不同体积分数富血小板血浆对血管内皮细胞增殖和迁移的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0331

摘要/Abstract

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文题释义：
富血小板血浆：是全血经梯度离心后得到的血小板浓缩物，其中血小板的含量是全血的3-5倍，并且在梯度离心过程中保留了大量生长因子、趋化因子及蛋白质。通过血小板的黏附、凝集将浓缩物中的生长因子从血小板颗粒中释放出来，这些生长因子可以促进多种细胞增殖分化、基质合成等作用。已经有文献报道其在促进血管内皮细胞增殖过程中发挥重要的作用，并且已经应用于骨缺损、软组织损伤修复、创面愈合及感染治疗等相关领域的研究和治疗中。
血管内皮细胞：是血管的重要组成部分，其不但参与构成血管的通透性屏障、调节生物大分子物质的选择性通透，还对凝血与抗凝功能、炎症反应的发生发展进行调控。已经有研究表明血小板血浆包含的多种细胞生物因子能够促进血管内皮细胞的增殖和迁移，在血管形成的生理过程中促进血管生成因子与内皮细胞受体结合，进一步激活内皮细胞相关的信号通路，诱导内皮细胞小管形成及新生血管基质合成。在骨组织修复过程中血管生成对成骨细胞及破骨细胞的生理机制也能产生重要的影响。

摘要
背景：富血小板血浆富含多种促进血管形成的重要因子，不同体积分数的富血小板血浆均能促进血管内皮细胞增殖、分化及迁移，但是何种体积分数最为显著，目前还没有形成统一的认识。
目的：观察不同体积分数富血小板血浆对血管内皮细胞增殖活性及迁移能力的影响。
方法：采用酶消化法分离SD大鼠心脏微血管内皮细胞，分别用含体积分数为10%，20%，50%富血小板血浆的DMEM培养液进行培养。倒置显微镜下观察细胞形态，MTT比色法检测血管内皮细胞增殖情况，细胞划痕实验观察血管内皮细胞的迁移能力，最终筛选出最佳富血小板血浆体积分数。
结果与结论：①加入富血小板血浆干预后内皮细胞形态规则，生长旺盛，随培养时间延长大部分细胞变成多角形，细胞较大；②不同体积分数的富血小板血浆均对血管内皮细胞增殖具有促进作用，其中以培养 72 h体积分数为20%富血小板血浆组对细胞的增殖促进作用最为明显；③体积分数为20%，50%富血小板血浆明显促进细胞迁移，其中体积分数为20%富血小板血浆组细胞相对迁移距离最高；④结果表明，富血小板血浆可促进体外培养的血管内皮细胞增殖和迁移，且体积分数为20%富血小板血浆的作用效果最佳。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-3538-4070(张明宇)

关键词: 富血小板血浆, 血管内皮细胞, 细胞增殖, 细胞迁移, 陕西省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Platelet-rich plasma (PRP) plays an important role in promoting angiogenesis of vascular endothelial cells. Different volume fractions of PRP have definite influence on vascular endothelial cells, but it is not clear PRP at which volume fraction is optimal.
OBJECTIVE: To investigate the effect of PRP at different volume fractions on the proliferation and migration of vascular endothelial cells in vitro.
METHODS: Hearts of Sprague-Dawley rats were mechanicaIly minced and enzymatically digested with collagenase. Vascular endothelial cells were counted and cultured in the DMEM culture medium containing various volume fractions of autologous PRP (10%, 20%, 50%) respectively. The cell morphology was observed under an inverted microscope, and cellular proliferation was detected by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide assay. Afterwards, scratch test was utilized to detect the cell migration ability and the optimal volume fraction was determined.
RESULTS AND CONCLUSION: After addition of PRP, the well-grown endothelial cells presented with regular shape, changed into polygon-like and became large with time. Different volume fractions of PRP in particular 20% PRP cultured for 72 hours could promote cell proliferation. According to scratch test, 20% and 50% PRP significantly promoted the cell migration, especially 20% PRP. These results indicate that PRP can promote the proliferation and migration of vascular endothelial cells in vitro, and 20% is the optimal volume fraction.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Endothelial Cells, Platelet-Rich Plasma, Cell Proliferation, Cell Movement, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

张明宇，任博，杨镇，张宪，郑江. 不同体积分数富血小板血浆对血管内皮细胞增殖和迁移的影响[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(28): 4469-4474.

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图/表（结果） 2

2.1 全血及富血小板血浆中血小板计数、转化生长因子β1及血管内皮生长因子水平见表1。血小板在全血中的计数为(397.2±41.6)×10⁹ L^-1；在富血小板血浆中的计数为 (1 757.6±118.4)×10⁹ L^-1，约为全血的(4.42±0.33)倍。

2.2 细胞形态学观察结果倒置相差显微镜观察，原代血管内皮细胞呈球形或椭圆形，折光性较强，接种24 h后细胞开始贴壁，呈不规则排列，最初细胞形态呈短梭形或三角形(图1A)，随着培养时间延长，细胞开始分裂增殖、迁移并逐渐呈规律性、方向性排列(图1B)；培养5 d后细胞可长满培养瓶底面积80%-90%。此时细胞形成紧密排列的铺路卵石样结构(图1C)。传代后细胞形态和原代相似，随着传代次数增多细胞生长速度较原代明显增快。

2.3 血管内皮细胞鉴定结果第3代血管内皮细胞进行血管Ⅷ因子免疫细胞化学染色。细胞浆呈棕黄色沉淀，其中在胞核周围更为明显，细胞核不显色，细胞的边界清晰(图2)。随机选择3张细胞爬片，在每张片子中任意选择3个视野进行计数，Ⅷ因子染色细胞的阳性百分率为(95.23±3.72)%，提示血管内皮细胞纯度较高。

2.4 MTT法测定各组吸光度值各组加入富血小板血浆干预后细胞形态规则，生长旺盛，随培养时间延长大部分细胞变成多角形，细胞较大。随着富血小板血浆体积分数梯度升高，镜下观察到细胞生长旺盛、密集，并且胞体丰满；与对照组相比细胞增殖明显增快，胞浆颗粒较少，细胞间连接紧凑。不同体积分数的富血小板血浆均对血管内皮细胞增殖具有促进作用(表2)。培养48 h后，体积分数为20%和50%富血小板血浆组中吸光度值高于空白对照组 (P < 0.05)，表明富血小板血浆可明显促进血管内皮细胞增殖，其中以培养72 h体积分数为20%富血小板血浆组对细胞的增殖促进作用最为明显(图3)。

2.5 划痕实验结果各组划痕愈合的相对距离比较结果见表3。体积分数为10%富血小板血浆组与空白对照组比较差异不明显。当体积分数为20%富血小板血浆和体积分数为50%富血小板血浆作用时，细胞相对迁移距离较空白对照组增强(图4)，统计结果显示体积分数为20%富血小板血浆组细胞相对迁移距离最远(74.23±3.78)%，与空白对照组比较差异有显著性意义。

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引言

材料方法

1.1 设计体外细胞学对比观察实验。

1.2 时间及地点实验于2017年1至8月在西安交通大学附属红会医院转化医学中心完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 8只新生1 d的SD仔鼠用于分离血管内皮细胞；10只12周龄SD大鼠用于制备自体富血小板血浆，体质量约400 g，雌雄不限，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。

1.3.2 实验试剂和仪器 DMEM培养基和胎牛血清(Gibco公司)；胰酶、MTT、二甲基亚砜、Ⅱ型胶原酶(Sigma公司)；Ⅷ因子相关抗原单克隆抗体(Sigma公司)；EIX808酶标仪(BioTek公司)；倒置相差显微镜(日本Olympus公司)；ELISA生长因子检测试剂盒(美国R&D公司)。

1.4 实验方法

1.4 .1 分离、培养血管内皮细胞将新生1 d的SD仔鼠以体积分数为75%乙醇浸泡消毒5 min后，在无菌条件下取出心脏，PBS冲洗后将其切碎，再用0.25%胰蛋白酶与等体积0.1%Ⅱ型胶原酶消化30 min，加入胎牛血清终止消化。收集消化液过200目筛网，将过滤后的细胞悬液以 1 000 r/min的速度离心5 min。调整细胞浓度为1× 10⁷ L^-1-1×10⁸ L^-1，接种到2%明胶包被的培养瓶中，加入含有体积分数为20%胎牛血清的DMEM培养液，置于细胞培养箱中培养，2 d后观察细胞形态，之后每隔3 d或4 d更换1次细胞培养液，直至细胞爬满培养瓶底部。第3代细胞供以下实验使用。

1.4.2 血管内皮细胞鉴定在12孔培养板内放置无菌盖玻片，每孔种植1 mL(1×10⁵个细胞)细胞悬液，待细胞贴壁后，取出盖玻片，室温下40 g/L多聚甲醛固定10 min，进行血管Ⅷ因子免疫细胞化学染色。在倒置相差显微镜下观察细胞的生长情况及其形态学变化，并拍照记录。

1.4.3 富血小板血浆制备及成分分析选用10只12周龄SD大鼠，给予2.5%戊巴比妥钠(40-45 mg/kg)腹腔注射麻醉。富血小板血浆制备过程严格无菌操作，用含有1 mL ACD-A抗凝剂的10 mL注射器采集腹主动脉血液6 mL，其中1 mL进行血液计数，其余5 mL根据文献方法分离富血小板血浆^[14-15]。将血液放置于无菌试管中进行离心(200×g，10 min)，试管中的血液因成分的不同而出现分层，共有3层，分离出沉降于下部的红细胞，将试管内保留的上清液和交界面下3 mm的成分吸至另外一个无菌试管中，同样以上述方法进行离心。在第2次离心结束后，液体出现了2层结构，将上层液体抽弃3/4，剩余液体便是富血小板血浆，约为1.0 mL。

富血小板血浆的成分分析：取0.2 mL放于采血针下进行血细胞分析检测，分析全血及富血小板血浆中的血小板含量。采用酶联免疫吸附法分别测定大鼠全血、富血小板血浆中转化生长因子β1和血管内皮生长因子水平。使用酶标仪在吸光度450 nm条件下测量吸光度值，每个标本测量5份，根据浓度和吸光度值呈正相关的标准曲线计算出样本内2种生长因子水平。

1.4.4 实验分组及细胞形态学观察取分离培养的第3代血管内皮细胞，以1×10⁹ L^-1细胞浓度接种于培养瓶中，待细胞贴壁之后去除原有培养基，用不含血清的DMEM培养液冲洗3次，更换为下列4种不同培养液：①对照组：不含血清的DMEM培养液；②不含血清的DMEM培养液+体积分数为10%富血小板血浆(9︰1)；③不含血清的DMEM培养液+体积分数为20%富血小板血浆(4︰1)；④不含血清的DMEM培养液+体积分数为50%富血小板血浆(1︰1)。每组各设6个孔，以后每1 d或2 d换液1次。倒置相差显微镜观察原代、传代及富血小板血浆干预后的血管内皮细胞形态学变化。

1.4.5 MTT比色实验检测血管内皮细胞增殖情况将细胞浓度为1×10⁷ L^-1的血管内皮细胞接种于96孔培养板，加入含有体积分数为20%胎牛血清的DMEM培养液，放置于37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中孵育，待细胞贴壁后，分别加入含有体积分数为10%，20%，50%富血小板血浆的完全培养液培养24，48，72 h，设置空白对照组不加入任何因子刺激培养细胞，在每个时间点每孔加入20 μL MTT(5 g/L)，继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，再加入150 μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡 10 min，使结晶物充分溶解。酶标仪上于490 nm波长处测量各孔的吸光度值。

1.4.6 划痕法测定不同体积分数富血小板血浆对血管内皮细胞迁移能力的影响取对数生长期的血管内皮细胞，加入胰酶消化，制备单细胞悬液，以1×10⁵/孔的密度接种于24孔板。实验分为空白对照组、体积分数为10%富血小板血浆组、体积分数为20%富血小板血浆组、体积分数为50%富血小板血浆组。待细胞贴壁后，空白对照组更换新鲜完全培养液，其余分别加入含不同体积分数富血小板血浆的完全培养液。当细胞生长到约80%融合为单层时，用20 μL微量加样吸头在板孔中轴划一道划痕，然后继续培养24 h后显微镜拍照，用Adobe Photoshop CS1图形软件测量划痕距离，每孔随机取3个位点，其相对迁移距离=(24 h距离/0 h初始距离)×100%，根据划痕部位细胞愈合的相对距离判断细胞的生长运动能力，其比例越高说明细胞迁移能力越强。

1.5 主要观察指标 ①全血及富血小板血浆中血小板计数、转化生长因子β1及血管内皮生长因子水平；②血管内皮细胞形态及鉴定结果；③MTT比色法检测血管内皮细胞增殖情况；④细胞划痕实验观察血管内皮细胞的迁移能力。

1.6 统计学分析使用SPSS 19.0软件行数据分析，计量资料采用x(_)±s表示，两组比较采用t 检验，多组间比较使用方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

血管内皮细胞由一层扁平细胞所组成，呈多边形，细胞的边缘呈锯齿状，相互嵌合。血管内皮细胞以单层细胞形式覆盖全身各血管内层^[16-18]。研究显示，新生组织的生存和重建主要依靠血液的供应，血管为新生的组织细胞提供代谢的环境和条件，而内皮细胞增殖是血管再生的关键环节^[19-21]。由于细胞间保持着接触性抑制的特性，成年人血管中的血管内皮细胞常常处于细胞周期的静止期。当条件和环境发生变化时，血管内皮细胞由静止期转化为分裂期，细胞分裂增殖形成新血管^[22-24]。

研究表明，富血小板血浆中富含大量生长因子，其中血管内皮生长因子对血管内皮细胞的增殖具有一定的促进作用^[25-27]。种子细胞是实现组织工程构建的最基本功能单位，研究显示血管内皮细胞可促进组织工程组织生长，其为组织工程重要的种子细胞^[28-29]。目前体外培养血管内皮细胞，主要有大动脉血管内皮细胞培养和微动脉血管内皮细胞培养两种方法^[30-31]。来源于动物的大动脉比较短而细，操作上困难，培养的血管内皮细胞数量极其有限，难以在短时间获得足够的细胞数量应用于再血管化实验。而来源于微血管的内皮细胞却弥补了这一不足。实验采用胶原酶和胰蛋白酶复合消化新生SD仔鼠心脏以获得血管内皮细胞，通过细胞形态学观察和Ⅷ因子相关抗原免疫组化显示所获得血管内皮细胞纯度较高。

细胞因子对种子细胞具有明显促进生长的作用^[32-33]，是体外成功培育血管内皮细胞的关键。血管内皮生长因子可促进内皮细胞迁移、增殖，进而促进新生血管的形成^[34-36]。有学者报道，多种生长因子联合应用能达到促进细胞增殖及迁移的目的^[37-38]。富血小板血浆中血小板含量丰富，当血小板激活时，能释放多种生长因子，如转化生长因子β、成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、血小板源性生长因子及胰岛素样生长因子，不仅能促进细胞增殖、分化，而且在修复组织损伤中起着重要的作用^[13]。何种体积分数的富血小板血浆对血管内皮细胞增殖的影响最为显著，目前还没有形成统一的认识。

实验用含体积分数为10%，20%和50%富血小板血浆的培养液作用于体外培养的血管内皮细胞，与空白对照组比较，血管内皮细胞生长状态良好，3种体积分数的富血小板血浆均能够促进细胞增殖，富血小板血浆与血管内皮细胞的增殖活性具有剂量-效应的关系。血管内皮细胞划痕实验显示，体积分数为20%富血小板血浆促进血管内皮细胞迁移效果优于其他3组，这可能是因为内皮细胞的迁移增殖乃至最终脉络膜新生血管的形成是与包括血管内皮生长因子在内的一系因子、内皮细胞、细胞基质等成分共同作用的结果。实验结果显示体积分数为20%富血小板血浆促进血管内皮细胞增殖和迁移效果最好。

综上所述，富血小板血浆对血管内皮细胞具有明显促进增殖的作用，在血管化组织工程中将富血小板血浆应用于血管内皮细胞的培养，可促进新生组织的生长。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程