器官中均存在成体干细胞，是已分化组织中的未分化细胞，通过按一定程序的自我更新和形成特异组织类型细胞来维持组织细胞功能的稳态。正常情况下多数处于休眠状态，其所处微环境的改变可激活休眠的成体干细胞参与组织的更新和修复。文章阐述的成体干细胞主要是指小鼠腹白线脂肪组织成体干细胞。
腹白线：Rick通过对人和19种动物腹白线的观察，最早报道了前腹壁腱膜纤维在腹白线的交织情况。他认为腹白线是由腹前正中线上两侧腹肌腱膜纤维交织而成的腱性结构，起于剑突软骨终止于耻骨联合上缘，而作者通过实验首次观察到小鼠腹白线由脂肪组织构成。在腹针疗法中，腹白线是任脉在腹部的体表标志，确定了任脉在腹部取穴的标准。
任脉：在经络理论中，分正经和奇经两大类。正经有12条，奇经有8条，称奇经八脉。任脉属奇经八脉，行循于胸腹部前正中，能总任一身之阴经，具有调节气机的功能，还有“妊养”的功能，与生殖有关，其起于小腹内，向下行于会阴，再向上行于腹白线，向上至胸前正中线，至咽喉上行口目。

摘要
背景：干细胞与经络的关系目前还停留在理论探讨阶段，亟需通过实验进行科学研究。
目的：通过实验观察小鼠腹白线脂肪组织Sca-1⁺成体干细胞的分布情况，为进一步探讨干细胞与任脉的关系提供实验基础。

方法：选取Balb/c小鼠，通过体视显微镜、苏木精-伊红染色观察小鼠皮下胸部前正中线任脉循行部位组织形态特点。以任脉在腹部的体表标志——腹白线为研究对象，通过体视显微镜、苏木精-伊红染色、油红O染色、Masson染色观察小鼠腹白线组织形态特点；通过免疫组织化学染色、多层切片观察小鼠腹白线脂肪组织Sca-1⁺成体干细胞分布情况。

结果与结论：①首次观察到脂肪组织呈条带状分布于小鼠皮下前正中线任脉循行部位；②首次观察到小鼠腹白线由脂肪组织构成；③首次观察到Sca-1⁺成体干细胞沿小鼠任脉在腹部的体表标志——腹白线分布；④该实验只对任脉腹白线段Sca-1⁺成体干细胞进行了观察，是在一个小范围的尝试，但这一尝试有可能为探讨任脉功能与干细胞功能提供实验基础与思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-1794-8247(郝宇卉)

关键词: 干细胞, 成体干细胞, 脂肪组织, 腹白线, 任脉, Sca-1⁺成体干细胞, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: The interaction between stem cells and meridians and collaterals is still in the stage of theoretical research, and it is urgent to conduct relevant scientific experiments.
OBJECTIVE: To observe the distributions of Sca-1⁺ adult stem cells in the fat tissues of murine linea alba, providing an experimental basis for further studying the interaction of stem cells with meridians and collateral channels.
METHODS: Balb/c mice were selected to observe the morphological characteristics of any Ren-meridian circulation regions along the anterior midline of the subcutaneous chest of the mice through stereomicroscopy and hematoxylin-eosin staining. Linea alba, the abdomen landmark of Ren-meridian, was selected as the objective of our study. Morphologies of tissues from linea alba were observed by stereomicroscope, hematoxylin-eosin staining, oil red O staining and Masson staining. Distribution of Sca-1⁺ adult stem cells from fat tissues in the linea alba was observed by immunohistochemical staining and multiple slices.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) In the study, we firstly observed that the fat tissues presented with band-like distribution in Ren-meridian circulation regions along the anterior midline of the subcutaneous chest of mice. (2) We firstly found that murine linea alba was made of fat tissues. (3) We firstly observed that Sca-1⁺ adult stem cells were distributed along the linea alba, the abdomen landmark of Ren-meridian. The present study preliminarily investigated the Sca-1⁺ adult stem cells in the linea alba part of Ren-meridian. This attempt may provide an experimental basis and idea for the exploration of functions of stem cells and Ren-meridian.

Key words: stem cells, adult stem cells, fat tissue, linea alba, Ren-meridian, Sca-1⁺ adult stem cells, National Natural Science Foundation of China

中图分类号:

郝宇卉，刘志贞，刘丹，冯玉娟，解军. 小鼠腹白线组织中Sca-1⁺成体干细胞的分布[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(17): 2672-2677.

Hao Yuhui, Liu Zhizhen, Liu Dan, Feng Yujuan, Xie Jun. Distribution of Sca-1⁺ adult stem cells along the linea alba of mice[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(17): 2672-2677.

图/表（结果） 1

2.1 小鼠皮下前正中线任脉循行部位大体观察结果 任脉起于小腹部中极穴下面，沿胸腹正中线直上至咽喉，再上颐、循面、入目^[12]。参照小鼠经络穴位示意图，从实验动物中随机选15-16周龄Balb/c小鼠，雌鼠1只，雄鼠1只，进行任脉循行部位解剖定位并取材^[13]、体视显微镜观察。

小鼠胸部取材厚度从浅筋膜、肌层到胸骨膜，前正中线居中，所取组织长约3.5 cm，宽约2.5 cm。大体可见小鼠胸前正中线任脉走行处有白色脂肪组织呈条带状分布，条带状分布的白色脂肪组织与任脉在胸部的经络循行路线一致，见图1A。

小鼠腹部前正中线任脉循行部位解剖定位于腹白线^[10-11]，取腹白线组织，厚度从皮下腹壁浅筋膜、腹肌到壁腹膜。腹白线居中，所取组织长约4.5 cm，宽约3.5 cm。体视显微镜下观察到腹白线处由条带状白色脂肪组织构成，条带状分布的白色脂肪组织与任脉在腹部的经络循行路线一致，见图1B。

2.2 小鼠皮下前正中线胸部任脉解剖定位处苏木精-伊红染色观察结果 取实验小鼠皮下胸部前正中线任脉解剖定位处组织做苏木精-伊红染色，可见在小鼠皮下前正中线胸部组织冠状面切片上有白色脂肪组织呈条带状分布在胸前正中线，见图2。

2.3 小鼠腹白线苏木精-伊红染色结果 取小鼠腹白线及周围组织进行苏木精-伊红染色，结果可见在腹白线组织冠状面切片上有白色脂肪组织呈条带状分布，见图3。

2.4 小鼠腹白线组织特殊染色观察结果 取小鼠腹白线组织进行油红O染色与Masson染色，观察到在小鼠腹白线组织冠状面切片腹白线上有油红O染色阳性的脂肪细胞与Masson染色阳性的胶原纤维，见图4；而分布在腹白线两边的是染成红色的肌纤维。组织特殊染色结果显示小鼠腹白线由白色脂肪组织构成。

2.5 Sca-1⁺成体干细胞在小鼠腹白线脂肪组织中的分布情况 腹白线脂肪组织多层切片中均有染成棕色的Sca-1⁺细胞，而与其相邻的腹前壁肌层中未见染成棕色的Sca-1⁺细胞，见图5(箭头所示)。

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引言

材料方法

1.1 设计 组织染色结果观察实验。

1.2 时间及地点 2013年2月至2018年12月在山西医科大学生物化学与分子生物学实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 Balb/c小鼠10只，15-16周龄，雌雄各半，体质量19.2-23.1 g，在SPF级环境下饲养，由山西医科大学动物中心提供，实验动物生产许可证号为SCXK(晋) 2015-0001，实验动物使用许可证号为SYXK(晋)2015- 0001。

1.3.2 实验试剂 免疫组化染色试剂盒Histostain^TM-Plus Kits(SP-002)(北京博奥森生物技术有限公司)；饱和油红O染色液(Solarbio公司)；快速Masson染液(南京建成科技有限公司)；多聚赖氨酸(武汉博士德生物工程有限公司)；OCT冰冻切片包埋剂(美国SAKURA公司)；Anti-Sca1/Ly6A/E antibody、Goat anti-mouse IgG(H+L)-HRP(Jackson公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 体视显微镜组织观察 取2只15-16周龄Balb/c小鼠，雌雄各1只，将小鼠皮下前正中线任脉走行相对应组织分离成胸部和腹部两部分。胸部取材为：长约3.5 cm，宽约2.5 cm，前正中线居中，厚度从浅筋膜、肌层到胸骨膜；腹部取材为：长约4.5 cm，宽约3.5 cm，小鼠腹白线居中，厚度从腹壁浅筋膜、腹肌到壁腹膜。分别放入盛有0.01 mol/L PBS的平皿中，在体视镜的6倍、12倍、25倍、50倍镜下进行观察，胸部组织在6倍镜下拍照、腹部组织在12倍镜下拍照。

1.4.2 苏木精-伊红染色 取2只15-16周龄Balb/c小鼠，雌雄各1只，行颈椎脱臼处死，腹部脱毛，清洁，切开皮肤，胸部选取任脉循行线脂肪组织条带明显的部位取材，取材厚度从浅筋膜、肌层到胸骨膜，长约2 cm，宽约1.5 cm；腹部选取腹部前正中线组织腹白线明显的部位取材，取材厚度从腹壁浅筋膜、腹肌到壁腹膜，长约2 cm，宽约1.5 cm，腹白线位于所取组织正中。将所取组织迅速用OCT冰冻切片包埋剂包埋后放入液氮冷冻，同时将冰冻切片机准备到位后上机切片，切好的冰冻切片放入甲醇固定6 s后蒸馏水洗2次，苏木精染色3 min，盐酸乙醇分化，氨水返蓝，梯度乙醇脱水后二甲苯透明，中性树胶封固。选择切片完整，染色成功的拍照。

1.4.3 油红O染色 取2只15-16周龄Balb/c小鼠，雌雄各1只，行颈椎脱臼处死，备皮，沿腹部前正中线切开皮肤，暴露腹壁，选取腹部前正中线组织腹白线明显的部位取材，取材厚度从腹壁浅筋膜、腹肌到壁腹膜，用眼科剪剪取长约2 cm，宽约1.5 cm的组织放入OCT冰冻切片包埋剂中包埋，液氮冷冻，切片，甲醇固定6 s，蒸馏水洗2次，体积分数为60%乙醇浸洗2次，油红O染色10 min，体积分数为60%乙醇脱色至背景无色，蒸馏水洗后苏木精染色2 min，自来水洗后封固。选择切片完整，染色成功的组织拍照。

1.4.4 Masson染色 取2只15-16周龄Balb/c小鼠，雌雄各1只，行颈椎脱臼处死，常规脱毛备皮，暴露腹壁组织，选择腹白线位于正中的腹壁组织，取材厚度从腹壁浅筋膜、腹肌到壁腹膜，长约2 cm，宽约1.5 cm，将取好的组织用OCT冰冻切片包埋剂包埋，液氮冷冻，上机切片，甲醇固定6 s，蒸馏水洗2次，苏木精染色5 min，水洗后Masson丽春红染色5 min，冰醋酸浸洗片刻，1%磷钼酸水溶液分化3 min，直接用苯胺蓝染5 min，以冰醋酸浸洗片刻，体积分数为95%乙醇洗后吹干封固。选择切片完整，染色成功的组织拍照。

1.4.5 免疫组织化学染色 取2只15-16周龄Balb/c小鼠，雌雄各1只，行颈椎脱位处死，取材部位为脐周腹白线组织，组织长度约2 cm，脐上1 cm，脐下1 cm；组织宽约1.5 cm，腹白线居中，厚度从腹壁浅筋膜、腹肌到壁腹膜。取材后及时固定，固定完成后进行冰冻切片，切片经体积分数为3%过氧化氢15 min，蒸馏水洗5 min，PBS浸泡5 min，枸橼酸盐缓冲液中煮沸1 min，自然冷却后重复煮沸1次；待修复液自然冷却后，PBS洗3次，加5%BSA覆盖组织，在湿盒内放置15 min后滴加用5%BSA稀释(1∶100)的Sca-1一抗覆盖组织块，在湿盒内4 ℃过夜，第2天将湿盒内4 ℃过夜后的切片取出，PBS洗3次，滴加用5%BSA稀释(1∶500)的羊抗鼠IgG-HR二抗覆盖组织块，37 ℃湿盒中孵育40 min，PBS洗3次，加DBA显色液染色2-8 min，光学显微镜下观察显色结果满意后及时终止染色；PBS洗3次，苏木精染液染色1-5 min，光学显微镜下观察染色结果满意后及时终止染色，后续步骤同上苏木精-伊红染色。选择切片完整，染色成功的组织拍照。

1.5 主要观察指标

1.5.1 苏木精-伊红染色、油红O染色、Masson染色结果 分别在显微镜物镜的×4，×10，×20，×40倍下观察腹白线组织结构特点并选取染色成功的组织拍照，苏木精-伊红染色结果是细胞核为蓝色，细胞质、结缔组织、肌肉染成不同程度的粉红色或红色；油红O染色结果是脂肪细胞中脂滴被染成红色，苏木精复染核蓝色；Masson染色结果是脂肪组织中胶原纤维被染成蓝色，肌肉组织被染成红色。

1.5.2 Sca-1⁺细胞免疫组织化学染色结果 Sca-1⁺细胞被染成褐色，细胞核染成蓝色。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

近几年，无论在干细胞领域还是中医领域，已有越来越多的研究者开始从理论上探究干细胞与中医理论中元气^[14]、肾精^[15-18]、经络等方面的相关性^[1-9]，提出了一些假说；也有学者通过实验探究针灸对干细胞分化、增殖和迁移的影响^[19-23]，推测干细胞可能参与了经络功能的发挥；还有学者通过电针任脉实验发现刺激任脉可促进脑缺血病理状态下的脑神经干细胞分化、增殖，对脑缺血后神经修复和保护有明显的作用^[24-28]。这些假说与实验为研究干细胞与任脉的关系提供了思路和科学依据，但存在实验探究和理论探究未能衔接的现状。如何能将二者衔接起来是干细胞研究者与中医经络理论研究者的一项重大学术任务。

研究任脉与干细胞功能同一性将有可能实现对二者理论探究与实验探究的衔接。作者的实验正是基于此而设计的。

首先从理论上分析，中医经络理论是在中医哲学思想指导下，遵循自然法则，对机体功能不断认识、总结、完善中形成的理论体系^[29]；而生物医学遵循的是结构决定功能的理论^[30]。它们分别属于两套完全不同的理论体系中的任脉与干细胞，只有功能同一性可作为理论上探讨二者关系的嵌入点。中医认为气是构成人体各脏腑、经络和维持其生理活动的最基本物质，是在人体内不断运动着的。元气是人体生命活动的原动力，以禀受于父母的先天之精为基础，又靠后天水谷精气的培育而成^[31]。由此可见，中医经络所言“元气”的功能与生物医学中“受精卵”的功能有相似之处；“气”与“成体干细胞”的功能有相似之处。任脉是 “生气之源”、“聚气之汇”^[32]，与机体生长发育功能密切相关^[33-35]，能够总任阴经气血的盈亏，既调理五脏精气盈亏，又调理六腑的生理功能及病理变化，具有调节局部和全身气机的功能，上述功能与成体干细胞参与生命过程中的自我修复、组织细胞更新及免疫调节的功能是一致的^[36]。因此，作者推测任脉的功能可能从“受精卵”的功能开始，随着受精卵发育成个体，任脉的功能主要由成熟组织中少量成体干细胞参与完成。

在理论分析的基础上，课题组对小鼠皮下前正中线任脉循行部位进行了大体显微镜与苏木精-伊红染色观察，首次观察到前正中线任脉循行部位有白色脂肪组织呈条带状分布。脂肪组织是继发现骨髓是体内干细胞库之后，人类又发现的一个富含干细胞的组织来源^[37-44]。脂肪干细胞作为组织工程的“种子细胞”在动物实验研究中已被广泛应用^[45]。因此，课题组又进一步实验观察了任脉在腹部的体表标志——腹白线中Sca-1⁺成体干细胞分布情况。Sca-1是小鼠Ly-6抗原家族的一员，是一种分子质量为18 kD的抑制细胞周期和分化的糖基磷脂酰肌醇锚定细胞表面蛋白(GPI-AP)。现在很多研究者对组织特异性干细胞都采用Sca-1作为标记分子^[46-47]。通过实验，课题组首次观察到腹白线脂肪组织中有Sca-1⁺成体干细胞分布。这一实验结果提示任脉功能的发挥可能与腹白线脂肪组织Sca-1⁺成体干细胞的参与有关。作者推测在发育过程的各个时间点上，小鼠腹白线脂肪组织中可能存在随着基因开放和关闭而存留在机体、按一定干细胞谱系分布的成体干细胞群，它们存在于组织特异性的干细胞微环境中，等待着生物体发出替换或修复组织的指令。当针灸和中药疗法的物理化学刺激改变干细胞群微环境时，这些分布于腹白线脂肪组织中的Sca-1⁺成体干细胞的自我更新等潜能就会表现出来。干细胞的这些潜能可能会有助于学者们去认识和发展经络理论；同时，在经络理论取类比象的哲学思维模式指导下，通过研究经络理论中任脉功能，将有可能为研究干细胞生物学特性、可塑性、临床应用等方面提供实验思路，观察到干细胞更多的功能。

沿着这条思路，课题组将对小鼠腹白线脂肪组织细胞进行分离培养，将其作为研究工具探讨任脉与干细胞的关系。当然，实验也有不足之处，在实验过程中所取标本富含脂肪组织，且又是微小组织，分别尝试了石蜡切片和冰冻切片，各有利弊。石蜡切片组织完整，却不容易找准实验所要的横断面；冰冻切片可准确找到所要求的切面，但冰冻切片对温度要求很高，很容易出现切片脂肪组织不完整。在染色中，作者发现Sca-1⁺细胞不容易脱片。为了能准确定位组织的切面，最终选择了冰冻切片，这是在实验技术上需要改进完善的地方。该实验简单表浅，只是以Sca-1⁺成体干细胞作为研究的基础物质，进行了某一方面的探讨。课题组之所以发文，是考虑到这一观察结果可能会抛砖引玉，开辟经络与干细胞研究的新领域，主要起到启迪、引导的作用，希望尽快引起更多经络理论研究者和干细胞研究者们的关注，共同参与研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

小鼠腹白线组织中Sca-1⁺成体干细胞的分布

Distribution of Sca-1⁺ adult stem cells along the linea alba of mice

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小鼠腹白线组织中Sca-1+成体干细胞的分布

Distribution of Sca-1+ adult stem cells along the linea alba of mice

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