矿化明胶静电纺丝诱导牙周组织成骨的有效性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.47.007

摘要/Abstract

摘要：

背景：当前国内外关于矿化明胶电纺丝纤维对牙周组织成骨诱导有效性的文献较少。
目的：观察矿化明胶静电纺丝对牙周膜成纤维细胞增殖及向成骨方面分化的影响。
方法：将人牙周膜成纤维细胞分别与未矿化明胶静电纺丝、纳米羟基磷灰石矿化1 d的明胶静电纺丝、纳米羟基磷灰石矿化5 d的明胶静电纺丝复合培养，采用MTT法检测培养1，4，7，10，13 d的细胞增殖；应用生化仪检测培养1，7，14 d的细胞碱性磷酸酶活性。
结果与结论：培养10 d时，矿化明胶静电纺丝膜组表面的牙周膜细胞分布均匀，生长良好，铺展成片状并分泌大量细胞外基质，细胞与材料结合紧密，且以矿化5 d组效果更明显，细胞生长密度和状态优于未矿化明胶静电纺丝膜组。不同时间点的细胞增殖活性与碱性磷酸酶活性：矿化5 d明胶静电纺丝膜组>矿化1 d明胶静电纺丝膜组>未矿化明胶静电纺丝膜组(P均< 0.05)。表明经纳米羟基磷灰石矿化的明胶静电纺丝，可促进牙周膜成纤维细胞增殖及向成骨方向分化，且矿化时间越长效果越明显。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 口腔生物材料, 矿化明胶静电纺丝, 牙周组织, 牙周膜成纤维细胞, 增殖, 成骨诱导

Abstract:

BACKGROUND: Currently, little is reported regarding the effectiveness of mineralized gelatin electrostatic spinning fibers on periodontal tissue osteogenic induction.

OBJECTIVE: To investigate the effect of mineralized gelatin electrostatic spinning on the proliferation and osteogenic differentiation of periodontal ligament fibroblasts.

METHODS: Human periodontal ligament fibroblasts were respectively compositely cultured with non-mineralized gelatin electrostatic spinning, gelatin electrostatic spinning after 1 day of nano-hydroxyapatite mineralization and gelatin electrostatic spinning after 5 days of nano-hydroxyapatite mineralization. Cell proliferation was determined at 1, 4, 7, 10 and 13 days of culture using MTT assay. Alkaline phosphatase activity of cells was determined at 1, 7, 14 days of culture using biochemical analyzer.

RESULTS AND CONCLUSION: At the 10^th day of culture, the periodontal ligament cells on the surface of membrane distributed uniformly, grew well, spread out as sheetsthe gelatin electrostatic spinning after nano-hydroxyapatite mineralization may promote the proliferation and osteogenic differentiation of periodontal ligament fibroblasts in a time-dependent manner.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程 and secreted a large amount of extracellular matrix, linked closely with the materialsl; moreover, the effect was more obvious at 5 days of mineralization. Cell growth density and status were better than those in the non-mineralized gelatin electrostatic spinning membrane group. Cell proliferation and alkaline phosphatase activities at different time points: 5-day mineralized gelatin electrostatic spinning membrane group > 1-day mineralized gelatin electrostatic spinning membrane group > non-mineralized gelatin electrostatic spinning fibers group (all P < 0.05). These results demonstrate that

Key words: Gelatin, Durapatite, Fibroblasts, Tissue Engineering

郭瑞征，王亚丽. 矿化明胶静电纺丝诱导牙周组织成骨的有效性[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(47): 7583-7588.

Guo Rui-zheng, Wang Ya-li . Effectiveness of mineralized gelatin electrostatic spinning on inducing periodontal tissue osteogenesis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(47): 7583-7588.

图/表（结果） 3

2.1 扫描电镜与激光共聚焦显微镜观察结果

矿化1 d明胶静电纺丝膜组：①扫描电镜：培养7 d时，牙周膜细胞能够在矿化明胶静电纺丝膜材料上贴附、生长和增殖，可通过伸出突起抓住并包绕住纳米纤维，细胞逐渐由球形伸展为扁平，细胞沿纤维方向生长，也有细胞跨越多根纤维生长，细胞突起相接，并可见有部分细胞向纤维间隙的深处迁移、生长，细胞生长状态良好，细胞表面有明显可见的分泌物颗粒形成，见图1A。②激光共聚焦显微镜：培养10 d时，细胞贴附较好，呈圆形，在电纺丝膜上均铺展成梭形，细胞形态和生长状况良好，细胞密度较高，说明电纺纤维膜具有良好的生物相容性，见图1B。

矿化5 d明胶静电纺丝膜组：①扫描电镜：培养7 d时，牙周膜细胞在矿化明胶电纺丝纤维膜表面均匀分布，细胞生长良好，铺展成片状并与材料紧密结合，细胞表面有大量颗粒物沉着，细胞密集处融合并汇集成片，分泌大量细胞外基质沉积在材料表面，细胞形状多为梭形，表明细胞状态良好，且生长密度和状态优于矿化1 d明胶静电纺丝膜组，见图1C。②激光共聚焦显微镜：培养10 d时，细胞的贴附性好，密度高，细胞的形态和生长状况良好，见图1D。

未矿化明胶静电纺丝膜组：①扫描电镜：培养7 d时，明胶静电纺丝纤维膜上有少量牙周膜成纤维细胞生长，细胞贴附效果一般，无明显突起，有少量扁平状细胞，细胞表面无明显可见的分泌物颗粒形成，见图1E。②激光共聚焦显微镜：培养10 d时，少量细胞铺展，细胞密度较差，明显低于两矿化组，见图1F。

2.2 各组细胞增殖活性比较各组组内培养4，7，10，13 d的细胞增殖A值均高于1 d(P < 0.05)，未矿化明胶静电纺丝膜组细胞增殖A值在培养第10天达到最高，第13天显著减小(P < 0.05)；矿化5 d明胶静电纺丝膜组细胞增殖A值在第7天达到最高峰，第10，13天显著减小(P < 0.05)；矿化1 d明胶静电纺丝膜组在第10天达到最高峰，第13天显著减小(P < 0.05)，见表1。

矿化5 d明胶静电纺丝膜组培养不同时间点的细胞增殖A值明显高于矿化1 d明胶静电纺丝膜组、未矿化明胶静电纺丝膜组(P < 0.05)，矿化1 d明胶静电纺丝膜组培养不同时间点的细胞增殖A值明显高于未矿化明胶静电纺丝膜组(P < 0.05)，见表1。

2.3 各组碱性磷酸酶活性比较 3组组内不同时间点间碱性磷酸酶活性两两比较差异均有显著性意义(P < 0.05)；矿化5 d明胶静电纺丝膜组培养不同时间点的碱性磷酸酶活性明显高于矿化 1 d明胶静电纺丝膜组、未矿化明胶静电纺丝膜组(P < 0.05)，矿化1 d明胶静电纺丝膜组培养不同时间点的碱性磷酸酶活性明显高于未矿化明胶静电纺丝膜组(P < 0.05)，见表2。

参考文献

[1] Schwarz F,Ferrari D,Podolsky L,et al.Initial pattern of angiogenesis and bone formation following lateral ridge augmentation using rhPDGF and guided bone regeneration; an immunohistochemical study in dogs. Clin Oral Implants Res.2010;21(1): 90-99.

[2] Asamura S,Mochizuki Y,Yamamoto M,et al.Bone regeneration using a bone morphogenetic protein-2 saturated slow-release gelatin hydrogel sheet,evaluation in a canine orbital floor fracture model.Ann Plast Surg.2010; 64(4):496-502.

[3] Pourebrahim N,Hashemibeni B,Shahnaseri S,et al. A comparison of tissue-engineered bone from adipose-derived stem cell with autogenous bone repair in maxillary alveolar cleft model in dogs.Int J Oral Maxillofac Surg. 2013;42(5): 562-568.

[4] Van Hout WM, Mink van der Molen AB,Breugem CC,et al.Reconstruction of the alveolar cleft: can growth factor-aided tissue engineering replace autologous bone grafting A literature review and systematic review of results obtained with bone morphogenetic protein-2.Clin Oral Investig.2011; 15(3):297-303.

[5] Mourino V,Boccaccini AR.Bone tissue engineering therapeutics: controlled drug delivery in three-dimensional scaffolds.J R Soc Interface.2010;7(43):209-227.

[6] Wang Z,Ho PC.A nanocapsular combinatorial sequential drug delivery system for antiangiogenesis and anticancer activities.Biomaterials.2010;31(27):7115-7123.

[7] Kim S,Kang Y,Krueger CA,et al.Sequential delivery of BMP-2 and IGF-1 using a chitosan gel with gelatin microspheres enhances early osteoblastic differentiation.Acta Biomaterialia. 2012;8(5):1768-1777.

[8] Wang L,Huang Y,Pan K,et al.Osteogenic responses to different concentrations/ratios of BMP-2 and bFGF in bone formation.Ann Biomed Eng.2010;38(1):77-87.

[9] Nie H,Dong Z,Arifin DY,et al.Core/shell microspheres via coaxial electtohydrodynamic atomization for sequential and parallel release of drugs. J Biomed Mater Res A.2010;95(3): 709-716.

[10] 左奕,李玉宝.纳米骨修复生物材料研究进展[J].东南大学学报:医学版, 2011,30(1):82-91.

[11] López-Noriega A,Arcos D,Vallet-Regí M. Functionalizing mesoporous bioglasses for long-term anti-osteoporotic drug delivery.Chem Eur J.2010;16(35):10879-10886.

[12] Wu CT,Zhang YF,Ke XB,et al.Bioactive mesoporous-glass microspheres with controllable protein delivery properties by biomimetic surface modification. J Biomed Mater Res A.2010; 95(2):476-485.

[13] Dai C,Guo H,Lu J,et al.Osteogenic evaluation of calcium/magnesium-doped mesoporous silica scaffold with incorporation of rhBMP-2 by synchrotron radiation-based μCT.Biomaterials. 2011;32(33):8506-8517.

[14] Bi L,Cheng W,Fan H,et al.Reconstruction of goat tibial defects using an injectable tricalcium phosphate /chitosan in combination with autologous platelet-rich plasma. Biomaterials. 2010;31(12):3201-3211.

[15] Qu D,Li J,Li Y,et al.Angiogenesis and osteogenesis enhanced by bFGF ex vivo gene therapy for bone tissue engineering in reconstruction of calvarial defects.J Biomed Mater Res A. 2011; 96(3):543-551.

[16] Zou D,Zhang Z,He J,et al.Repairing critical-sized calvarial defects with BMSCs modified by a constitutively active form of hypoxia-inducible factor-1α and a phosphate cement scaffold. Biomaterials.2011;32(36):9707-9718．

[17] 廖世波,赖琛,张志雄,等.骨修复复合材料及其相关问题的研究进展[J].中国生物医学工程学报,2012,31(5):345-346.

[18] Shin JH,Kim KH,Kim SH,et al.Ex vivo bone morphogenetic protein-2 gene delivery using gingival fibroblasts promotes bone regeneration in rats.J Clin Periodontol. 2010;37(3): 305-311.

[19] Keeney M,van den Beucken JJ,van der Kraan PM,et al.The ability of a collagen/calcium phosphate scaffold to act as its own vector for gene delivery and to promote bone formation via transfection with VEGF(165). Biomaterials. 2010;31(10): 2893-2902.

[20] Zhang K,Qian Y,Wang H,et al.Electrospun silk fibroin-hydroxybutyl chitosan nanofibrous scaffolds to biomimic extracellular matrix.J Biomater Sci Polym Ed. 2011;22(8):1069-1082．

[21] Zhu M,Shi JL,He QJ,et al. An emulsi?cation–solvent evaporation route to mesoporous bioactive glass microspheres for bisphosphonate drug delivery.J Mater Sci.2012;47(5):2256-2263.

[22] Nie H,Fu Y,Wang CH.Paclitaxel and suramin-loaded core/shell microspheres in the treatment of brain tumors.Biomaterials.2010;31(33):8732-8740.

[23] Pountos I,Georgouli T,Henshaw K,et al.The effect of bone morphogenetic protein-2, bone morphogenetic protein-7, parathyroid hormone, and platelet-derived growth factor on the proliferation and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells derived from osteoporotic bone.J Orthop Trauma.2010;24(9):552-556.

[24] Li X,Sun H,Lin N,et al.Regeneration of uterine horns in rats by collagen scaffolds loaded with collagen-binding human basic fibroblast growth factor. Biomaterials.2011;32(32):8172-8181.

[25] Yilgor P,Hasirci N,Hasirci V.Sequential BMP-2/BMP-7 delivery from polyester nanocapsules.J Biomed Mater Res A.2010; 93(2):528-536.

[26] Bongio M,Beucken, Leeuwenbixrgh,et al.Development of bonesubstitute materialsrfrom'biocompatible'to'instructive'.J Mater Chem.2010;20(40):8747-8759.

[27] Chen FM,Zhang M,Wu ZF.Toward delivery of multiple growth factors in tissue engineering. Biomaterials. 2010;31(24): 6279-6308.

[28] Carragee EJ,Hurwitz EL,Weiner BK.A critical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery: emerging safety concerns and lessons leamed.Spine J.2011;11(6):471-491.

[29] Martino MM,Briquez PS,Guc E,et al.Growth factors engineered for super-affinity to the extracelluar matrix enhance tissue healing.Science.2014;343(6173):885-888.

[30] McCall JD,Luoma JE,Anseth KS. Covalently tethered transforming growth factor beta in PEG hydrogels promotes chondrogenic differentiation of encapsulated human mesenchymal stem cells.Drug Deliv Transl Res.2012; 2(5): 305-312.

[31] Sheykhhasan M,Qomi RT,Kalhor N,et al.Evaluation of the ability of natural and synthetic scaffolds in providing an appropriate environment for growth and chondrogenic differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells.Indian J Orthop. 2015;49(5):561-568.

[32] Mabry KM,Lawrence RL,Anseth KS.Dynamic stiffening of poly(ethylene glycol)-based hydrogels to direct valvular interstitial cell phenotype in a three-dimensional environment. Biomaterials.2015;49:47-56.

[33] Sridhar BV,Brock JL,Silver JS,et al.Development of a cellularly degradable PEG hydrogel to promote articular cartilage extracellular matrix deposition.Adv Healthc Mater. 2015;4(5):702-713.

[34] Mhanna R,Öztürk E,Vallmajo-Martin Q,et al.GFOGER- modified MMP-sensitive polyethylene glycol hydrogels induce chondrogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. Tissue Eng Part A. 2014;20(7-8):1165-1174.

[35] McKinnon DD, Brown TE, Kyburz KA, et al.Design and characterization of a synthetically accessible, photodegradable hydrogel for user-directed formation of neural networks.Biomacromolecules. 2014;15(7):2808-2816.

[36] Sridhar BV,Doyle NR,Randolph MA,et al.Covalently tethered TGF-β1 with encapsulated chondrocytes in a PEG hydrogel system enhances extracellular matrix production.J Biomed Mater Res A.2014;102(12):4464-4472.

[37] Wang H,Leinwand LA, Anseth KS.Cardiac valve cells and their microenvironment--insights from in vitro studies.Nat Rev Cardiol. 2014;11(12):715-727.

[38] Lam J,Lu S,Kasper FK,et al.Strategies for controlled delivery of biologics for cartilage repair.Adv Drug Deliv Rev. 2015;84: 123-134.

引言

牙周组织结构复杂，包括牙龈、牙周膜、牙骨质和牙槽骨，在患有牙周炎等感染性疾病时可发生结缔组织基质和细胞的破坏，由此使牙周膜细胞的纤维附着丧失，牙槽骨吸收，最终导致牙齿缺失^[1]。目前，常规的牙周炎治疗尚不能完全修复缺失牙周组织，而组织工程技术的不断研究正在为临床治疗提高新的方向^[2]。一般情况下，完成牙周组织缺失的重建与修复，首先要完成牙周膜、牙骨质、牙槽骨及牙龈的再生，其中种子细胞、诱导因子及支架材料是必不可少的重要因素，在完成体外细胞培养后，就需要借助适合的诱导因子调节细胞的活动和定向分化，并利用生物学支架形成三维空间结构，以促进进一步的诱导^[3-4]。

静电纺丝技术是生物工程制备超细纤维的有效方法，该法制得的超细纤维膜具有孔隙率高、比表面积大等优点，是较为理想的组织工程支架，能为细胞的爬行生长和成骨诱导提供良好环境。因而近年来，采用静电纺丝制备的聚合物纳米纤维已被广泛应用于软骨、骨、血管、皮肤等组织工程研究领域。在骨组织工程中，以电纺膜为有机模板制备有机/无机复合材料，在结构和功能上模拟天然骨，已逐步成为新的研究热点。有研究指出，静电纺丝技术可制备直径在纳米级的超细纤维，这种纳米纤维是骨及许多组织纤维的特征，具有极高的比表面积，有利于细胞的黏附和生长，且当骨髓基质干细胞和静电纺支架复合培养时，在旋转式生物反应器中经诱导可分化为成骨细胞，并能迁移到支架内，产生丰富的细胞外基质胶原。同时，静电纺丝纳米纤维支架还能保持自身的结构稳定性，支撑矿化组织形成。尽管静电纺丝技术有利于成骨细胞的生长，但其作为生物支架仍然缺乏一定的机械性能，尤其是在承载细胞量较大的情况下，其支撑效果有限。由此，有学者提出了针对性的仿生矿化明胶静电纺丝。

仿生矿化是指将生物矿化机制引入材料制备中，在体外模拟机体环境，以少量有机大分子(蛋白质、糖蛋白或多糖)为模板，进行分子操纵，在其表面形成无机矿化物，以有机基质作为构建支持的惰性底物或矿物沉淀的局限空间和成核的表面，调控矿物质的尺度、形态、空间排列、结晶取向和同质多晶类型等，制备出具有独特微细结构特点的复合材料，使材料具有优异的生物学性能。有研究证实，在材料表面制备生物矿化层，能够提高材料的生物相容性和细胞亲和性，而在材料上形成类骨磷灰石层是在材料上直接成骨的先决条件，即通过在材料表面形成生物矿化层如羟基磷灰石层等，能明显改善材料原有的生物学特性。国外有文献报道，联合仿生矿化技术和静电纺丝技术制备出的生物高分子纳米纤维材料，与细胞外基质形态结构相似，具有极大的比表面积和高孔隙率等特点，用于口腔牙周组织缺损治疗，不仅能够阻止上皮结缔组织长入缺损区域，还可促进牙周组织再生，有效满足口腔临床治疗的复杂性，模拟骨再生过程中形成的网状骨，促进新生组织与支架材料的整合，加速新骨生长，缩短愈合时间，实现组织/骨引导再生。当前国内外针对矿化明胶静电纺丝对牙周组织成骨诱导有效性的文献较少，本实验着重研究了矿化与非矿化明胶静电纺丝对牙周膜细胞成骨诱导的影响，以期为牙周组织修复提供有效指导。
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材料方法

1.1 设计体外细胞学观察实验。

1.2 时间及地点于2013年4月至2015年4月在中国人民解放军第二五四医院基础医学院实验室进行。

1.3 材料非矿化明胶静电纺丝膜及经纳米羟基磷灰石矿化1，5 d的明胶静电纺丝膜由解放军第二五四医院提供。DMEM培养液(Hyclone公司)；MTT溶液、二甲基亚砜(Solarbio 公司)；酶联免疫检测仪、碱性磷酸酶试剂盒(美国GE公司)；激光扫描共聚焦显微镜(Leica microsystems，德国)。

10-15岁青少年因正畸而拔除的健康双尖牙，患者及其监护人对实验知情同意。

1.4 实验方法

牙周膜成纤维细胞的分离培养：将获取的牙齿标本立即放入含有100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素的a-MEM培养液中，2 h内无菌条件下刮取根中1/3牙周膜，采用组织块法进行原代培养，培养液为含体积分数10%FBS的a-MEM，置于37 ℃、体积分数5%CO₂、相对湿度为95%的细胞培养箱中培养。待组织块中游离出的细胞密度达到一定程度时进行首次传代。用1︰1的0.25%胰蛋白酶与0.04%EDTA混合液消化3 min；镜下观察细胞回缩变圆、边缘折光度增大时，立刻用含血清的完全培养液终止消化，吹打、收集细胞，1 000 r/min离心3 min，弃去上清，加含体积分数10%FBS的a-MEM培养液重悬后，传代接种到新的培养瓶中，于37 ℃、体积分数5%CO₂饱和湿度条件下培养。待细胞融合达80%时按上述方法进行细胞传代扩增，取4-6代人牙周膜成纤维细胞用于实验。

人牙周膜成纤维细胞的鉴定：将生长状态良好的第4代人牙周膜成纤维细胞，接种于培养板内预置消毒的盖玻片上，用含体积分数10%FBS的a-MEM培养液于37 ℃、体积分数5%CO₂饱和湿度条件下培养48 h；取出盖玻片，预冷PBS(0.01 mol/L，pH 7.2)冲洗、吹干；预冷10%丙酮溶液固定10 min，吹干，瑞氏-姬姆萨染色观察细胞形态；按试剂盒说明进行抗人波形蛋白和抗人角蛋白免疫组织化学染色，显色结果棕褐色着色为阳性，波形蛋白染色阳性证明细胞来源于中胚层，角蛋白染色阴性排除上皮来源细胞。

人牙周膜成纤维细胞与明胶静电纺丝共培养：先将3种明胶静电纺丝纳米纤维膜固定在穿孔后的冻存管上，进行化学交联和冻干处理，置于24孔板内，经⁶⁰Co照射消毒，用200 µL细胞培养液浸泡24 h。取体外培养第4代人牙周膜成纤维细胞，用0.25%胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液，细胞浓度为5×10⁸ L^-¹，分4组培养，其中一组为不含细胞的空白对照，另3组均匀接种于非矿化明胶静电纺丝膜、经纳米羟基磷灰石矿化1 d的明胶静电纺丝膜、经纳米羟基磷灰石矿化5 d的明胶静电纺丝膜上，每个样品上的加入量为200 µL。4 h后待细胞基本贴壁再缓慢补足培养液。

1.5 主要观察指标

细胞增殖活性MTT检测：复合培养1，4，7，10，13 d时，每组取出细胞支架复合物各5孔，1个无细胞空白对照，5个为载有细胞的复孔，移入新的培养板中，每孔加入不含血清的DMEM培养液200 μL及5 g/L MTT溶液20 μL，37 ℃继续孵育4 h，小心吸弃孔内培养液，每孔加入150 μL二甲基亚砜，微型振荡器上振荡10 min，使结晶物充分溶解，采用酶联免疫检测仪测量各孔在570 nm的吸光度值^[5-6]。

扫描电镜观察：培养7 d时，对静电纺丝膜材料上的牙周膜成纤维细胞进行扫描电镜观察。

激光共聚焦显微镜观察：培养第1，5，10天，应用激光扫描共聚焦显微镜观察细胞生物材料复合物并记录图像，观察细胞在材料上的增殖情况。

碱性磷酸酶活性检测：培养第1，7，14天后，每组各取6孔，弃上清，PBS冲洗3次，吸干，每孔加入200 μL的0.5%TritonX-100，置4 ℃冰箱过夜，根据碱性磷酸酶试剂盒说明，使用生化仪测出碱性磷酸酶活性^[7-8]。

1.6 统计学分析对文中所得数据进行统计学处理，采用SPSS 15.0软件进行分析，计量资料采用t 检验，计数资料采用χ²检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

牙周感染性疾病作为人群中普遍存在的一种疾病，是造成牙齿缺失的主要原因之一，其治疗的基本目标在于消除炎症及其导致的不适、出血、疼痛等症状，停止牙周破坏，并促使组织修复再生^[9-10]。目前的治疗手段仅能控制炎症，而要促使牙周组织再生尚有一定局限性^[11]。近年来，寻找符合牙周组织修复特点的材料成为国内外牙周组织工程的研究热点。在组织工程中，支架材料占据着非常重要的地位^[12]，它不仅起支撑作用，保持原有组织的形状，而且还起到模板作用，为细胞提供赖以寄宿、成长、分化、增殖的场所，引导受损组织再生和控制再生组织的结构^[13-14]。随着各种生物支架材料研究的深入，海藻酸盐、壳聚糖、胶原、明胶及人工合成的聚合物(如聚乳酸、聚乙醇酸及他们的共聚物)，都已作为细胞的承载物应用于多种体外和体内实验中^[15-16]。

牙周膜是附着连接牙骨质和牙槽骨的疏松纤维结缔组织，不仅是重要的牙体支持组织，还对牙齿的营养、供血和损伤组织的修复起着不可替代的作用^[17]。牙周组织再生要求软硬组织协调一致，牙周膜中含有异质性细胞，可增殖分化为成牙骨质细胞、成骨细胞等。目前有多种研究表明牙周膜细胞具有在体外形成钙结节的能力，可表达骨相关标志物，如碱性磷酸酶、骨涎蛋白、骨桥蛋白等，以及在骨诱导因素如甲状旁腺素、胰岛素样生长因子1，骨形成蛋白2和转化生长因子β1等的作用后可向成骨细胞方向分化^[18-20]。目前牙周膜细胞体外培养技术已比较成熟，能够作为牙周硬组织再生的首选种子细胞。国内外细胞增殖MTT实验表明，明胶静电纺丝膜具有非常好的促细胞骨分化作用，提示明胶材料本身具有良好的生物相容性，能够促进细胞增殖^[21-22]。随着明胶电纺丝在临床上应用范围的扩大，近来有研究表明矿化明胶电纺膜不能较好地促进细胞生长，细胞生长较稀疏，形态未得到完全伸展，细胞多呈圆球型，有的可见细胞突起伸展附着于材料表面，但大多数细胞未见板状突起，可见羟基磷灰石矿化的纤维表面不利于细胞黏附，这也许与羟基磷灰石附着于纤维表面的形态有关，过于致密的羟基磷灰石不利于细胞的生长^[23-24]；有动物实验显示，人牙周膜成纤维细胞能较好地黏附生长，可见成骨样细胞，新生组织中有钙沉积和丰富的血管组织长入，周围组织无明显炎症。

在模拟体液的溶液中进行生物矿化是制备促进骨再生聚合物的方法之一，这种方法模拟生物矿化过程，已逐渐用于组织工程支架的制备中^[25]。采用交替浸润法对明胶进行羟基磷灰石矿化，并分别配制0.4 mol/L的CaCl₂溶液和0.24 mol/L的Na₂HPO₄溶液对材料进行反复浸泡，使其矿化。实验中矿化条件如溶液浓度、pH，矿化时间不同，使羟基磷灰石在纤维表面沉积的数量、晶体形态不同，矿化程度越高，纳米羟基磷灰石沉积过程中会逐渐融合形成较大磷灰石颗粒而不利于细胞黏附，所以对适宜的矿化条件需要进一步实验^[26]。

碱性磷酸酶是参与骨等硬组织形成、代谢、再生的重要调节物质，广泛分布于体内几乎所有器官，通过水解磷酸酯、破坏矿化抑制剂及作为钙结合蛋白和磷酸基的转运子而促进矿化，可作为生物矿化和成骨样细胞的特征性标记^[27-28]。有研究发现牙周膜成纤维细胞经诱导后，碱性磷酸酶活性显著升高，且在牙周膜不同区域碱性磷酸酶活性不尽相同，提示局部磷酸代谢程度和牙骨质沉积有关。本实验结果显示，矿化5 d的材料较矿化1 d的材料具有更明显的促细胞向成骨方向分化的作用，说明随着矿化度增高，对细胞的诱导作用也相应增高，但如何将纳米羟基磷灰石与明胶静电纺丝复合还需进一步的研究^[29-38]。

综上所述，明胶静电纺丝纤维膜具有良好的生物相容性，可作为生物膜材料应用于牙周组织再生，由于矿化明胶静电纺丝纤维表面有羟基磷灰石的沉积，故其骨诱导作用更为显著。
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