2.1  “龟板-鹿角”药对活性成分及其治疗骨质疏松症靶标基因检索结果  通过BATMAN-TCM、TCM-MESH、化学专业数据库分别检索，共获得龟板活性成分12个、鹿角活性成分2个，查阅相关龟板、鹿角药理学研究文献^[32-38]，补充龟板活性成分7个、鹿角活性成分28个，剔除彼此重复的成分，获得“龟板-鹿角”药对活性成分32个，包括天冬氨酸(Aspartic Acid)、苯丙氨酸(Phenylalanine)、磷酸氢钙(Calcium Phosphate)等。将获得的32个活性成分分别输入TCM-MESH平台检索其作用靶点，其中11个活性成分无靶点，基于活性成分与作用靶点彼此对应的原则予剔除上述无靶点的活性成分，最终获得“龟板-鹿角”药对活性成分21个，对应的作用靶点共1 735个。各方式检索龟板、鹿角活性成分及其对应活性成分数量结果见表1。

通过毒理组学比较数据库、GeneCards等数据库分别检索获取骨质疏松症治疗作用靶点，并与获得的“龟板-鹿角”药对活性成分作用靶点取共交集，最终得到“龟板-鹿角”药对活性成分治疗骨质疏松症靶标基因183个，对各数据库获取的交集信息以韦恩图(Venn Diagram)形式呈现，见图1。

2.2  药对-活性成分-靶标基因网络构建结果可视化  将获得的“龟板-鹿角”药对治疗骨质疏松症作用靶标基因共183个输入至STRING网站，根据前述的设置条件运行基因蛋白互作分析，下载保存分析结果，并将TCM-MESH获得的“龟板-鹿角”药对活性成分及其作用的靶标基因信息整合，导入至Cytoscape 3.6.1软件，构建“龟板-鹿角”药对-活性成分-靶标基因网络，以图形可视化形式呈现，结果见图2。

2.3   核心基因互作关系网络构建结果可视化  将STRING网站对183个靶标基因互作关系分析结果单独导入至Cytoscape 3.6.1软件，使用CytoHubba插件对靶标基因进行Degree值计算，选取Degree值最高的前10位为核心基因，并将核心基因与其他非核心基因之间的互作关系网络以图形可视化呈现，结果见图3。经计算，“龟板-鹿角”药对治疗骨质疏松症核心靶标基因按照Degree值从高到低排列，前10位依次为INS(104)、ALB(93)、AKT1(83)、IL-6(81)、TNF(74)、TP53(72)、IGF1(71)、EDN1(70)、FOS(69)、EGFR(67)。

结果显示，183个靶标基因共富集于670个功能注释过程，其中66个具有统计学差异，按照P 值从小到大排列，以柱状图形式呈现排名前10位的功能注释过程，见图4。

2.5  靶标基因通路富集分析  KOBAS网站KEGG分析结果显示，“龟板-鹿角”药对治疗骨质疏松症靶标基因共富集在126条通路，最终筛选获得27条通路具有统计学差异(P < 0.05)。将P值从小到大排列，获得其中排名前20的富集通路，包括缺氧诱导因子1信号通路、环磷酸腺苷信号通路、卵巢类固醇生成、雌激素信号通路、促性腺激素释放激素信号通路等，将排名前20的信号通路富集结果以图形可视化呈现，见图5。

2.6  分子对接评估结果  在靶标基因互作网络中，Degree值最高的前5位核心基因分别为INS、ALB、AKT1、IL-6及TNF，分别将该5个核心基因与其对应的活性成分输入至SwissDock进行分子对接验证，结果见表2。结果显示，核心基因INS分别与丙氨酸、雄激素、精氨酸、谷氨酸，ALB与丙氨酸、雌激素获得较高的对接分数，分值均高于7分，对接亲和力较好；丙氨酸、谷氨酸、雄激素等成分与多个核心基因存在互作关系，对接评估提示分子间亲和力较好。

骨质疏松症是临床常见的老年性、全身性、代谢性骨病，以骨组织微结构的破坏，骨量降低、骨质脆性增加、骨折风险增加等为其特征^[1]，随着中国社会老年化发展，骨质疏松及骨质疏松性骨折发生率不断上升^[2]，严重影响老年人口日常生活质量^[3]。骨质疏松症已成为国内三大重点攻关研究老年疾病之一^[4]。

骨质疏松症发生的根本机制在于成骨细胞-破骨细胞耦联的骨稳态平衡紊乱^[5]，目前临床治疗骨质疏松症的药物主要有骨形成促进剂、骨吸收抑制剂以及骨矿物剂3类，如雷尼酸锶、特立帕肽、双膦酸盐、钙剂等药物，但这些药物存在特异性低、费用较高、有明显副反应等问题^[6]。

中医药防治骨质疏松症历史悠久，骨质疏松症在中医接近于“骨萎”“骨痹”，以腰背不举，骨枯而髓减等为表现，根据“肾主骨”“肾藏精，精生髓，髓养骨”“年高之人，筋骨柔弱无力，多因肾气虚”等中医经典理论经验，骨质疏松症的临床治疗常以补肾益精为基本大法^[7]。研究表明，经典补肾中药龟鹿二仙胶治疗骨质疏松症临床疗效明确^[8]，并有促进Ⅰ型胶原形成、诱导骨髓干细胞成骨分化、抑制破骨细胞骨吸收等作用^[9-11]。中药方剂组分多，作用机制复杂，逐一对具体成分进行实验以验证其作用机制需消耗大量资源。网络药理学方法通过对方剂中活性成分进行计算分析，预测其作用靶点及机制，使实验研究更加精确，帮助从分子水平明确中医药发挥疗效的作用机制^[12-14]。

“龟板-鹿角”药对是龟鹿二仙胶、左归丸等经典补肾方剂发挥治疗作用的核心，药对配伍作用往往复杂而作用明显，优于单味药的使用。此次研究采用网络药理学方法，分析“龟板-鹿角”药对有效活性成分及其治疗骨质疏松症的作用靶点，建立成分-疾病-靶点网络，并对靶点进行生物过程、通路富集、分子对接等分析，探究经典补肾药对“龟板-鹿角”活性成分抗骨质疏松症的潜在分子机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  生物信息学实验。

1.2  时间及地点  于2019年9至12月在南京中医药大学骨伤修复与重建新技术实验室完成。

1.3  “龟板-鹿角”药对活性成分与作用靶点获取  采用中药系统药理学成分分析平台BATMAN-TCM (http://bionet. ncpsb.org/batman-tcm/)、TCM-MESH数据库(http://mesh.tcm.microbioinformatics. org/)、中国科学院上海有机化学研究所化学专业数据库(http://www. organchem.csdb.cn)对“龟板-鹿角”药对活性成分进行检索预测，并手工检索文献报道的龟板、鹿角活性成分进行补充。于TCM-MESH数据库输入获得的活性成分名称，对其作用靶点进行预测，最终获得“龟板-鹿角”药对活性成分及其作用的疾病靶点。BATMAN-TCM、TCM-MESH是中药分子机制生物信息学在线分析工具，可用已经实验验证的化学成分与目标成分进行互作交叉验证以预测中药活性分子成分^[15-16]，并定位活性成分的目标靶点；化学专业数据库是中科院上海有机化学研究所自主开发的平台，涵盖化药、中药等药物的化合物结构、药理毒理作用等信息。

分别在BATMAN-TCM、TCM-MESH、化学专业数据库中以龟板、鹿角及其不同炮制方式药物(如炙龟板、鹿角胶等)的拼音名(“GUI BAN” “GUI BAN JIAO” “ZHI GUI BAN”“LU JIAO”“LU JIAO JIAO”“LU JIAO SHUANG”)、英文名(Tortoise plastron、Gelatin of Tortoise plastron、Prepared Tortoise plastron、Chinemys reevesii、Deer Horn、Gelatin of Buckhorn、Degelatined Deer-horn)、拉丁名(Plastrum Testudinis、Colla carapacis et plastri testudinis、Carapax Et Plastrum Testudinis、Plastrum Testudinis Praparata、Pulvis Cornu Cervi、Cornu Cervi、Cornu Cervi Degelatinatum)为检索词，“Herb”(中药)为检索形式，在各数据库检索龟板、鹿角的活性成分，并与手工查阅的文献中记载的龟板、鹿角活性成分汇总。

于TCM-MESH平台输入各活性成分英文名称，按照系统默认设置P < 0.05为有效靶点置信区间，运行检索并获得“龟板-鹿角”药对活性成分作用的疾病靶点信息，下载保存整理数据。

1.4   骨质疏松症靶标基因获取  采用毒理组学比较数据库、人类基因数据库(GeneCards，https://www.genecards. org/)2个汇集大量人类遗传、转录、翻译蛋白等基因组数据及药物化合分子与疾病表型作用靶点关系的大型公共数据库^[17-18]，以“Osteoporosis”(骨质疏松症)为关键词，通过大数据检索获得骨质疏松疾病治疗作用靶点信息，下载保存整理数据。

1.5  药对-活性成分-靶标基因网络构建与分析  将从TCM-MESH获得的“龟板-鹿角”药对活性成分有效作用靶点，与毒理组学比较数据库、GeneCards数据库获得的骨质疏松症靶标基因共同进行比对分析，取得交集基因，为最终获得的“龟板-鹿角”药对治疗骨质疏松症潜在作用靶标基因。

采用在线基因蛋白互作关系分析工具STRING (https://string-db.org/)进行靶标基因的蛋白互作关系网络构建^[19]。在STRING网站选择“Multiple Proteins Search”，输入最终获得的全部靶标基因，限定物种为“Homo sapiens”(人类)，运行分析，分析结果以TSV格式保存下载。将STRING分析结果与已获得的“龟板-鹿角”药对活性成分及其治疗骨质疏松症靶标基因数据进行整理分析，导入至图形网络可视化分析软件Cytoscape 3.6.1进一步分析，构建“龟板-鹿角”药对-活性成分-骨质疏松症靶标基因网络，对生物分子信息及其相互作用通过力导向算法以网络图形式可视化^[20-21]。

1.6  核心靶标基因互作网络构建与分析  核心基因是在疾病治疗的生物学过程发挥重要作用，并且可能在多个相关通路调控多基因发挥多靶点作用的靶标基因^[20]。将在线分析工具STRING获得的靶标基因互作关系分析结果单独导入至Cytoscape 3.6.1，使用Cytoscape 3.6.1软件库插件CytoHubba分析靶标基因中的核心基因。CytoHubba可基于网络拓补结构进行核心靶标基因分析^[22]，以靶标基因连接度(Degree)值为核心基因分析算法，筛选出Degree值最高的前10位核心基因，并对核心基因与其他靶标基因进行互作网络构建与分析。

1.7  基因本体论分析和通路富集分析  基因本体论(Gene Ontology，GO)是遗传信息学、生物信息学领域广泛用于描述基因产物功能注释及分类的系统，主要包括分子功能、细胞组成以及生物过程3个部分^[23]。京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)，是从分子信息水平了解细胞、生物、生态系统的功能，由大量基因组高通量测序数据组成的大型数据库，可通过数据计算提供基因在生物学过程的通路富集信息^[24]。

此次研究使用公认的基因蛋白生物信息整合与分析在线数据库DAVID Bioinformatics Resources 6.8(https:// david.ncifcrf.gov/home.jsp)进行“龟板-鹿角”药对活性成分治疗骨质疏松症靶标基因的GO生物学功能注释分析^[25]，使用在线分析工具KOBAS 3.0(http://kobas.cbi. pku.edu.cn/ index.php)进行靶标基因的KEGG通路富集信息分析^[26]。分别在DAVID、KOBAS网站输入靶标基因，设置物种为“Homo sapiens”(人类)，运行分析，将分析结果以Excel格式保存下载，整理筛选结果，以基因富集统计检验P < 0.05认为该基因功能注释或通路富集结果具有统计学意义。

1.8  分子对接评估结合潜力  利用在线分子对接平台SwissDock(http://www.swissdock.ch/)进行分子对接以验证目的分子间的结合潜力^[27-28]。从在线数据库UniProt (https://www. uniprot.org/)获取目的分子的PDB ID^[29]，限定物种为“Homo sapiens”(人类)，分别将待测试的分子输入至SwissDock，运行对接评估，获得对接分数。对接分数提示分子间结合潜力，分数越高则结合亲和力越强^[30-31]。该研究对靶标基因互作网络中Degree值最高的5个核心基因与其互作的活性成分进行分子对接验证。

3.1  “龟板-鹿角”药对抗骨质疏松症作用存在复杂网络关系  骨质疏松症严重影响中老年人日常生活，一旦发生骨质疏松性骨折常带来致命性打击。中医提倡“未病先防、既病防变”的治未病理念，根据骨质疏松症的发病机制、脏腑辨证，肾虚是其基本病机^[39]，运用补肾中药辨证论治，防治骨质疏松症有着丰富的理论与实践基础。但从现代医学的微观分子机制层面，方剂中各味中药发挥具体治疗作用的分子机制可能并不相同，明确中药具体成分治疗骨质疏松症的作用机制，精准化运用以发挥中医药的治疗作用，方能更好地传承发展中医药。该研究以经典补肾中药方剂龟鹿二仙胶中核心药对“龟板-鹿角”为研究对象，运用网络药理学研究方法，探究分析其所含药物活性成分治疗骨质疏松症的分子机制。

龟板为龟科动物的腹甲及背甲炮制而成，咸、甘，微寒，归肝、肾、心经；鹿角为鹿科动物马鹿、梅花鹿已骨化的角或脱落的角基，味咸，性温，归肾、肝经；此两药均为“血肉有情之品”，具有强筋壮骨、滋阴潜阳之功效，二者共为龟鹿二仙胶之君药。该研究借助BATMAN-TCM、TCM-MESH、化学专业数据库等收录中药分子信息的数据库，结合手工查阅药理学专业文献，筛选获得“龟板-鹿角”药对的21个已有明确作用靶点的活性成分。这21个活性成分可分为氨基酸、成骨激素及矿物质3类。氨基酸类包括天冬氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、牛磺酸等14个，成骨激素主要包括雌激素、雄激素、硫酸软骨素A等，矿物质主要有磷酸氢钙、碳酸钙2个物质。多项研究表明，“龟板-鹿角”药对的多个活性成分与调控成骨-破骨的骨稳态代谢平衡相关。如抗氧化剂牛磺酸被认为具有调控骨髓间充质干细胞成骨分化的作用^[40]，雌激素、雄激素的缺乏是骨质疏松症发生的一个重要因素^[41]，钙磷等矿物元素更是机体骨代谢平衡的重要底物。

研究结果提示，“龟板-鹿角”药对的21个活性成分共作用于INS、TNF等183个抗OP靶标基因，主要富集于27条信号通路、66个生物学过程，活性成分-靶标基因-信号通路/生物学过程之间形成复杂的网络联系。

从图2的药对-活性成分-靶标基因蛋白互作关系图可知，“龟板-鹿角”药对活性成分中丙氨酸、雄激素、精氨酸、雌激素、谷氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸等均作用于10个以上的靶标基因，磷酸氢钙、硫酸软骨素A、碳酸钙等成分也具有作用于多个靶标基因的表现。在靶标基因中，INS、ALB、FOS等基因同时受多个活性成分调控作用影响，另一方面INS、TNF、EDN1等核心基因亦同时与多个靶标基因互相作用，从图3的核心基因蛋白互作关系图可进一步了解核心基因的广泛联系作用。以上结果提示“龟板-鹿角”药对活性成分之间可能存在协同调控靶标基因的作用，各靶标基因间亦存在彼此协同或拮抗的联系作用，活性成分可能通过调控核心基因以激活或抑制多个相关信号通路，“龟板-鹿角”药对抗骨质疏松症机制具有多成分、多靶点、多通路作用的特点。

3.2  靶标基因富集通路联系密切复杂  根据靶标基因富集的KEGG通路结果分析，靶标基因主要富集于126条分子信号通路，其中有27条检验具有较明显统计学意义。机体的各种组织、细胞、生物因子之前存在巨大的信号通路调控网络，互相协作或抑制以发挥相应功能，这与中医核心理念之一的“整体观念”不谋而合。

“龟板-鹿角”药对可能通过调控细胞增殖凋亡、炎症反应、性激素水平相关等通路发挥治疗骨质疏松症的作用：①细胞增殖凋亡：成骨细胞-破骨细胞耦联的骨吸收-骨重建动态平衡是骨质疏松症发生与治疗的关键点，缺氧诱导因子1信号通路、转化生长因子β信号通路等与成骨细胞、破骨细胞的增殖分化凋亡密切相关。缺氧诱导因子1具有活化破骨细胞的作用，骨质疏松症患者雌激素的缺乏可使机体降低抑制缺氧诱导因子1活化破骨细胞的作用，增加骨吸收，加重骨质疏松症发展^[42-43]；转化生长因子β具有调控前体细胞向成骨细胞分化、抑制破骨细胞活性的作用，是骨质疏松症治疗研究的重要通路^[44]。②炎症反应调控：肿瘤坏死因子信号通路介导的慢性炎症相关骨重建过程是骨质疏松症治疗的重要途径^[45]，研究认为肿瘤坏死因子α能促进RANKL诱导的破骨细胞形成从而导致绝经后骨质疏松症的发生^[46]，核心基因TNF、IL-6等是重要的炎症介导因子，通过沟通TNF与RANK/RANKL/OPG信号通路的信号转导，调控骨吸收-骨重建平衡^[47-48]。③性激素相关：雌激素、雄激素缺乏是骨质疏松症发生的重要诱因，性激素缺乏可能活化破骨细胞功能、抑制成骨细胞增殖分化，“龟板-鹿角”药对活性成分不仅包括雌激素、雄激素，直接补充机体性激素，靶标基因中的表皮生长因子、丝裂原激活的蛋白激酶1等均富集于雌激素信号通路或雄激素信号通路，有发挥多信号通路级联作用治疗骨质疏松症的可能^[49]。“龟板-鹿角”药对治疗骨质疏松症的靶标基因富集通路还包括钙离子信号通路、Wnt信号通路等经典的调节骨稳态平衡的通路，且不同通路及通路中的关键靶标基因之间存在复杂的协同/抑制调控作用，并涉及免疫、循环等多个系统。

“龟板-鹿角”药对治疗骨质疏松症的靶标基因富集通路之间可能存在多通路互相协同、互相拮抗、级联信号转导等关系，在抗骨质疏松症治疗中应把握中医“整体观念”，除了抓住局部关键基因、关键通路进行治疗，也应根据患者具体情况，进行总体辨证治疗，“龟板-鹿角”药对治疗骨质疏松症具有多靶点、多通路、多系统的优势。

3.3  结论  此次研究基于网络药理学方法，揭示经典补肾中药药对“龟板-鹿角”治疗骨质疏松症的分子机制可能。药对的21个活性成分与183个靶标基因及其富集的生物学过程/信号通路形成联系紧密的互作网络，“龟板-鹿角”药对通过多成分、多靶标基因、多通路交互、多通路级联信号的方式调控骨吸收-骨重建关系的动态平衡，发挥维持机体骨稳态平衡的作用。但此次研究仅通过分子机制的大数据预测探讨“龟板-鹿角”药对治疗骨质疏松症的潜在可能机制，具体药物成分作用的靶点及其机制仍需严密设计的实验进一步验证。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：

 “龟板-鹿角”药对：是龟鹿二仙胶、左归丸等经典补肾方剂发挥治疗作用的核心，具有补肾强骨之功，常用于治疗骨质疏松症。

网络药理学：融合多向药理学与系统生物学思维，通过对生物系统分子的网络构建分析，探索药物的成分-靶点-通路-疾病之间的整体作用关系，预测药物在体内的作用机制。

“龟板-鹿角”药对：是龟鹿二仙胶、左归丸等经典补肾方剂发挥治疗作用的核心，具有补肾强骨之功，常用于治疗骨质疏松症。

网络药理学：融合多向药理学与系统生物学思维，通过对生物系统分子的网络构建分析，探索药物的成分-靶点-通路-疾病之间的整体作用关系，预测药物在体内的作用机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程