碱性成纤维细胞生长因子影响脂肪干细胞的血管内皮迁移

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.10.015

摘要/Abstract

摘要：

背景：良好血运机制的建立是工程化组织成功植入的关键。
目的：观察外源性碱性成纤维细胞生长因子对植入小鼠皮下的人脂肪来源干细胞-透明质酸钠复合物中人脂肪来源干细胞向血管内皮迁移情况的影响。
方法：由吸脂术所得的脂肪组织中分离提取人脂肪来源干细胞进行培养传代，取第3代人脂肪来源干细胞进行cm-dil荧光标记后制成5×10⁹ L^-1的细胞悬液，碱性成纤维细胞生长因子配成 2 mg/L的工作液。将由0.25 mL透明质酸钠凝胶、0.2 mL细胞悬液和0.05 mL工作液/DMEM混合制成的碱性成纤维细胞生长因子组/对照组移植物分别植入小鼠背部左右两侧皮下作自身对照，6周后取材，行苏木精-伊红染色和免疫荧光标记血管内皮细胞进行观察分析。
结果与结论：植入处未出现结节、坏死及液化，取材时无凝胶残留。苏木精-伊红染色见标本性质多为脂肪组织及疏松结缔组织。荧光显微镜下仍可见标记人脂肪来源干细胞的cm-dil荧光，其与标记小鼠血管内皮的FITC荧光重合数碱性成纤维细胞生长因子组多于对照组(P < 0.05)。提示碱性成纤维细胞生长因子促进透明质酸钠支架中的人脂肪来源干细胞向血管内皮迁移、分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 脂肪干细胞, 人脂肪来源干细胞, 组织工程, 碱性成纤维细胞生长因子, 透明质酸钠, 血管生成

Abstract:

BACKGROUND: The establishment of a good blood supply is a key mechanism for successful implantation of engineered tissues.
OBJECTIVE: To observe the effect of basic fibroblast growth factor on the migration of human adipose-derived stem cells via implanting the human adipose-derived stem cells and sodium hyaluronate composite graft at the subcutaneous site of BALB/C mice, in order to explore an optimal scheme for soft tissue reconstruction.
METHODS: Human adipose-derived stem cells were isolated from the adipose tissue of healthy cosmetic patients which received liposuction, and the cells were subcultured. Then 5×10⁹/L passage 3 cell suspension labeled by cm-dil was prepared. The working solution containing 2 mg/L basic fibroblast growth factor was prepared. Composite tissue al-lografts which were the mixtures of 0.25 mL sodium hyaluronate, 0.2 mL cell suspension and 0.05 mL working solution or DMEM were implanted into the subcutaneous site of both sides of the mouse back. Specimens were taken at 6 weeks after operation and were evaluated histologically after hematoxylin-eosin and vascular immunofluorescent staining.
RESULTS AND CONCLUSION: No necrosis, liquefaction, nodular tissue or gel remained in operated position. The hematoxylin-eosin staining showed the main components of the specimens were the adipose tissue and the
loose connective tissue. The immunofluorescence staining showed the overlaps between the cm-dil fluorescence from human adipose-derived stem cells and the FITC fluorescence from the vascular endothelium in the experimental group were more than those in the control group (P < 0.05). Basic fibroblast growth factor promotes the migration and the differentiation of human adipose-derived stem cells in the sodium hyaluronate scaffold into vascular endothelium.

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Key words: stem cells, subcutaneous fat, adipose tissue, fibroblast growth factors, endothelium, vascular, hyaluronic acid

中图分类号:

R394.2

朱梦琳，姜南，徐扬阳，曹菁，杨柳. 碱性成纤维细胞生长因子影响脂肪干细胞的血管内皮迁移[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(10): 1573-1578.

Zhu Meng-lin, Jiang Nan, Xu Yang-yang, Cao Jing, Yang Liu. Effect of basic fibroblast growth factor on the migration of human adipose-derived stem cells toward vascular endothelium[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(10): 1573-1578.

图/表（结果） 6

2.1 实验动物状况 移植物植入后小鼠均未出现腹泻、寒战等排斥反应的明显症状。至6周后取标本前，10只小鼠均存活且无明显行为异常。取标本时小鼠平均体质量21.93 g。

2.2 人脂肪来源干细胞的各阶段形态 人脂肪来源干细胞提取、接种后立刻观察，细胞呈球形、颗粒状悬浮于培养基中。8 h后少量细胞开始贴壁，贴壁细胞多呈纺锤形(图1A)。24 h首次换液前见大部分细胞已贴壁，散在分布，呈细长的纺锤形或梭形，形态类似成纤维细胞。3 d后细胞呈集落状分布，偶可见旋涡状生长(图1B)。7-9 d后细胞融合至瓶底80%-90%，形态较之前宽大扁平，部分细胞边缘可见不规则突起。传代后的细胞呈长梭形(图1C)，生长较之前增快，传代后五六天即可再次达到传代条件。

2.3 人脂肪来源干细胞的鉴定

成脂诱导油红O染色：取第3代人脂肪来源干细胞行成脂诱导，1周后光镜下可观察到大小不一的透亮脂滴团簇状出现，2周后脂滴变大融合，行油红O染色可见脂滴呈红色(图2)。

流式细胞仪检测：流式细胞仪对第3代人脂肪来源干细胞鉴定结果，见图3，CD14表达比例(0.18±0.09)%，CD34表达比例(0.36±0.17)%，CD45表达比例(0.63±0.67)%，CD105表达比例(95.60±1.37)%，CD11b表达比例(2.26±0.04)%，HLA-DR表达比例(2.30±0.85)%^[11]。

2.4 第3代人脂肪来源干细胞的荧光标记情况第3代人脂肪来源干细胞经cm-dil标记后，荧光显微镜下可见被成功标记的细胞显红色荧光(图4A)，呈梭形，胞核无明显荧光。阳性标记率达90%以上。

2.5 植入物及标本大体观察 复合物植入后在小鼠背部双侧形成肿物，无明显炎症反应表现。肿物逐日缩小，2周后肉眼观察不到。术后6周剪开背部皮肤，见双侧植入处均无结节、坏死、液化，无明显凝胶状物残留，双侧软组织质地无显著差别。

2.6 组织学观察 苏木精-伊红染色后镜下可见两组标本性质主要为脂肪组织，脂肪细胞呈空泡状，胞质呈薄壁状，胞核深染，位于细胞一侧(图5)。其次为疏松结缔组织，位于脂肪组织外缘及脂肪组织间。两组标本中均可观察到血管结构，部分视野中可见肌肉组织，但两组组织成分镜下未见明显差异。

2.7 荧光显微镜观察 被cm-dil标记的人脂肪来源干细胞示踪：绿色光源下，部分视野可见颗粒状聚集或条带状沉积的红色明亮荧光，位于标本的外部边缘、不同种类组织交界处或组织内部(图4B)。部分视野可观察到红色微亮区域，质地均匀，呈块状、条索状或分叶状，边界清晰，切换到光镜后结合苏木精-伊红染色结果可辨识得红色微亮区域为疏松结缔组织。血管内皮细胞的免疫荧光观察：标本行Anti-CD31/FITC免疫荧光染色(图4C)，倒置荧光显微镜蓝色光源下可见血管内皮细胞呈绿色荧光，形态多为血管断面。

同一视野不同光源下红、绿色荧光的重合情况：碱性成纤维细胞生长因子组、对照组分别从不同切片中随机选取明显的cm-dil荧光，固定视野不变切换到蓝色光源，观察原红色cm-dil荧光是否与蓝色光源下的绿色FITC荧光有重合部分，若重合则记录为阳性。实验数据如表1所示。经统计学分析得卡方值，差异有显著性意义(χ²=4.53，自由度υ=1，P < 0.05)。

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引言

组织工程软组织填充技术是解决软组织缺损和皮肤年轻化等问题的重要手段。寻找一种安全、方便、组织相容性好、降解缓慢的软组织填充材料是当今整形外科医师面临的重大课题。对于机体组织、器官损伤缺损导致的功能障碍，传统修复方法为采用自体组织移植，即用自体正常组织作为填充材料，组织来源有限且附加损伤较大。20世纪80年代组织工程这一概念被首次提出，随后经众多学者广泛研究并迅速发展^[1-2] 。近年来，组织工程技术被越来越多地运用到需要软组织填充的修复重建外科中去^[3-4] 。
组织工程又称“再生医学”，以工程学和生命科学的原理和方法为理论基础，是利用体外预先培养或构建的生物活性物质对机体器官及组织进行再造或修复，以此改善其功能和形态的一门技术。组织工程有3大要素，即种子细胞、支架材料、生长因子。细胞在分化过程中，往往由于分化程度过高而失去了再次分裂的能力，导致其最终衰老死亡。因此，机体在发展过程中将部分未分化的原始细胞予以保留，用于适应自身细胞这一特性，这种被保留下来的未分化细胞即干细胞。干细胞具有使各种组织器官再生的潜在功能，是一种有自我复制能力的未充分分化的细胞^[5] ，这种独特的生物学特性使干细胞成为组织工程中最主要的种子细胞来源。脂肪干细胞是从脂肪组织中分离、提取出的干细胞，与其他来源的干细胞相比较，脂肪干细胞具有来源广泛、取材侵入性低、较易分离、增殖迅速及低免疫原性等特点，因而在组织工程研究中受到极大关注，是可运用于组织及器官再生与修复的理想种子细胞^[6-7] 。
在组织工程中，工程化组织的成功植入，是移植物与受区组织或器官之间通过再血管化相互沟通、组织再生的过程，若血管化发生障碍，术后移植物将出现缺血、坏死，导致植入失败。由此可见，良好血运机制的建立是工程化组织成功植入的关键。在血管生成的过程中，发挥重要调节作用的细胞因子有很多，如血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、血管生成素、转化生长因子β等。成纤维细胞生长因子主要通过促进内皮细胞有丝分裂以及调节内皮细胞趋化因子来促进新生血管的生成。同时，它既可促进脂肪干细胞的增殖并维持其多向分化的潜能，又可在成脂诱导条件下促进其向脂肪细胞分化，是组织工程研究中常用的生长因子^[8-10] 。
本实验运用组织工程技术，以人脂肪来源干细胞作为种子细胞，以注射用透明质酸钠为细胞支架，重点研究外源性碱性成纤维细胞生长因子在细胞-支架复合物植入后对人脂肪来源干细胞向血管内皮迁移情况的影响，从而探究人脂肪来源干细胞-透明质酸钠-碱性成纤维细胞生长因子复合物体内构建血管化组织工程脂肪的可行性，为今后软组织填充材料的选择提供理想方案、实验依据和理论支持。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：细胞形态学观察。

时间及地点：实验于2012年8月至2013年5月在郑州大学第五附属医院中心实验室完成。

材料：

实验动物：健康雌性7周龄BALB/c小鼠10只，平均体质量17.68 g，由郑州大学实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK(豫)2010-0002；使用许可证号：SYXK(豫)2011- 0001。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。

脂肪组织来源：均来自郑州大学第五附属医院整形外科接受腹部脂肪抽吸术的健康女性求美者，共12例，年龄18-40岁。术前各项检查结果均正常，并签署科研知情同意书。实验方案获郑州大学第五附属医院批准。

方法：

人脂肪来源干细胞的提取、培养和扩增：取吸脂术中抽吸出的脂肪组织10 mL，用含0.1%双抗溶液的PBS充分冲洗后，加入等体积的浓度为1%的Ⅰ型胶原酶37 ℃恒温振荡消化，离心后弃去上清液，重悬于红细胞裂解液中10 min，再次离心弃上清，重悬于完全培养基(DMEM/F12、含体积分数10%胎牛血清、1%双抗溶液)中，滤网过滤后接种于细胞培养瓶内。24 h进行首次换液，此后每三四天换液1次，待细胞生长至铺满瓶底80%时进行传代。

人脂肪来源干细胞的鉴定：取第3代细胞，用流式细胞仪进行细胞表型鉴定，表面抗原选取CD14、CD34、CD45、CD11b，CD105、HLA-DR。另选取第3代细胞进行成脂诱导，14 d后行油红O染色观察成脂情况。

人脂肪来源干细胞的标记、人脂肪来源干细胞-透明质酸钠复合物的制备：选取第3代生长良好的人脂肪来源干细胞，弃去培养基后加入含5 mg/L cm-dil的PBS中37 ℃孵育5 min，4 ℃孵育15 min，PBS冲洗，荧光显微镜下观察标记情况。将标记成功的人脂肪来源干细胞配置成浓度为5×10⁹ L^-¹的细胞悬液。透明质酸钠粉剂用PBS稀释成质量浓度0.012 5 g/mL的凝胶。碱性成纤维细胞生长因子用少量tris溶液溶解后，加入DMEM和胎牛血清制成2 mg/L的工作液；同时，用DMEM和胎牛血清制成工作对照液(工作液及工作对照液中胎牛血清的终浓度均为1%)。实验设碱性成纤维细胞生长因子组和对照组。碱性成纤维细胞生长因子组：0.25 mL透明质酸钠凝胶+0.2 mL细胞悬液+0.05 mL工作液，充分混匀；对照组：0.25 mL透明质酸钠凝胶+ 0.2 mL细胞悬液+0.05 mL工作对照液，充分混匀。

人脂肪来源干细胞-透明质酸钠复合物的植入及标本的取材：将对照组、碱性成纤维细胞生长因子组复合物分别注射于小鼠背部左、右肩胛骨外侧皮下，每只小鼠均做自身对照。6周后处死小鼠，取植入处软组织为标本，40 g/L多聚甲醛固定24 h后逐次用20%、30%蔗糖脱水，行冰冻切片。

标本观察： ①大体观察：取标本时，观察左右两侧软组织色泽、质地等外观差异，并观察有无凝胶残留。②苏木精-伊红染色组织学观察：对冰冻切片行苏木精-伊红染色，观察各组标本组织学形态。③免疫荧光染色观察：冰冻切片经过甲醇固定、血清封闭后，行免疫荧光染色，一抗选用兔抗鼠CD31抗体，二抗选用羊抗兔IgG-FITC，荧光显微镜下观察染色情况。④外源性细胞荧光示踪观察：荧光显微镜下观察切片中是否有之前植入的经cm-dil标记的人脂肪来源干细胞荧光残留。

主要观察指标：主要观察同一视野不同光源下，cm-dil标记外源性人脂肪来源干细胞红色荧光与FITC标记血管内皮绿色荧光的重合情况。

统计学分析：由实验者对各组数据进行记录。实验数据采用四格表资料卡方检验，运用SAS v 9软件对数据进行统计学分析，P < 0.05时为差异有显著性意义。

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讨论

针对整形外科中常见的体表凹陷、软组织缺损或萎缩畸形等症状，目前在临床中获得广泛应用的皮下填充物主要有自体游离脂肪组织和人工合成植入材料。由于分化成熟的脂肪组织对缺氧、损伤等环境不能良好耐受，加之游离脂肪植入体内后难以形成良好的血运，自体脂肪移植后常因重吸收而无法达到理想的填充效果，其移植成功率仅为40%-50%^[12] 。用于软组织重建的人工材料种类很多，但其存在重吸收、组织相容性差、引发排异反应、安全性等问题，并可引起植入物挛缩、破裂、移位、皮下积液或血肿等并发症^[13] ，故临床应用也具有一定局限性。因此，近年来运用组织工程学技术治疗体表凹陷等畸形已被许多学者探索尝试，成为整形重建外科研究的热点。
种子细胞、支架材料、生长因子是组织工程技术的3个最关键组成要素。作为组织工程学中最常用的种子细胞之一，人脂肪来源干细胞具有多谱系分化的潜能，经多次传代增殖后仍可保持其生物学特性。其取材方便安全、创伤相对较小，且本身具有使移植物血管化的能力^[14] ，并在体内、外均可相对简单地实现成脂分化^[15] 。过去曾有研究者认为，欲使人脂肪来源干细胞在移植处稳定分化为脂肪细胞，需在植入前进行体外成脂预分化^[16] 。近年来有研究证明，将未分化的人脂肪来源干细胞接种于可降解的生物支架上移植入体内，也可观察到新生脂肪组织形成^[17] 。另一方面， Matsumoto等^[18]将颗粒脂肪细胞联合人脂肪来源干细胞植入小鼠皮下，结果脂肪细胞移植成活率较单纯游离脂肪移植上升35%，其重要原因之一是人脂肪来源干细胞可促进移植入体内的游离脂肪组织的再血管化^[19] 。本实验从细胞迁移、分化的角度出发，拟诠释人脂肪来源干细胞促移植物血管化的发生机制。
用于构建组织工程脂肪的生物支架需具有良好的组织相容性和可降解性。透明质酸钠具有独特孔径结构，有利于种子细胞及新生组织的依附与存活；并具有较好的黏附性，使种子细胞易于扩散、增殖。其适合脂肪组织生长，同时表现出有益于血管生成的特性。Hemmerich等^[20]将透明质酸与未分化的人脂肪来源干细胞混合用于小缺损的注射重建治疗，观察到有充足的脂肪组织生成。此外，由于透明质酸钠可被组织吸收，在本实验中既可作为细胞支架，又可为碱性成纤维细胞生长因子提供缓释体。
碱性成纤维细胞生长因子是一种多肽类细胞生长因子，其可加速人脂肪来源干细胞的成脂分化过程的作用已被证实。在人脂肪来源干细胞体外培养成脂诱导剂中加入重组人碱性成纤维细胞生长因子，可有效促进成脂细胞增殖速率。Eppley等^[21]将大鼠脂肪组织混合重组人碱性成纤维细胞生长因子植入皮下，观察到脂肪移植吸收率远远低于未混合人碱性成纤维细胞生长因子的单纯脂肪组织。其在自体脂肪移植术中有显著促脂肪细胞增殖作用，现已广泛应用于临床。Tabata等^[22]将碱性成纤维细胞生长因子缓释颗粒与基质胶混合植入裸鼠皮下后，移植处生成了明显的脂肪块，说明其本身就有促脂肪生成的作用。同时，碱性成纤维细胞生长因子作为一种可作用于内皮细胞趋化因子、促进血管内皮细胞有丝分裂的生长因子，其强烈的促血管形成和再生作用也已被证实。碱性成纤维细胞生长因子可促进毛细血管基底膜降解和胶原合成，促进内皮细胞分化、迁移增生，从而促进毛细血管芽和血管腔形成；同时可调节内皮细胞分泌蛋白酶溶解并进入周围基质，构建新生毛细血管^[23] 。然而，鲜有人从细胞水平和细胞迁移的角度探究碱性成纤维细胞生长因子对种植于支架材料中的人脂肪来源干细胞促血管化作用的影响。
实验利用荧光标记方法，对植入小鼠皮下的细胞-支架复合体中人脂肪来源干细胞的位置进行示踪观察。此前已有研究者观察到将透明质酸钠与人脂肪来源干细胞混合植入裸鼠皮下，8周后形成结节样组织。实验选用无免疫缺陷的BALB/c小鼠植入人脂肪来源干细胞-透明质酸钠复合物，未见小鼠有明显排斥反应的全身表现，6周后未观察到明显结节，且移植处软组织未出现坏死、液化等现象；组织内仍有标记人脂肪来源干细胞的cm-dil荧光，添加了碱性成纤维细胞生长因子的碱性成纤维细胞生长因子组中位于血管处的人脂肪来源干细胞示踪荧光显著多于未添加碱性成纤维细胞生长因子的对照组，说明碱性成纤维细胞生长因子对植入物中的人脂肪来源干细胞具有趋向性作用，促使其由细胞基质向血管内皮处迁移，继而向血管内皮细胞分化，参与血管的构建。在此理论基础上新生血管的形成系由内源性血管内皮和外源性人脂肪来源干细胞增殖分化而来的血管内皮共同完成。同时，碱性成纤维细胞生长因子可能诱导人脂肪来源干细胞在无内源性血管内皮的细胞基质或支架中聚集，分化为血管内皮细胞，形成由外源性人脂肪来源干细胞构建的新生毛细血管。上述情况均可增强移植处血管化，为新生脂肪组织提供更好的血运环境。由此可见，在人脂肪来源干细胞-透明质酸钠复合物中加入碱性成纤维细胞生长因子可加速移植物血运重建而减缓移植物的吸收，更好地构建组织工程脂肪，从而达到较为理想的填充效果。本实验提出了一种新的组织工程填充材料选择方案，对临床工作具有一定指导作用，然而其在临床应用中的具体效果及潜在问题还需进一步研究探索。

文章快阅

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