肌肉注射异种脐带间充质干细胞大鼠心肌肌钙蛋白I及血清相关因子的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.10.014

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (10): 1566-1572.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.10.014

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肌肉注射异种脐带间充质干细胞大鼠心肌肌钙蛋白I及血清相关因子的表达

王思平¹，聂娜娜¹，王丽²，李自普¹

青岛大学医学院附属医院，¹儿科，²干细胞中心，山东省青岛市 266003

出版日期:2014-03-05 发布日期:2014-03-05
通讯作者: 李自普，博士，教授，博士生导师，青岛大学医学院附属医院儿科，山东省青岛市 266003
作者简介:王思平，女，1985年生，山东省滕州市人，汉族，2012年青岛大学毕业，硕士，主要从事小儿心血管方面的研究。目前在滕州市中心人民医院工作。
基金资助:
青岛市公共领域科技支撑计划项目[11-2-3-1-(4)-nsh]

Effects of intramuscular injection of heterogeneous umbilical cord mesenchymal stem cells on myocardial cardiac troponin and serum-related factors in rats

Wang Si-ping¹, Nie Na-na¹, Wang Li², Li Zi-pu¹

¹Department of Pediatrics, ²Stem Cell Research Center, the Affiliated Hospital of Qingdao University Medical School, Qingdao 266003, Shandong Province, China

Online:2014-03-05 Published:2014-03-05
Contact: Li Zi-pu, M.D., Professor, Doctoral supervisor, Department of Pediatrics, the Affiliated Hospital of Qingdao University Medical School, Qingdao 266003, Shandong Province, China
About author:Wang Si-ping, Master, Department of Pediatrics, the Affiliated Hospital of Qingdao University Medical School, Qingdao 266003, Shandong Province, China
Supported by:
the Scientific Research Plan in Public Domain of Qingdao City, No. 11-2-3-1-(4)-nsh

摘要/Abstract

摘要：

背景：目前关于肌肉注射异种脐带间充质干细胞是否安全缺乏理论依据。
目的：观察异种脐带间充质干细胞肌肉注射对大鼠心肌血管内皮生长因子、肌钙蛋白I及血清血管内皮生长因子、肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子1和粒-巨噬细胞集落刺激因子表达的影响。
方法：正常Wistar大鼠分为6组，分别于大鼠四肢肌肉肌注磷酸盐缓冲液、DMEM液、培养人脐带间充质干细胞上清液、0.25×10⁵，1.0×10⁵和4.0×10⁵人脐带间充质干细胞。4周后重复注射，8周后取血和心肌组织，ELISA法检测血清血管内皮生长因子、肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子1和粒-巨噬细胞集落刺激因子水平，免疫组化法检测大鼠心肌肌钙蛋白I及血管内皮生长因子表达情况。
结果与结论：肌注前后各组间大鼠血清血管内皮生长因子、肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子1和粒-巨噬细胞集落刺激因子水平差异无显著性意义(P > 0.05)；同组大鼠肌注前后血清血管内皮生长因子、肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子1和粒-巨噬细胞集落刺激因子水平差异亦无显著性意义(P > 0.05)。肌注后8周，各组大鼠肌钙蛋白I在心肌细胞胞浆中均匀分布且呈强阳性表达；血管内皮生长因子亦在心肌细胞胞浆中分布，但呈弱阳性表达；各组间大鼠心肌组织肌钙蛋白I及血管内皮生长因子水平比较差异无显著性意义(P > 0.05)。提示肌注人脐带间充质干细胞或其培养上清液对正常大鼠血清血管内皮生长因子、肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子1、粒-巨噬细胞集落刺激因子水平及心肌组织肌钙蛋白I及血管内皮生长因子的表达无影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 脐带脐血干细胞, 脐带间充质干细胞, 肌钙蛋白I, 血管内皮生长因子, 肝细胞生长因子, 肌肉注射

Abstract:

BACKGROUND: Current researches on whether the intramuscular injection of heterogeneous umbilical cord mesenchymal stem cells (UC-MSCs) is safe or not lack theoretical basis.
OBJECTIVE: To explore the effects of intramuscular injection of heterogeneous UC-MSCs on expression of myocardial vascular endothelial growth factor (VEGF), cardiac troponin I (cTnI) and serum VEGF, hepatocyte growth factor (HGF), insulin-like growth factor 1 (IGF-1) and granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) in normal Wistar rats.
METHODS: A total of 60 Wistar rats were divided into six groups randomly. Rats in the six groups were respectively administrated with intramuscular injection of PBS, Dulbecco’s modified Eagle’s medium, hUC-MSC supernatant, 0.25×10⁵, 1.0×10⁵, 4.0×10⁵hUC-MSCs. Rats received a second intramuscular injection 4 weeks after first injection. Eight weeks later, the blood sample and myocardial tissue were taken. The serum concentration of VEGF, HGF, IGF-1 and GM-CSF were measured with enzyme-linked immunosorbent assay kit. The myocardial VEGF and cTnI expression were detected by immunohistochemical technique.
RESULTS AND CONCLUSION: There was no significant difference in the serum concentration of the VEGF, HGF, IGF-1 and GM-CSF among the groups before and after injection (P > 0.05). In the same group, no statistical significant changes in the serum concentration of the VEGF, HGF, IGF-1 and GM-CSF were found among the rats before and after injection (P > 0.05). Eight weeks after injection, weak positive expression of the VEGF in the cytoplasm of cardiocytes in the six groups was observed, and strong positive expression of the cTnI in the cytoplasm of cardiocytes in the six groups was observed. There was no significant difference in the VEGF and cTnI content in the myocardium among the groups (P > 0.05). Intramuscular injection of hUC-MSCs or the supernatant of hUC-MSCs had no effects on the serum concentration of the VEGF, HGF, IGF-1, GM-CSF and the myocardial VEGF and cTnI expression in normal Wistar rats.

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Key words: stem cells, umbilical cord, mesenchymal stem cells, troponin I, vascular endothelial growth factors, hepatocyte growth factor

中图分类号:

R394.2

王思平，聂娜娜，王丽，李自普.. 肌肉注射异种脐带间充质干细胞大鼠心肌肌钙蛋白I及血清相关因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(10): 1566-1572.

Wang Si-ping, Nie Na-na, Wang Li, Li Zi-pu. Effects of intramuscular injection of heterogeneous umbilical cord mesenchymal stem cells on myocardial cardiac troponin and serum-related factors in rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(10): 1566-1572.

图/表（结果） 5

参考文献

[1]Mollova M, Bersell K, Walsh S, et al. Cardiomyocyte proliferation contributes to heart growth in young humans. Proc Nat Acad Sci USA. 2013;110: 1446-1451.
[2]Laflamme MA, Murry CE. Heart regeneration. Nature. 2011; 473:326-335.
[3]Jacobs SA, Roobrouck VD, Verfaillie CM, et al. Immunological characteristics of human mesenchymal stem cells and multipotent adult progenitor cells. Immunol Cell Biol. 2013;91(1): 32-39.
[4]林晓波,何红燕,罗敏杰,等.人脐带间充质干细胞向心肌样细胞分化的研究[J].实用儿科临床杂志,2007,22(13):971-973.
[5]Liu P,Lin JH,Zhang B,et al.Differential regulation of cadherin expression by osteotropic hormones and growth factors in vitro in human osteoprogenitor cells .Acta Pharmacol Sin. 2005;26(6):705-713.
[6]Kim DW, Staples M, Shinozuka K, et al.Wharton's Jelly-Derived Mesenchymal Stem Cells: Phenotypic Characterization and Optimizing Their Therapeutic Potential for Clinical Applications.Int J Mol Sci. 2013;14(6):11692-11712.
[7]Hsieh JY, Wang HW, Chang SJ, et al.Mesenchymal stem cells from human umbilical cord express preferentially secreted factors related to neuroprotection, neurogenesis, and angiogenesis.PLoS One. 2013;8(8):e72604.
[8]Nartprayut K, U-Pratya Y, Kheolamai P, et al.Cardiomyocyte differentiation of perinatally-derived mesenchymal stem cells. Mol Med Rep. 2013;7(5):1465-1469.
[9]Maureira P, Marie PY, Yu F, et al.Repairing chronic myocardial infarction with autologous mesenchymal stem cells engineered tissue in rat promotes angiogenesis and limits ventricular remodeling.J Biomed Sci.2012;12:19-93.
[10]Wang Y, Han ZB, Ma J,et al.A toxicity study of multiple-administration human umbilical cord mesenchymal stem cells in cynomolgus monkeys.Stem Cells Dev. 2012; 10;21(9):1401-1408.
[11]Ma N, Stamm C, Kaminski A, et al. Human cord blood cells induce angiogenesis following myocardial infarction in NOD/scid mice. Cardiovasc Res. 2005;66(1):45-54.
[12]Breitbach M, Bostani T, Roell W, et al. Potential risks of bone marrow cell transplantation into infarcted hearts. Blood. 2007; 110(4): 1362-1369.
[13]Widimsky P,Penicka M. Complications after intracoronary stem cell transplantation in idiopathic dilated cardiomyopathy. Int J Cardiol. 2006;111(1):178-179.
[14]Yoon YS, Park JS, Tkebuchava T, et al.Unexpected severe calci?cation after transplantation of bone marrow cells in acute myocardial infarction. Circulation. 2004;109(25): 3154-3157.
[15]Shabbir A, Zisa D, Leiker M, et al. Muscular dystrophy therapy by nonautologous mesenchymal stem cells: muscle regeneration without immunosuppression and inflammation. Transplantation. 2009;87(9):1275-1282.
[16]Shabbir A, Zisa D, Suzuki G, et al. Heart failure therapy mediated by the trophic activities of bone marrow mesenchymal stem cells: a noninvasive therapeutic regimen. Am J Physiol. 2009;296(6):H1888-1897.
[17]张美荣,张学峰,胡建霞,等.大鼠肌肉注射移植人脐带间充质干细胞的安全性[J].中国组织工程研究与临床康复,2010,14(27): 4997-5000.
[18]Gnecchi M, Danieli P, Cervio E.Mesenchymal stem cell therapy for heart disease.Vascul Pharmacol. 2012;19;57(1):48-55.
[19]van den Akker F, Deddens JC, Doevendans PA, et al. Cardiac stem cell therapy to modulate inflammation upon myocardial infarction.Biochim Biophys Acta.2013;1830(2):2449-2458.
[20]Mohammadi Gorji S, Karimpor Malekshah AA, Hashemi-Soteh MB, et al .Effect of mesenchymal stem cells on Doxorubicin-induced fibrosis. Cell J. 2012;14(2):142-151.
[21]Suzuki MI,Haider H,Jiang S,et al. Pharmacologically preconditioned skeletal myoblasts are resistant to oxidative stress and promote angiomyogenesis via release of paracrine factors in the infarcted heart. Circ Res. 2007;100 (4):545-555.
[22]Huang J, Zhang Z, Guo J,et al. Genetic modify of mesenchymal stem cells overexpressing CCR1 increases cell viability, migration, engraftment, and capillary density in the injured myocardium. Circ Res. 2010;106 (11): 1753-1762.
[23]Hatzistergos KE, Quevedo H, Oskouei BN, et al. Bone marrow mesenchymal stem cells stimulate cardiac stem cell proliferation and differentiation. Circ Res. 2010;107(7):913-922.
[24]Zisa D,Shabbir A,Suzuki G,et al. Vascular endothelial growth factor (VEGF) as a key therapeutic tropic factor in bone marrow mesenchymal stem cell-mediated cardiac repair. Biochem Biophys Res Commun. 2009;390(3):834-838.
[25]Mazhari R,Hare JM.Mechanisms of action of mesenchymal stem cells in cardiac repair: potential in?uences on the cardiac stem cell niche. Nat Clin Pract Cardiovasc Med.2007; 4(Suppl 1):S21-26.
[26]Gnecchi M, He H,Liang OD,et al. Paracrine action accounts for marked protection of ischemic heart by Akt-modi?ed mesenchymal stem cells. Nat Med. 2005;11(4):367-368.
[27]Lee RH, Pulin AA., Seo MJ, et al .Intravenous hMSCs improvemyocardial infarction inmice because cells embolized in lung are activated to secrete the anti-in?ammatory protein TSG-6.Cell Stem Cell. 2009;5(1): 54-63.
[28]Yancopoulos GD, Davis S, Gale NW,et al.Vascular-specific growth factors and blood vessel formation. Nature. 2000;407: 242-248.
[29]Fang J, Chen L, Fan L, et al .Enhanced therapeutic effects of mesenchymal stem cells on myocardial infarction by ischemic postconditioning through paracrine mechanisms in rats.J Mol Cell Cardiol. 2011;51(5):839-847.
[30]Tiwari RP, Jain A, Khan Z, et al.Cardiac troponins I and T: molecular markers for early diagnosis, prognosis, and accurate triaging of patients with acute myocardial infarction. Mol Diagn Ther.2012;16(6):371-381.
[31]Iwasaki H, Kawamoto A, Willwerth C,et al.Therapeutic potential of unrestricted somatic stem cells isolated from placental cord blood for cardiac repair post myocardial infarction. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2009;29(11): 1830-1835.
[32]Wen Z, Zheng S, Zhou C, et al.Repair mechanisms of bone marrow mesenchymal stem cells in myocardial infarction.J Cell Mol Med. 2011;15(5):1032-1043.
[33]Kamdar F, Jameel MN, Score P, et al.Cellular therapy promotes endogenous stem cell repair.Can J Physiol Pharmacol. 2012;90(10):1335-1344.
[34]Laflamme MA, Zbinden S, Epstein SE,et al. Cell-based therapy for myocardial ischemia and infarction: pathophysiological mechanism.Annu Rev Pathol. 2007;2:307-309.
[35]Taniyama Y, Morishita R, Aoki M,et al.Angiogenesis and antifibrotic action by hepatocyte growth factor in cardiomyopathy.Hypertension. 2002;40(1):47-53.
[36]Kinnaird T, Stabile E, Burnett MS,et al.Marrow-derived stromal cells express genes encoding a broad spectrum of arteriogenic cytokines and promote in-vitro and in-vivo arteriogenesis through paracrine mechanisms.Circ Res. 2004;94(5):678-685.
[37]Lamblin N, Bauters A, Fertin M, et al.Circulating levels of hepatocyte growth factor and left ventricular remodelling after acute myocardial infarction (from the REVE-2 study).Eur J Heart Fail. 2011;13(12):1314-1322.
[38]Liu TB, Fedak PW, Weisel RD,et al.Enhanced IGF-1 expression improves smooth muscle cell Engraftment after cell transplantation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2004; 287(6):H2840-2849.
[39]Zhao QB,Sun CF,Xu X,et al.CD34+ cell mobilization and upregulation of myocardial cytokines in a rabbit model of myocardial ischemia.Int J Cardiol. 2011;152(1):18-23.
[40]Fishbein MC, Wang T, Matijasevic M,et al.Myocardial tissue troponins T and I. An immunohistochemical study in experimental models of myocardial ischemia. Cardiovasc Pathol. 2003;12(2):65-71.
[41]Gu JW, Adair TH.Hypoxia-induced expression of VEGF is reversible in myocardial vascular smooth muscle cells. Am J Physiol. 1997;273:H628-633.
[42]Welch S, Plank D, Witt S, et al. Cardiac-specific IGF-1 expression attenuates dilated cardiomyopathy in tropomodulin-overexpressing transgenic mice. Circ Res. 2002;90(6):641-648.
[43]陶则伟,李隆贵,耿召华,等.自体间充质干细胞植入促进大鼠衰竭心肌生长因子表达、改善心室重构和心功能[J].中华心血管病杂志,2009,37(6):495-500.
[44]Yamaguchi H, Komamura K, Choraku M, et al.Impact of serum insulin-like growth factor-1 on early prognosis in acute myocardial infarction. Intern Med. 2008;47(9):819-825.
[45]Nagaya N, Fujii T, Iwase T, et al. Intravenous administration of mesenchymal stem cells improves cardiac function in rats with acute myocardial infarction through angiogenesis and myogenesis. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2004;287(6): H2670-2676.
[46]Cho HJ,Lee N,Lee JY,et al. Role of host tissues for sustained humoral effects after endothelial progenitor cell transplantation into the ischemic heart.J Exp Med. 2007;204(13):3257-3269.

引言

传统认为，心脏是一个有丝分裂期后的器官，具有不可再生性。但美国波士顿儿童医院心内科Kühn博士通过研究健康人的心脏标本，证实心肌细胞可以再生，其再生速率在婴儿期最高，之后开始下降，在青少年发育急速期又开始升高，且持续到大约20岁；研究同时提示一些心肌疾病(如心肌病)可能由心肌细胞异常增殖导致，但另一方面也提示通过刺激心肌细胞增殖可治疗年轻人的心力衰竭^[1] 。目前通过给予外源性干细胞进行心肌再生治疗，取得了一定效果^[2] ，但同时存在很多争议，如最适合心肌再生治疗的干细胞类型和干细胞移植途径等方面。
间充质干细胞因容易分离、较高的扩增潜能、低的免疫原性、基因修饰的可塑性及多向分化潜能^[3-5] ，被广泛应用于干细胞疗法。脐带间充质干细胞是一类来源于脐带羊膜上皮和脐血管之间或脐血管之间的结缔组织基质，脐带间充质干细胞含量丰富，容易取材，且脐带是产房中的医疗废物，对供者无侵害性^[6] 。另外脐带间充质干细胞不表达细胞免疫原性标记的人类白细胞抗原，暗示其并无免疫原性，可以用于异种间干细胞移植。脐带间充质干细胞经诱导可分化为内皮细胞及心肌样细胞等^[7-8] ，而且已经证实其具有促进血管生成^[9] 、加速心功能恢复和促进心肌损伤修复的作用。所有这些研究都提示脐带间充质干细胞是潜在良好的心肌再生干细胞来源。
目前在心肌再生治疗中，存在多种干细胞移植途径。静脉注射是一种操作简单、可重复性强且安全的移植途径^[10] ，但移植后归巢到损伤心肌的干细胞数量较少，治疗作用甚微^[11] 。冠状动脉和心内膜注射需要承担心导管介入风险，心外膜途径需要承担手术和麻醉风险，且这些移植途径是有侵害性的，可造成心肌瘢痕形成、严重心律失常、钙化或心肌微梗死灶形成^[12-14] 。因此对于心脏病合并心力衰竭的患者来说，急需开发安全性高、创伤小、可重复性强的干细胞移植新方法。目前关于肌肉注射干细胞的报道较少，临床上主要用于治疗肌营养不良性疾病^[15] ，且证实这种途径是安全的。Shabbir等^[16]发现肌肉注射骨髓间充质干细胞或细胞培养上清液可明显改善心肌病仓鼠的心功能，证实肌肉注射的干细胞并没有迁移到远隔器官。大量研究表明，干细胞产生的多种因子可通过旁分泌或内分泌机制介导心肌损伤后的修复过程。
目前对于正常动物模型肌肉注射干细胞，是否会导致血清中心肌相关因子水平升高，并作用于正常心肌，对正常心肌是否会产生不良影响，并不明确。本课题通过大鼠肌肉注射不同浓度的人脐带间充质干细胞或其细胞培养上清液，检测肌肉注射前后血清中心肌相关因子及心肌组织中血管内皮生长因子、肌钙蛋白I的水平，明确人脐带间充质干细胞肌肉注射对正常大鼠心肌组织的影响，为脐带间充质干细胞应用于干细胞疗法的心脏安全性提供一定的理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：于2011年9月至2012年3月在青岛大学医学院附属医院SPF级动物实验室和中心实验室完成。

材料：

实验动物：健康Wistar大鼠60只，雄性，7周龄，体质量150-200 g，购自山东鲁抗医药有限公司，批号：SCXK20080002。饲养环境符合SPF级标准，对动物的处理符合动物伦理学要求。

人脐带间充质干细胞经流式细胞仪检测，细胞表型符合干细胞表型特征：CD34(-)，CD45(-)，CD90(+)，CD105(+)，HLA-DR(-)。人脐带间充质干细胞微生物检测包括支原体、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、梅毒螺旋体、巨细胞病毒、人类免疫缺陷病毒均为阴性，需氧菌培养和真菌培养均阴性。将人脐带间充质干细胞悬浮在磷酸盐缓冲液溶液中，制备成不同浓度的细胞悬液，保存在4 ℃备用，肌注前5 min恢复至室温。

实验方法：

动物分组：60只Wistar大鼠按随机数字表法分为6组：正常组、培养液对照组、上清液组、人脐带间充质干细胞0.25×10⁵，1.0×10⁵，4.0×10⁵组，每组10只。大鼠于肌注前在动物房内适应1周，第7天断尾取血2 mL(提前1 d禁食)离心后，留取上清，-80 ℃冻存备用；正常组、培养液对照组、上清液组、人脐带间充质干细胞0.25×10⁵，1.0×10⁵，4.0×10⁵组大鼠分别将磷酸盐缓冲液(人脐带间充质干细胞的悬浮液)、DMEM液(人脐带间充质干细胞的培养基)、培养人脐带间充质干细胞的上清液、0.25×10⁵，1.0×10⁵，4.0×10⁵人脐带间充质干细胞注射于大鼠四肢肌肉，注射容积为0.2 mL，每只大鼠肌肉注射液体容积为0.8 mL；4周后按相同剂量、相同注射点再次注射；每日观察大鼠生活习性。实验8周后10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射，麻醉大鼠，暴露体腔，从腹主动脉取血4 mL，离心后，留取上清，-80 ℃冻存备用；取心尖部心肌组织固定备用^[16-17]。

大鼠血清血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子1、肝细胞生长因子、粒-巨噬细胞集落刺激因子的测定：采用定量ELISA法测定，试剂盒购自上海森雄科技有限公司。按照试剂盒说明，配制标准品液，设立标准孔及空白对照孔，测定孔加血清标本，将板条置于37 ℃恒温箱120 min，洗板4次后加第一抗体工作液，于37 ℃恒温箱放置60 min；洗板4次后加酶标抗体工作液，于37 ℃恒温箱放置30 min，再次洗板4次，显色终止。应用美国BIO-RAD公司酶标检测仪测各孔吸光度(A)值，用Curve expert 1.3软件，计算样本浓度。

大鼠心肌组织肌钙蛋白I和血管内皮生长因子的表达：采用免疫组化SP法。常规制备心肌组织切片，经脱蜡、柠檬酸修复和体积分数3%双氧水孵育后滴加正常山羊血清工作液封闭，滴加1∶100稀释的一抗肌钙蛋白I和血管内皮生长因子，阴性对照滴加磷酸盐缓冲液；4 ℃过夜，37 ℃复温后滴加生物素化的二抗(生物素标记的山羊抗大鼠IgG)，于37 ℃孵育后滴加辣根酶标记的链霉卵白素，37 ℃孵育，二氨基联苯胺工作液显色，苏木精复染，盐酸乙醇分化，氨水泛蓝，脱水、透明后中性树胶封固。应用LEICA倒置显微镜观察，心肌细胞胞浆中出现棕黄色颗粒状物为肌钙蛋白I或血管内皮生长因子阳性，正常心肌组织呈肌钙蛋白I强阳性、血管内皮生长因子弱阳性表达；对阳性部位行灰度检测，每张阳性片取5个部位分别检测，计算平均灰度值。

主要观察指标：大鼠血清血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子1、肝细胞生长因子、粒-巨噬细胞集落刺激因子及心肌组织肌钙蛋白I和血管内皮生长因子表达。

统计学分析：统计学处理者为王思平，采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。计量资料采用x(_)±s表示，多组定量资料用单因素方差分析，多组间定量资料两两比较用LSD检验，同一组数据前后比较用配对资料t 检验。以P < 0.05表示差异有显著性意义。

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讨论

间充质干细胞在体外经诱导可分泌多种调节和营养因子，包括生长因子、细胞因子、趋化因子等，这些因子可通过旁分泌机制介导心肌修复^[18] ，包括促进新生血管形成、抑制纤维化重塑、抑制细胞凋亡及趋化组织干细胞并刺激其进行有丝分裂，或者减少炎症氧化应激反应等^[19] ；通过灌注细胞因子或干细胞的条件培养基也可提高心肌功能，促进心肌修复，进一步支持间充质细胞旁分泌机制的存在^[20] 。
已证实，人脐带间充质干细胞在体外培养过程中可分泌粒-巨噬细胞集落刺激因子、血管内皮生长因子、肝细胞生长因子及胰岛素样生长因子等^[21-22] 。血管内皮生长因子是内皮细胞特异性的血管生成因子，在血管生成过程中起关键的调节作用，可刺激内皮细胞增殖、迁移，增加血管的渗透性，扩张血管^[23] 。已经证实，血管内皮生长因子是人脐带间充质干细胞修复心肌损伤过程中分泌的关键因子^[24] ；在生理条件下血管内皮生长因子广泛分布于人体各个器官，且不导致广泛的新生血管形成；但在病理条件下，血管内皮生长因子信使核糖核酸表达会有所增加。多项研究显示，无论在体内还是体外，缺氧都是刺激血管内皮生长因子基因表达的至关重要的因素^[25-26] 。在急性心肌缺血和心肌组织缺氧发生时，一系列的细胞因子分泌增加，促进炎症反应，影响组织修复，其中血管内皮生长因子就是一个由缺氧细胞分泌的强有力的促进血管内皮细胞生长的因子。在缺氧24 h，心肌组织的血管内皮生长因子显著提高，在恢复氧供后24 h血管内皮生长因子降至正常^[27] 。在1项兔心肌梗死的模型中发现^[28] ，梗死心肌中血管内皮生长因子信使核糖核酸在梗死后7 d达到高峰，在28 d时降至与假手术组同一水平；且外周血中血管内皮生长因子亦有同样的升降趋势，而假手术组无明显变化，因此血管内皮生长因子可能参与了调节由缺氧和梗死造成的自发性血管形成。另外，血管内皮生长因子还可动员机体血管内皮祖细胞参与心肌损伤的修复。在大鼠心肌梗死模型中，处理组通过心外膜注射骨髓间充质细胞，对照组注射培养基，4周后骨髓间充质细胞组心肌组织中血管内皮生长因子表达显著高于对照组^[29] 。血管内皮生长因子是脐带间充质干细胞治疗心肌损伤过程中分泌的关键因子^[24] 。肌钙蛋白I是心肌细胞胞浆内的特异性抗原，在正常心肌组织中肌钙蛋白I均匀分布；在心肌损伤时，肌钙蛋白I易从心肌细胞中释放入血^[30] 。经心内膜注射人脐带血来源的非限制性成体干细胞给心肌梗死裸鼠模型，可在梗死周围心肌组织中检测到干细胞分化的、表达肌钙蛋白I的成熟心肌细胞^[31] 。但对于正常大鼠人脐带间充质干细胞治疗是否影响心肌组织血管内皮生长因子和肌钙蛋白I的过度表达，尚不清楚。本实验结果显示，正常大鼠在肌肉注射人脐带间充质干细胞或其细胞培养上清液8周后，血清中血管内皮生长因子浓度和心肌组织血管内皮生长因子、肌钙蛋白I的表达差异均无显著性意义，提示肌肉注射人脐带间充质干细胞或其细胞培养上清液不会引起正常大鼠心肌组织血管内皮生长因子和肌钙蛋白I的过度表达，即不引起正常大鼠心肌组织内广泛的新生血管形成和心肌细胞的过度增生。
间充质细胞可分泌具有协同性的大量营养性因子，活化内源性干细胞修复机制，产生更为持久的治疗效果^[32-33] 。肝细胞生长因子可通过抗凋亡、动员干祖细胞、促进有丝分裂及抗心肌纤维化产生心肌保护作用^[34] ，在心肌病及心力衰竭大鼠心肌中肝细胞生长因子含量较正常大鼠心脏显著下降^[34] 。心肌纤维化是心衰进展的主要因素，避免纤维化是治疗心力衰竭的关键目标。将肝细胞生长因子基因导入心肌病大鼠心肌组织，通过抑制转化生长因子β的表达进而达到抗心肌纤维化的目的，可以显著提高心功能^[35] 。给异丙肾上腺素诱导的心力衰竭大鼠心肌内注射间充质细胞，4周后心肌肝细胞生长因子信使核糖核酸和肝细胞生长因子蛋白表达均增加，Ⅰ，Ⅲ型胶原蛋白、基质金属蛋白酶2和9均减少，提示肝细胞生长因子可以显著缓解心力衰竭大鼠的心肌纤维化进展^[36] 。在心肌梗死和心衰的早期，血浆中肝细胞生长因子浓度会有所升高，说明肝细胞生长因子有心肌保护作用及参与心肌细胞再生^[37] 。这些结果提示间充质细胞来源的肝细胞生长因子可以通过抑制心肌纤维化作用起到抗心力衰竭的作用。同时，肝细胞生长因子与血管内皮生长因子可协同诱导新生血管生成。胰岛素样生长因子与其受体结合后可产生多种生物学作用，可促进心肌生长、发育及分化，抑制细胞凋亡，减弱心力衰竭心肌的细胞外基质重塑^[38] 。胰岛素样生长因子的心脏保护作用主要体现在刺激心肌细胞生长及加强其收缩功能^[39] 。胰岛素样生长因子1还是一个潜在的诱导血管生成的生长因子。许多研究表明，胰岛素样生长因子1促进新生血管形成的作用与促进血管内皮生长因子表达升高有关^[40] 。胰岛素样生长因子1是内皮细胞迁移的潜在激活剂，是血管平滑肌细胞的强效有丝裂剂和抗凋亡剂^[41] 。动物实验证实胰岛素样生长因子1可以使扩张性心肌病模型的血流动力学恢复正常，心肌细胞参数，如心肌细胞体积和直径等恢复正常^[42] 。动物模型证实骨髓间充质细胞心肌内移植可以增加梗死周围区域胰岛素样生长因子1的表达^[43] 。外周血胰岛素样生长因子1水平异常与心脏疾病相关，比如急性心肌梗死、冠状动脉粥样硬化等，血清胰岛素样生长因子1降低是预测发生心源性死亡的独立危险因素^[44] ；给心力衰竭仓鼠肌注骨髓间充质细胞或其条件培养基后1个月，仓鼠外周血中肝细胞生长因子、巨噬细胞集落刺激因子增加^[45] 。肝细胞生长因子、粒-巨噬细胞集落刺激因子和血管内皮生长因子等均可动员骨髓干祖细胞，使血循环中c-kit、CD31和CD133阳性骨髓干祖细胞水平升高，而迁移的干祖细胞可入住心肌，使心肌内c-kit阳性祖细胞增加，从而参与内源性心肌损伤修复机制。这种迁移信号级联反应可进一步活化心肌表达肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子和血管内皮生长因子基因，进一步增进间充质干细胞与心肌组织的联系^[46] 。但对于正常大鼠肌肉注射人脐带间充质干细胞是否影响血清中肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子及粒-巨噬细胞集落刺激因子浓度，尚不清楚。
本实验结果显示，正常大鼠肌注人脐带间充质干细胞或其细胞培养上清液8周后，血清中肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子1及粒-巨噬细胞集落刺激因子浓度均无显著变化，提示肌注人脐带间充质干细胞或其细胞培养上清液不会引起正常大鼠血清中肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子及粒-巨噬细胞集落刺激因子浓度的显著变化，从而不会因诱发正常心肌组织内源性心肌干细胞活化而导致心肌组织的过度增生。
实验科研设计的不足在于没有观察心、肝、肾、脾等组织在实验的终点有无异种脐带间充质干细胞存在。

肌肉注射异种脐带间充质干细胞大鼠心肌肌钙蛋白I及血清相关因子的表达

Effects of intramuscular injection of heterogeneous umbilical cord mesenchymal stem cells on myocardial cardiac troponin and serum-related factors in rats

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[1]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[2]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[3]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[4]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[5]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[6]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[7]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[8]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[9]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
[10]	焦慧, 张一宁, 宋雨晴, 林宇, 王秀丽. 乳腺癌类器官研究进展及临床应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1122-1128.
[11]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[12]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[13]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.
[14]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[15]	史洋洋, 秦英飞, 吴福玲, 何潇, 张雪静. 胎盘间充质干细胞预处理预防小鼠毛细支气管炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 991-995.