熊果酸干预骨髓间充质干细胞增殖与成骨分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1729

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (17): 2665-2671.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1729

• 骨髓干细胞 bone marrow stem cells • 上一篇下一篇

熊果酸干预骨髓间充质干细胞增殖与成骨分化

刘耀辉¹，黄振明¹，何精选²，黄玲华¹，李建平³

¹武汉市第九医院骨科，湖北省武汉市 430081；²长江航运总医院骨科，湖北省武汉市 430000；³武汉大学人民医院骨关节外科，湖北省武汉市 430000

修回日期:2019-01-25 出版日期:2019-06-18 发布日期:2019-06-18
通讯作者: 黄振明，主治医师，武汉市第九医院骨科，湖北省武汉市 430081
作者简介:刘耀辉，男，1979年生，2004年湖北科技学院毕业，主治医师，主要从事骨科基础与临床研究工作。
基金资助:
中央高校基本科研业务费专项资金项目(2042016kf0095)，项目负责人：李建平

Effects of ursolic acid on proliferation and differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells

Liu Yaohui¹, Huang Zhenming¹, He Jingxuan², Huang Linghua¹, Li Jianping³

¹Department of Orthopedics, the Ninth Hospital of Wuhan, Wuhan 430081, Hubei Province, China; ²Department of Orthopedics, Yangtze River Shipping General Hospital, Wuhan 430000, Hubei Province, China; ³Department of Bone and Joint Surgery, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430000, Hubei Province, China

Revised:2019-01-25 Online:2019-06-18 Published:2019-06-18
Contact: Huang Zhenming, Attending physician, Department of Orthopedics, the Ninth Hospital of Wuhan, Wuhan 430081, Hubei Province, China
About author:Liu Yaohui, Attending physician, Department of Orthopedics, the Ninth Hospital of Wuhan, Wuhan 430081, Hubei Province, China
Supported by:
the Fundamental Research Funds for the Central Universities, No. 2042016kf0095 (to LJP)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
熊果酸：是一种五环三萜类化合物，广泛存在于枣、枇杷叶、夏枯草等天然植物中，毒性低，具有抗氧化、降血糖、抗肿瘤等活性功能。研究发现，适宜浓度的熊果酸可通过Wnt信号通路抑制破骨细胞增殖分化，对胶原诱导性关节炎模型大鼠有抗炎和骨保护作用，促进骨形成和逆转骨矿物质损失，具有抗骨质疏松作用。
Wnt信号通路：包括Wnt/β-catenin、Wnt/Ca2+、Wnt/PCP等，参与调控生命体生长、发育、衰老和死亡等生命过程，是细胞增殖分化、胚胎和器官发育的关键调控环节和信号转导途径之一。研究发现，Wnt信号通路在骨髓间充质干细胞增殖分化、成骨细胞生成、骨形成、骨重建等方面发挥重要作用，是目前骨骼系统相关疾病发病机制和骨代谢研究的新热点。

摘要
背景：熊果酸可通过Wnt信号通路抑制破骨细胞增殖分化，对胶原诱导性关节炎模型大鼠有抗炎和骨保护作用，但是熊果酸对大鼠骨髓间充质干细胞增殖、分化以及Wnt/β-catenin信号通路相关基因和蛋白表达的影响尚不明确。
目的：探讨熊果酸对骨髓间充质干细胞增殖、分化及Wnt信号通路的影响。
方法：采用全骨髓贴壁法体外培养大鼠骨髓间充质干细胞，不同浓度(1.0，2.5，5.0，10.0，20.0 μmol/L)熊果酸作用骨髓间充质干细胞，以不含熊果酸的培养基为对照组，MTT法检测熊果酸对骨髓间充质干细胞增殖的影响。用含不同浓度(1.0，2.5，5.0 μmol/L)熊果酸的成骨诱导液培养骨髓间充质干细胞，以不含熊果酸的成骨诱导液为对照组，在诱导后第7天和第14天采用ELISA法检测碱性磷酸酶活性和骨钙素水平，在诱导第14天采用RT-PCR检测成骨基因ALP、COL-I、OCN、OPN、RUNX2 mRNA表达水平，采用RT-PCR和Western blot法检测Wnt信号通路相关Wnt-3α、GSK-3β、β-catenin mRNA和蛋白表达。
结果与结论：①不同浓度熊果酸均可促进骨髓间充质干细胞增殖，浓度为5.0 μmol/L时增殖率最高；②骨髓间充质干细胞成骨诱导第7天和第14天时碱性磷酸酶活性和骨钙素水平均比对照组增高，差异有显著性意义(P < 0.05)，且诱导相同时间，随熊果酸浓度增加碱性磷酸酶活性增强，骨钙素水平升高(P < 0.05)；③诱导14 d，熊果酸可促进骨髓间充质干细胞分化后成骨基因ALP、COL-I、OCN、OPN、RUNX2 mRNA表达以及Wnt信号通路相关Wnt-3α、GSK-3β、β-catenin mRNA和蛋白表达，随熊果酸浓度增加其表达水平升高(P < 0.05)；④结果表明，熊果酸通过Wnt/β-catenin信号通路促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-8175-9104(刘耀辉)

关键词: 熊果酸, 骨髓间充质干细胞, 细胞增殖, 成骨分化, 碱性磷酸酶, 骨钙素, 成骨基因, Wnt信号通路

Abstract:

BACKGROUND: Ursolic acid can inhibit the proliferation and differentiation of osteoclasts through Wnt signaling pathway, to exert anti-inflammatory and osteoprotective effects in rats with collagen-induced arthritis. However, it is unclear about the effects of ursolic acid on proliferation and differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells and expression of Wnt/β-catenin signaling pathway-related genes and proteins.
OBJECTIVE: To investigate the effects of ursolic acid on proliferation, differentiation and Wnt signaling pathway of bone marrow mesenchymal stem cells.
METHODS: Rat bone marrow mesenchymal stem cells were cultured in vitro by whole bone marrow adherence method, and then different concentrations of ursolic acid (1.0, 2.5, 5.0, 10.0, 20.0 μmol/L) acted on the cells. Cells with no treatment of ursolic acid were used as control group. MTT assay was used to detect the effect of ursolic acid on the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells. Differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells was induced by osteogenic induction solution containing different concentrations of ursolic acid (1.0, 2.5, 5.0 μmol/L). Cells cultured in the osteogenic induction medium with no ursolic acid. Alkaline phosphatase activity and osteocalcin level were detected by ELISA at 7 and 14 days. RT-PCR was used to detect the mRNA levels of ALP, COL-I, OCN, OPN and RUNX2. The expressions of Wnt-3α, GSK-3β and β-catenin mRNAs and proteins related to Wnt signaling pathway were detected by RT-PCR and western blot, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Different concentrations of ursolic acid could promote the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells, and the proliferative rate was highest when the cells were treated with 5.0 μmol/L ursolic acid. (2) Compared with the control group, the alkaline phosphatase activity and osteocalcin level were significantly higher at 7 and 14 days after osteoinduction (P < 0.05), and the alkaline phosphatase activity and osteocalcin level increased with the increasing concentration of ursolic acid. (3) At 14 days after osteoinduction, ursolic acid promoted the expression of osteogenic genes ALP, COL-I, OCN, OPN, RUNX2 mRNAs and Wnt signaling pathway-related Wnt-3α, GSK-3β and β-catenin mRNAs and proteins and the expression levels increased with the increasing concentration of ursolic acid (P < 0.05). To conclude, ursolic acid can promote the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into osteoblasts via Wnt/β-catenin signaling pathway.

Key words: ursolic acid, bone marrow mesenchymal stem cells, cell proliferation, osteogenic differentiation, alkaline phosphatase, osteocalcin, osteogenic gene, Wnt signaling pathway

中图分类号:

刘耀辉，黄振明，何精选，黄玲华，李建平. 熊果酸干预骨髓间充质干细胞增殖与成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(17): 2665-2671.

Liu Yaohui, Huang Zhenming, He Jingxuan, Huang Linghua, Li Jianping. Effects of ursolic acid on proliferation and differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(17): 2665-2671.

图/表（结果） 3

2.1 骨髓间充质干细胞形态及鉴定结果 如图1所示，接种后3 h，细胞即贴壁，细胞为圆形单核细胞；3 d后细胞伸出伪足，多数细胞为梭形，有少量细胞呈多角形，胞体有多个突起；7 d后细胞呈长梭形，集落生长，并相互融合成单细胞层。免疫荧光染色显示CD29、CD44、CD105为阳性，CD34和CD45为阴性。

2.2 熊果酸对骨髓间充质干细胞增殖的影响 不同浓度熊果酸与对照组相比均有促进骨髓间充质干细胞增殖的作用。熊果酸浓度≤5.0 μmol/L时，随熊果酸浓度的增加，细胞增殖作用增强；熊果酸浓度> 5.0 μmol/L时，随熊果酸浓度的增加，细胞增殖作用降低。当熊果酸浓度为 5.0 μmol/L时骨髓间充质干细胞促增殖作用最强。因此，选择熊果酸浓度≤5.0 μmol/L用于后续实验，见图2。

2.3 熊果酸对骨髓间充质干细胞成骨诱导分化后碱性磷酸酶活性的影响 与对照组相比，骨髓间充质干细胞成骨诱导后第7天和14天，不同浓度的熊果酸作用后碱性磷酸酶活性均增强，差异有显著性意义(P < 0.05)。第7天和第14天的碱性磷酸酶活性均随熊果酸浓度的增加而增强，不同浓度组间两两比较差异有显著性意义(P < 0.05)。相同浓度熊果酸作用后，第14天时碱性磷酸酶活性强于第7天(P < 0.05)，见表2。

2.4 熊果酸对骨髓间充质干细胞成骨诱导分化后骨钙素水平的影响 与对照组相比，骨髓间充质干细胞成骨诱导后第7天和14天，不同浓度熊果酸作用后骨钙素水平均升高，差异有显著性意义(P < 0.05)。第7天和第14天的骨钙素水平均随熊果酸浓度的增加而升高，不同浓度组间两两比较差异有显著性意义(P < 0.05)。相同浓度熊果酸作用后，第14天时骨钙素水平高于第7天(P < 0.05)，见表3。

2.5 熊果酸对骨髓间充质干细胞成骨基因表达水平的影响 连续诱导14 d后，在熊果酸作用下，成骨基因ALP、COL-I、OCN、OPN、RUNX2 mRNA表达水平均比对照组升高，差异有显著性意义(P < 0.05)。成骨基因ALP、COL-I、OCN、OPN、RUNX2 mRNA表达水平均随熊果酸浓度增加而增加，不同浓度组间两两比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见表4。

2.6 熊果酸对Wnt信号通路Wnt-3α、GSK-3β、β-catenin mRNA和蛋白表达的影响 连续诱导14 d后，在熊果酸作用下，Wnt-3α、GSK-3β、β-catenin mRNA和蛋白表达均较对照组升高，差异有显著性意义(P < 0.05)。Wnt-3α、GSK-3β、β-catenin mRNA和蛋白均随熊果酸浓度的增加而增加，不同浓度组间两两比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见表5和图3。

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引言

股骨头坏死是股骨头血供发生中断或受损，进而引起骨细胞及骨髓成分相继死亡，导致股骨头结构改变、股骨头塌陷、关节功能障碍的一种疾病。股骨头坏死诱因较多，其中激素性股骨头坏死最为常见^[1]。目前，早期治疗激素性股骨头坏死的方法主要有手术治疗(例如髓芯减压联合骨移植)和非手术治疗(例如淫羊藿中药治疗)等^[2]，这些方法虽能不同程度缓解疾病发展进程，但不能达到逆转并治愈早期激素性股骨头坏死的目的^[3]。骨髓间充质干细胞因其具有良好的多向分化潜能和增殖能力，是激素性股骨头坏死早期治疗的新方向^[4]。Wnt信号通路包括Wnt/β-catenin、Wnt/Ca²⁺、Wnt/PCP等，参与调控生命体生长、发育、衰老和死亡等生命过程，是细胞增殖分化、胚胎和器官发育的关键调控环节和信号转导途径之一^[5-6]。研究发现，Wnt信号通路在骨髓间充质干细胞增殖分化^[7]、成骨细胞生成、骨形成、骨重建等方面发挥重要作用^[8]，是目前骨骼系统相关疾病发病机制和骨代谢研究的新热点^[9]。

熊果酸是一种五环三萜类化合物，广泛存在于枣、枇杷叶、夏枯草等天然植物中^[10-12]，其毒性低，不良反应少，具有抗氧化、降血糖、抗肿瘤等活性功能^[13-15]。研究发现，适宜浓度的熊果酸可通过Wnt信号通路抑制破骨细胞增殖分化^[16]，对胶原诱导性关节炎模型大鼠有抗炎和骨保护作用^[17]，促进骨形成和逆转骨矿物质损失，具有抗骨质疏松作用^[18]。该研究观察熊果酸对大鼠骨髓间充质干细胞增殖、分化以及Wnt/β-catenin信号通路相关基因和蛋白表达的影响，为将来临床治疗激素性股骨头坏死提供一定的实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 体外细胞分子生物学实验。

1.2 时间及地点 实验于2014年9月至2016年2月在武汉市第九医院实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 30只雄性SD大鼠，6-8周龄，体质量150-200 g，购于北京华阜康公司，动物合格证号：SCXK(京)2014-004。

1.3.2 实验药材 熊果酸购自上海广锐生物科技有限公司，货号标准品985，纯度≥98%。

1.3.3 实验试剂 低糖DMEM和胎牛血清(Hyclone公司)；地塞米松、β-甘油磷酸、抗坏血酸、MTT(美国Sigma公司)；CD29、CD44、CD105、CD34和CD45单克隆抗体(英国Abcam公司)；DAPI(上海碧云天生物技术有限公司)；兔抗Wnt-3α抗体(北京博奥森生物技术有限公司)；兔抗GSK-3β抗体(美国Cell Signaling公司)；兔抗β-catenin抗体(美国Epitomics公司)；碱性磷酸酶和骨钙素试剂盒(南京建成生物工程研究所)；辣根过氧化物酶标记的山羊抗体IgG(中国碧云天公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 熊果酸配置 熊果酸用二甲基亚砜溶解，配置成0.1 mol/L的浓缩液，分装后-20 ℃冻存。使用前用完全培养基(含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM)稀释调整所需浓度。

1.4.2 大鼠骨髓间充质干细胞分离、培养及鉴定 参照文献[19]方法分离大鼠骨髓间充质干细胞。大鼠颈椎脱臼处死，乙醇棉球擦拭全身皮肤，在无菌条件下快速分离股骨及胫骨，切除两端骨骺，注射器抽取含青链霉素的低糖DMEM培养基反复冲洗骨髓腔，将冲出的骨髓组织液经200目不锈钢细胞筛过滤，转移至离心管离心(1 000 r/min，5 min)，弃上清，加入完全培养基，吹打均匀，细胞悬液置于25 cm²细胞培养瓶中培养，24 h后全量换液，显微镜下观察细胞贴壁情况及形态学变化，之后每隔3 d换液1次，待细胞长至80%-90%时传代。参照文献[20]，免疫荧光染色观察骨髓间充质干细胞表面抗原标记CD29、CD44、CD105、CD34、CD45的表达。取第3代骨髓间充质干细胞，胰酶消化后，放入体积分数为10%甲醛中固定15 min，PBS(pH=7.4)洗涤，加入0.1% Triton X-100孵育10 min，PBS洗涤，加入5%BSA封闭2 h，加入CD29、CD44、CD105、CD34和CD45单克隆抗体4 ℃过夜，PBS洗涤3次，加入二抗山羊抗体(IgG)孵育2 h，PBS洗涤3次，用0.5 mg/L DAPI核染色，荧光显微镜观察。

1.4.3 熊果酸对骨髓间充质干细胞增殖的影响 取对数生长期的第3代骨髓间充质干细胞，胰酶消化后制成单细胞悬液，以细胞浓度4×10⁷ L^-1接种于无菌96孔细胞培养板中，每孔100 μL，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂细胞培养箱中培养，待细胞贴壁后，吸弃上清液，实验组分别加入含1.0，2.5，5.0，10.0，20.0 μmol/L熊果酸的完全培养基，对照组加入等量完全培养基(含有二甲基亚砜)，每组设6个复孔，于培养箱中继续培养，分别在第1，3，5，7天相同时间点各取1板，每孔加20 μL MTT(5 g/L)，培养箱中孵育4 h，弃上清液，每孔加入150 μL二甲基亚砜，混合均匀，于酶标仪490 nm波长处检测吸光度值。

1.4.4 碱性磷酸酶试剂盒检测碱性磷酸酶活性 取对数生长期的第3代骨髓间充质干细胞，胰酶消化后制成单细胞悬液，以细胞浓度2×10⁷ L^-1接种于无菌24孔细胞培养板中，每孔1.5 mL，于37 ℃、体积分数为5%CO₂细胞培养箱中培养，待细胞贴壁后，吸弃上清液，对照组加入成骨诱导液(含1×10^-8 mol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 g/L抗坏血酸的完全培养基)，实验组加入等体积含1.0，2.5，5.0 μmol/L熊果酸的成骨诱导液，于培养箱中继续培养，每3 d换液1次，分别在第7天和第14天取板，按照碱性磷酸酶试剂盒严格操作，计算碱性磷酸酶活性。

1.4.5 ELISA法检测骨钙素水平 细胞培养及实验分组同1.4.4。在给药第7，14天取细胞培养上清液，离心(2 000 r/min，15 min)，取上清，采用酶联免疫吸附法严格按照骨钙素试剂盒说明检测细胞培养上清中骨钙素水平。

1.4.6 RT-PCR检测成骨相关基因表达水平 细胞培养及实验分组同1.4.4。连续诱导14 d后，严格按照Trizol试剂盒说明书提取总RNA，微量核酸仪检测RNA浓度。利用PrimerScript反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA。按照荧光定量试剂盒说明操作，置于定量PCR仪检测。反应条件为：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，共进行45个循环，72 ℃延伸10 min。以GAPDH作为内参，采用2^-ΔΔCt法计算mRNA的相对表达水平。成骨基因引物序列见表1。

1.4.7 RT-PCR检测Wnt信号通路Wnt-3α、GSK-3β和β-catenin mRNA表达 细胞分组和培养同1.4.4。RT-PCR检测方法同1.4.6。引物序列见表1。以GAPDH作为内参，采用2^-ΔΔCt法计算mRNA的相对表达水平。

1.4.8 Western blot法检测Wnt信号通路Wnt-3α、GSK-3β和β-catenin蛋白表达 细胞分组和培养同1.4.4。连续诱导14 d后，PBS冲洗细胞，加入预冷的蛋白裂解液充分裂解，裂解后离心(4 ℃、12 000 r/min、10 min)，取上清液，测定蛋白浓度。标准化后，按4倍体积蛋白提取液加1倍体积5×SDS蛋白Loading buffer(4∶1)混匀，95 ℃加热5 min，降至室温离心(4 ℃、12 000 r/min、10 min)，取上清备用。以每泳道30 μg在SDS-丙烯酰胺凝胶电泳槽中电泳，分离后将蛋白质电转移至硝酸纤维素膜上，转膜后5%脱脂牛奶室温封闭2 h，分别加入Wnt-3α、GSK-3β和β-catenin抗体(稀释度分别为1∶500，1∶1 000，1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，PBS冲洗，加入碱性磷酸酶标记的山羊抗兔IgG抗体，室温孵育2 h，PBS冲洗，用CIP/NBT碱性磷酸酯酶显色。用SensiAnsys凝胶系统分析各蛋白条带灰度值，以β-actin为内参，各蛋白条带与β-actin灰度值的比值表示蛋白表达水平。

1.5 主要观察指标 ①熊果酸对骨髓间充质干细胞增殖的影响；②熊果酸对骨髓间充质干细胞成骨诱导分化后碱性磷酸酶活性的影响；③熊果酸对骨髓间充质干细胞成骨诱导分化后骨钙素水平的影响；④熊果酸对骨髓间充质干细胞成骨基因表达水平的影响；⑤熊果酸对Wnt信号通路Wnt-3α、GSK-3β、β-catenin mRNA和蛋白表达的影响。

1.6 统计学分析 采用SPSS 22.0统计学软件进行分析，符合正态分布计量资料以x(_)±s表示，多组间比较采用单因素方差(One-way ANOVA)分析法，组内比较采用SNK-q法，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

近年来，由于激素的广泛使用，其并发症也被不断暴露出来。激素性股骨头坏死是近年被公认的激素并发症之一，发病率目前已超过创伤所致的股骨头坏死^[21]。由于激素长期在体内蓄积，造成血液的黏稠度增加、血脂增高，骨微细血管阻塞、缺血等^[22]，进而导致骨质合成减少，钙吸收障碍，骨质疏松及微细骨折的积累，最后出现激素性股骨头坏死^[23]。骨髓间充质干细胞源于骨髓，自我更新能力较强，并且能够多向分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞等^[24]。通过促进骨髓间充质干细胞的成骨分化，可增加骨形成及骨强度^[25-26]。利用骨髓间充质干细胞治疗骨疾病引起了研究者们极大的关注，骨髓间充质干细胞在骨组织工程中也表现出了巨大的应用前景。

碱性磷酸酶参与成骨细胞的分化，其高表达是成骨细胞分化的早期标志物^[27]。碱性磷酸酶能将有机酸酯水解为游离的磷酸根，并且可通过破坏钙化抑制剂启动钙化的发生^[28]。碱性磷酸酶活性代表成骨细胞的分化程度^[29]。实验结果显示，在诱导后的第7天和第14天，熊果酸组细胞碱性磷酸酶活性均比对照组显著增加。RT-PCR检测结果显示，在熊果酸的作用下，成骨基因ALP、COL-I、OCN、OPN、RUNX2 mRNA表达也均增加。骨钙素是由成熟成骨细胞分泌的一种多肽，可抑制生长软骨矿化的速度，促进骨组织矿物质沉积的正常钙化，是反映成骨细胞活性的敏感指标^[30]，其含量高低与成骨细胞的分化程度密切相关^[31-33]。实验结果显示，在第14天时，骨钙素含量较对照组显著增加，且与熊果酸浓度呈梯度依赖关系。以上这些结果均提示熊果酸能促进骨髓间充质干细胞向成骨分化。

成骨分化在骨形成和骨重建中发挥重要作用，其受多种因子和激素的调节，这些因子或激素能够通过特定的信号通路将信号传递至转录效应器，调控成骨细胞不同分化阶段特异基因的表达^[34]，从而使成骨细胞处于不同的分化阶段^[35-38]。Wnt/β-catenin信号通路在调控骨髓间充质干细胞成骨分化过程中发挥重要作用^[39]，其机制为Wnt蛋白与Frizzled受体及LRP5/6结合后通过激活细胞内散落蛋白(DSH)来激活GSK-3β结合蛋白，而GSK-3β结合蛋白可抑制β-catenin磷酸化，进而抑制β-catenin降解，使得细胞胞质中β-catenin能够稳定存在并不断积累进入细胞核，从而参与调节靶基因的转录和表达^[39-41]。因此，Wnt、GSK-3β和β-catenin是Wnt/β-catenin信号通路的重要节点。实验结果显示，不同浓度熊果酸处理骨髓间充质干细胞后，Wnt-3α、GSK-3β和β-catenin mRNA的表达均较对照组显著增加，且Wnt-3α、GSK-3β和β-catenin蛋白表达也增加，提示熊果酸可通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进骨髓间充质干细胞成骨分化。

综上所述，Wnt/β-catenin信号通路激活可能是熊果酸促进骨髓间充质干细胞分化的重要作用机制，其具体的分子机制还有待进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

熊果酸干预骨髓间充质干细胞增殖与成骨分化

Effects of ursolic acid on proliferation and differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells

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