二袖套法大鼠肝移植已成为大鼠肝移植的标准术式，被广泛应用于肝移植的基础研究。大鼠原位肝移植手术难度大，技巧性高，术者需要大量的时间进行专门的训练方可建立稳定的大鼠肝移植模型。在进行DA至Lewis大鼠肝移植模型建立前，课题组先采用大量的SD至SD大鼠进行肝移植模型建立训练，根据DA和Lewis大鼠的特点，本实验对部分技术环节进行了改良，取得了较好结果。具体将实验所获取的经验讨论如下。
3.1 DA至Lewis大鼠肝移植模型建立的特点 国际公认的大鼠肝移植急性排斥反应模型的经典鼠种是DA大鼠作为供体，Lewis大鼠作为受体[6-7]，目前国内较少使用这两种大鼠进行原位肝移植模型的建立，原因可能在于：①这两种大鼠售价高，实验成本上升。②这两种大鼠均为近交系大鼠，对大型手术打击的耐受能力明显低于封闭群大鼠(如SD大鼠)。③大鼠肝移植模型建立的技术难度大，需要经长期大量的反复训练，该技术掌握的熟练程度较国外尚有差距。根据实验的自身特点，要求使用雄性DA至雄性Lewis大鼠进行肝移植模型建立，这就对大鼠肝移植模型的建立提出了挑战，因此课题组使用了多达100对的SD大鼠进行肝移植训练，在熟练掌握该技术的基础上，又采用20对DA至Lewis大鼠肝移植手术来摸索近交系大鼠移植模型建立的特点，通过大量的训练方可建立稳定的雄性DA至雄性Lewis大鼠肝移植模型，为后期实验的顺利进行奠定基础。
从该移植模型获得的部分经验是：①供受体体质量选择需合理，作为供体，雄性DA大鼠的体质量最好限定在200~250 g，低于200 g的雄性DA大鼠出入肝管道过细，操作困难，高于250 g的雄性DA大鼠脂肪肝的发生率高，易出现移植肝无功能，受体雄性Lewis大鼠的体质量限定于250~300 g，该体质量区段的雄性Lewis大鼠活力强，对大手术打击的耐受能力较好。②严密监测受体大鼠的麻醉深度，由于近交系大鼠的活力较差，在无肝期特别易出现麻醉加深，抢救成功率低，必须保证无肝期大鼠的呼吸及心跳有力。③缩短受体手术时间，特别是无肝期时间是手术成功的关键，作者体会到雌性Lewis大鼠对无肝期的耐受能力明显低于SD大鼠，无肝期超过18 min，全手术时间超过1 h，大鼠术后很难长期存活，经过大量训练我们的受体手术时间(35.0±7.3) min，无肝期为(13.0±3.0) min，手术成功率为98%，1周存活率为91.6%。④术中补液纠酸，术后复温明显影响雌性Lewis受体大鼠的存活。
3.2 二袖套法在DA至Lewis大鼠肝移植模型建立中的技术改进 正是因为DA和Lewis大鼠属于近交系大鼠，活力差，对手术打击的耐受能力差，要建立稳定的移植模型就必须在封闭群大鼠移植模型建立的技术基础上有所改进，除了必备的熟练显微血管缝合技术以外，还要对供肝灌注、保存、减少术中失血及术中补液方式进行改良。
正确的原位供肝灌注：供肝灌注的首要任务是保证灌注的均一性和彻底性，这一点在近交系大鼠肝移植术后保持良好的肝功尤为重要。模型建立的初期，发现即使轻微的原位供肝翻动，都会压迫局部肝组织而造成机械性损伤和微血栓形成，使得供肝灌注不良，供肝移植血液复流后可发现供肝局灶性出血和灌注不佳，影响移植成功率。实验中为了充分暴露视野，将腹部十字切口的横切口向两侧延伸至大鼠的腋后线，获得肝脏及腹后壁血管的充分暴露。先进行腹主动脉穿刺插管，剪破心脏放血，做到不翻动肝脏就可以进行肝脏双重灌注，对肝脏迅速降温处理，热缺血时间基本为0，供肝灌注完毕后才进行供肝的操作，一般会看到供肝灌注均匀，质地柔软。供肝灌注时一般采用手动推注进行，但须掌握推注压力，本实验采用5号针头穿刺腹主动脉进行灌注，本身就由于针头内径较细对灌注的流速和压力客观上进行了控制，保证以不大于5 mL/min的速度匀速灌注，灌注的总量不需刻意控制，只要达到肝脏变为均匀的土黄色即可，一般正确灌注5~10 mL灌注液即可完成肝脏的灌注。
左膈静脉、肾上腺静脉及腰静脉的正确处理经验：在移植模型建立的初期训练阶段，导致大多数的受体术中及术后短期内死亡的主要原因是腹腔出血，当然肝上腔静脉吻合口出血是最主要因素，但左膈静脉出血和肾上腺静脉出血以及肾上腺静脉水平的腰静脉出血也不容忽视，得益于临床肝移植的长期训练，血管显微吻合技术得到保证，肝上腔静脉吻合口出血发生概率低，相应其他3处静脉的出血成了模型建立初期阶段受体大鼠短期内死亡的主要原因。开始时，对受体的左膈静脉也采取两侧结扎、中间剪断的方法，但随着对大鼠肝脏的翻动，此处的结扎线头极易脱落，造成大鼠术中死亡，后来在受体大鼠自身肝切除的过程中采用单扎左膈静脉，出入肝血流阻断后切肝时才剪断该静脉的做法，将因左膈静脉出血引起受体大鼠术中死亡的发生率降低为0。在肝下下腔静脉袖套吻合的过程中经常发现吻合后该处的腹后壁易发生出血，经过仔细解剖此处的腔静脉后壁，作者发现有一两支管径约0.5 mm的腰静脉在此处汇入腔静脉，在供受体操作的过程中，对此处采用了经腔静脉后一次性结扎右肾上腺静脉和腰静脉的改良术式，简化了手术步骤，降低了该处出血的发生率。
受体空气栓塞预防的重要性：在完成50例SD大鼠肝移植模型建立训练手术后，仍时有发现大鼠的不明原因术后2 h内死亡，通过尸检发现大鼠左心室有少量泡沫状气体，考虑供肝内少量的残余气体随血流进入左心室引起左室输出量持续减少，导致大鼠短期内死亡。因此除了常规肝上腔静脉吻合完成前腔内注液排气外，在门静脉套管前，从门静脉袖套管管腔内注入2.0~3.0 mL生理盐水，一方面再次驱除肝内残余气体，一方面驱除肝内富含肝素的灌注液，有利于大鼠移植后凝血功能恢复，减少吻合口出血机会。在开放门静脉后，暂不同时开放肝上腔静脉，等待少量血液及肝内残余气体从供体肝下腔静脉排出，立即使用血管夹夹闭肝下腔静脉开口，阻止出血和腔静脉气栓产生，随后开放肝上腔静脉，彻底预防移植后气栓的产生，并减少由肝脏内低温血液突然回心引起心跳骤停的发生率。
补液成分及途径选择的重要性：肝移植的创伤大，手术时间长，大鼠失血1.0~2.0 mL即可出现失血性休克，近交系大鼠对术中失血的耐受能力更差，因此适当的补液对于顺利度过围手术期很重要。在切除受体肝脏前应于门静脉内注入生理盐水2 mL驱血，实现“自体输血”，达到补充血容量的目的。在肝下下腔静脉袖套吻合完成后，迅速静脉推注含碳酸氢钠的盐水2.0~3.0 mL，可以及时纠正高钾、酸中毒状态，改善微循环，有效防止血栓形成，对于术后的血液动力学稳定非常重要。在实验中发现肝移植手术结束前，由于大鼠经受重大手术打击，往往外周静脉塌陷，经尾静脉补液操作存在困难，术后经阴茎背静脉补液容易引起该处岀血，肝移植手术完毕时受体大鼠凝血功能差，使用阴茎背静脉局部压迫较难止血，且此处又不宜缝扎止血，处理该处静脉穿刺点岀血往往会影响受体大鼠术后的及时恢复。从右下腹后壁腰静脉补液在实际操作中可行，此处的腰静脉因与下腔静脉直接相通，通常充盈好，内径可达1.0~2.0 mm，可穿刺长度达2.0~3.0 cm，作者采用先缝扎静脉的远心端，再在预定穿刺点的近心端预先缝一针，暂不打结，待穿刺补液完成后再迅速结扎，操作熟练后可有效控制穿刺点出血，完成术中补液。作者体会到无肝期结束后补液纠酸极为重要，补液充分到位的大鼠可见呼吸加快，肝脏颜色由暗红转为鲜红，肠管血管搏动有力，肠管颜色红润，胆汁分泌旺盛。
3.3 他克莫司在DA对Lewis大鼠肝移植急性排斥反应模型围手术期短期应用的价值 在建立DA至Lewis大鼠肝移植急性排斥反应模型的预实验阶段，发现近交系大鼠肝移植术后早期易因腹腔出血、门静脉吻合口血栓形成、移植肝无功能、腹腔及肺部感染、急性排斥反应及心肺功能衰竭等出现死亡，如果不经过特殊处理，大鼠肝移植急性排斥反应模型的术后受体死亡时限多集中在1周内，死亡的原因多为上述因素叠加的结果，不易将急性排斥反应所致死亡和其他原因所致死亡区分开来，影响实验结果的可靠性。本实验采用移植术前1 d及术后1周内饲喂治疗剂量的他克莫司，1周后逐渐减药的短期免疫抑制方案，在选择用药方案时既要兼顾有效的免疫抑制又要避免过度的免疫抑制，作者采用的是与人类肝移植术后他克莫司治疗剂量相同的用药方案[17]，术后1周内使用治疗剂量的他克莫司是为了保障受体大鼠平稳渡过生存质量较差的该时段，经观察术后1周后仍然存活的大鼠，其活力明显增强，术后1周后逐日半量减药有利于所有受体大鼠平稳诱发急性排斥反应，于术后2周完全撤出他克莫司对移植肝脏的保护作用，确定了受体大鼠急性排斥反应发生的大致起始时段。在本实验中，受体大鼠移植术后短期他克莫司治疗并撤药后，迅速于术后14 d后出现肝脏汇管区周围淋巴细胞、中性粒细胞浸润，肝内血管内膜炎，毛细胆管上皮细胞坏死变形，弥漫性肝细胞肿胀坏死，病理学诊断考虑急性排斥反应出现，且随着术后时间的延长排斥反应变得典型和加重。动态分析RAI评分，也可以看出术后7 d (RAI=1.9)未出现排斥反应，术后14 d (RAI=3.7)出现了交界性的排斥反应，术后21 d (RAI=6.3)出现了中等程度的排斥反应，术后28 d (RAI=8.1)出现了严重的排斥反应，排斥反应的程度是随着术后时间的延长逐渐加重的，在本实验的实验条件下，他克莫司撤药后大鼠出现急性排斥反应并因此而死亡的时限大致为7~ 14 d，与文献[18-22]对比该时限略显延长，可能与术后早期使用他克莫司影响了移植排斥反应的进程有关。但从总的分析来讲，本实验建立DA至Lewis大鼠肝移植模型，在撤出他克莫司后诱发了急性排斥反应，其实验结果较不使用他克莫司肝脏保护的急性排斥反应模型更为可靠，是近交系大鼠肝移植急性排斥反应模型的一种改良方式。
总之，在进行技术改良后，采用二袖套法成功建立了DA至Lewis大鼠肝移植模型，并在特定的条件下观察到受体移植术后肝脏的急性排斥反应，为后继研究提供了稳定的动物模型。
