牛膝治疗腰椎间盘突出症潜在作用机制的网络药理学分析

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.3162

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (17): 2734-2739.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.3162

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牛膝治疗腰椎间盘突出症潜在作用机制的网络药理学分析

侯宇龙1，王晶石2，王旭凯2

1长春中医药大学，吉林省长春市 130117；2长春中医药大学附属医院，吉林省长春市 130021

收稿日期:2020-04-01 修回日期:2020-04-09 接受日期:2020-06-05 出版日期:2021-06-18 发布日期:2021-01-08
通讯作者: 王旭凯，医学博士，副教授，硕士生导师，长春中医药大学附属医院，吉林省长春市 130021
作者简介:侯宇龙，男，1995年生，吉林省吉林市人，长春中医药大学在读硕士，主要从事脊柱疾病的研究。
基金资助:
吉林省中医药管理局课题(2017037)，项目负责人：王旭凯；长春中医药大学“百青计划”项目，项目参与人：王旭凯

Potential mechanism of Achyranthes bidentata in the treatment of lumbar disc herniation based on network pharmacology

Hou Yulong1, Wang Jingshi2, Wang Xukai2

1Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130117, Jilin Province, China; 2Affiliated Hospital of Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130021, Jilin Province, China

Received:2020-04-01 Revised:2020-04-09 Accepted:2020-06-05 Online:2021-06-18 Published:2021-01-08
Contact: Wang Xukai, MD, Associate professor, Master’s supervisor, Affiliated Hospital of Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130021, Jilin Province, China
About author:Hou Yulong, Master candidate, Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130117, Jilin Province, China
Supported by:
a grant from Jilin Provincial Administration of Traditional Chinese Medicine, No. 2017037 (to WXK); the One-hundred Youth Project of Changchun University of Chinese Medicine (to WXK [project participant])

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
牛膝：为苋科植物牛膝Achyranthes bidentata Bl. 的干燥根，具有逐瘀通经、补肝肾、强筋骨等功效，临床上常用于治疗腰腿痛等症。
网络药理学：它是以系统生物学理论为基础，对生物系统进行网络分析，选取特定信号节点进行多靶点药物分子设计的新学科，能够直观地阐明中药对疾病多分子、多靶点、多通路的分子机制。

背景：现代药理学研究表明牛膝在治疗腰椎间盘突出症中发挥着良好作用。由于牛膝所含化学成分复杂，并且在分子层面上治疗腰椎间盘突出症的机制尚不明确。网络药理学作为新兴科学，能够直观地阐明中药对疾病多分子、多靶点、多通路的分子机制，可为后期药物研发及疾病治疗提供一定理论依据。
目的：运用网络药理学预测牛膝治疗腰椎间盘突出症的有效成分及作用靶点，探讨其“多成分、多靶点、多途径”的潜在作用机制。
方法：从TCMSP数据库中筛选出牛膝的有效成分及作用靶点，通过GeneCard数据库和OMIM数据库筛选LDH的预测靶点，并取中药与疾病的交集靶点；采用Cytoscape 3.7.2软件构建“中药-成分-疾病-靶点”的调控网络，通过STRING数据库构建蛋白质相互作用网络(PPI)，筛选核心靶点；利用Bioconductor中的R包对中药与疾病交集靶点进行GO富集分析和KEGG通路注释分析。
结果与结论：预测得到牛膝治疗腰椎间盘突出症的有效成分11个和有效靶点21个，其中IL-6、EGFR、VEGFA、CCND1、MAPK8等靶点基因可能起着关键性的作用，并推断其作用机制可能与KSHN信号通路、糖尿病并发症的AGE-RAGE信号通路、胰腺癌信号通路、TNF信号通路等有关。通过预测结果认为，牛膝对腰椎间盘突出症的作用机制可能是槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇等活性成分通过PI3K/Akt、TNF、JAK-STAT和VEGF等信号通路对IL-6、EGFR、VEGFA、CCND1、MAPK8等相关靶点发挥抗细胞分化和凋亡、抗氧化应激、减少炎症反应和促进代谢等作用。研究可为后续的相关临床试验提供理论依据和方向。

https://orcid.org/0000-0003-4941-3714 (王旭凯)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 牛膝, 骨, 腰椎间盘, 椎间盘突出, 网络药理学, 有效成分, 靶点

Abstract: BACKGROUND: Modern pharmacological studies have shown that Achyranthes bidentata plays a good role in the treatment of lumbar disc herniation. Due to the complex chemical composition of Achyranthes bidentate, its molecular mechanism underlying the treatment of lumbar disc herniation is not yet clear. As an emerging science, network pharmacology can intuitively clarify the molecular mechanism of traditional Chinese medicine in disease treatment at multi-molecule, multi-target and multi-pathway aspects, which can provide a certain theoretical basis for future drug development and disease treatment.
OBJECTIVE: To predict the effective components and targets of Achyranthes bidentata in the treatment of lumbar disc herniation using network pharmacology, and to explore its potential mechanism at multi-component, multi-target and multi-pathway aspects.
METHODS: The effective components and targets of Achyranthes bidentata were screened from the TCMSP database, and the predictive targets of lumbar disc herniation were screened through GeneCard database and OMIM databases. The intersected targets of traditional Chinese medicine and disease were then obtained. Cytoscape 3.7.2 software was used to construct a traditional Chinese medicine-component-disease-target regulatory network. The protein-protein interaction network was constructed through STRING database to screen the core targets. The R packet in Bioconductor was used to analyze the gene ontology (GO) enrichment and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway annotation of traditional Chinese medicine and disease intersected targets.
RESULTS AND CONCLUSION: A total of 11 effective components and 21 effective targets of Achyranthes bidentata in the treatment of lumbar disc herniation were screened out. Among them, IL-6, EGFR, VEGFA, CCND1, and MAPK8 might play a crucial role, and it is inferred that their mechanism of action may be related to the KSHN signaling pathway, the AGE-RAGE signaling pathway for diabetic complications, the pancreatic cancer signaling pathway, and TNF signaling pathway. Our prediction results indicate that the mechanism of Achyranthes bidentata in the treatment of lumbar disc herniation may be that quercetin, kaempferol, β-sitosterol and other active ingredients function at IL-6, EGFR, VEGFA, CCND1, MAPK8 targets through PI3K/Akt, TNF, JAK-STAT and VEGF signaling pathways to play anti-cell differentiation, apoptosis and oxidative stress effects, reduce inflammation and promote metabolism. This study provides a theoretical basis and direction for the subsequent clinical trials.

Key words: Achyranthes bidentate, bone, lumbar disc, lumbar disc herniation, network pharmacology, effective component, target

中图分类号:

侯宇龙, 王晶石, 王旭凯. 牛膝治疗腰椎间盘突出症潜在作用机制的网络药理学分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(17): 2734-2739.

Hou Yulong, Wang Jingshi, Wang Xukai. Potential mechanism of Achyranthes bidentata in the treatment of lumbar disc herniation based on network pharmacology[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(17): 2734-2739.

图/表（结果） 7

2.1 牛膝活性成分的筛选在TCMSP数据库中共检索到牛膝的化学成分176个，以OB和DL参数对牛膝的化学成分进行筛选后，共得到20个潜在的有效成分，包括黄连碱、表小檗碱、山柰酚、槲皮素等，详见表1。

2.2 牛膝治疗LDH潜在作用靶点的预测结果共收集到79个牛膝有效成分作用靶点，LDH疾病靶点681个，将牛膝作用靶点与LDH疾病靶点取交集，得到两者交集靶点共21个，并形成韦恩图，见图 1。

2.3 中药-成分-疾病-靶点调控网络构建的结果牛膝治疗LDH的调控网络见图2。图中矩形代表中药牛膝，“LDH”代表腰椎间盘突出症，三角形代表牛膝的有效成分，外圈椭圆形代表中药牛膝与LDH疾病的共同靶点。中药牛膝主要通过11种(表1所列20个牛膝有效成分中，有8个与LDH无对应的靶点)有效成分作用于21个靶标，从图2可以看出一种化学成分可作用于多个的靶点，同一靶点又与不同的化学成分相对应，充分体现了牛膝对LDH的多成分、多靶点、多机制的作用特点。

2.4 PPI网络的分析结果将21个共有靶点导入STRING数据库中，以获取蛋白相互作用关系，通过运用Cytoscape 3.7.2软件绘制靶蛋白PPI网络图，此网络共包括22个节点，228条边，连接节点边的数目越多，成为核心基因的可能越大，见图3。由图4条形图可见，节点度值较高的靶点蛋白包括 IL6、EGFR、VEGFA、CCND1、MAPK8等，是蛋白互作网络中的核心靶点，可能在牛膝治疗LDH中发挥关键作用。

2.5 GO功能富集分析为了阐明牛膝治疗LDH的分子作用机制，将21个潜在靶点进行GO分类富集分析，结果见图5。其中GO功能主要涉及整合素结合、磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸4-磷酸酶活性、一氧化氮合酶调节活性、磷脂酰肌醇二磷酸激酶活性、NF-κB结合、生长因子结合、转录因子结合等，表明牛膝可能是通过调节这些生物分子从而发挥治疗作用。

2.6 KEGG通路富集分析牛膝治疗LDH的21个潜在作用靶点共富集在100条信号通路上，图片仅显示前20个富集分析结果，见图6。其中信号通路主要集中在癌症相关通路、卡波济肉瘤相关疱疹病毒感染、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路和麻疹通路等。

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引言

腰椎间盘突出症(lumbar disc herniation，LDH)是骨伤科常见病和多发病，其病理演变在于腰椎间盘的髓核组织从纤维环破裂之处突出，压迫或刺激脊神经根，从而引起腰部疼痛不适、单侧或双侧下肢放射性疼痛、麻木等一系列临床症状[1-2]。现代医学认为，LDH疼痛的出现可能因为机械压迫、细胞凋亡、神经根炎性刺激、椎间盘自身免疫反应及生物力学机制等所致[3]。目前，LDH的治疗主要包括保守和手术治疗[4]，但临床上大部分患者会采用保守治疗方法[1]。在保守疗法中，对乙酰氨基酚和非类固醇抗炎药是常被用于LDH对症治疗的西药[5]，然而这类药物又具有疗效短暂、药物毒副作用大、价格昂贵及复发率高等缺点，许多患者或因身体不良反应或因经济压力等原因，仅仅短期服用这类西药，这对于缓解LDH的症状作用有限。因此，寻求更为安全、高效、价廉的药物来治疗LDH是临床工作者亟待解决的问题。
近年来，中医药在治疗LDH上发挥着不可替代的作用，有学者基于数据挖掘方法分析中医药治疗LDH的用药规律[6]，结果发现中药使用频率排名前3位的分别是当归、牛膝、甘草。牛膝为苋科多年生草本植物牛膝的干燥根，味甘、苦、酸，性平，具有补肝肾、强筋骨、逐瘀通经及引血下行等作用[7]。研究表明，牛膝具有改变病变部位的微循环、抑制炎症因子及致痛介质表达、促进腰椎及受损神经恢复的功能[8-9]，常与其他中药配伍共同治疗LDH，能够有效缓解腰腿痛等症状。可见牛膝在治疗LDH上具有良好的效果，但其所含成分多样，物质基础与作用机制尚不清楚，故此次研究基于网络药理学的相关原理及方法，预测牛膝治疗LDH的有效成分及作用靶点，探讨其“多成分、多靶点、多途径”的作用机制，为临床上应用牛膝治疗LDH提供理论依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计网络药理学分析。
1.2 时间及地点研究于2020-01-15在吉林省长春市完成。
1.3 方法
1.3.1 牛膝有效成分的收集与筛选在中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)中查找中药牛膝的所含成分，将药物的口服生物利用度(OB)≥30%和类药性(DL)≥0.18设定为筛选条件，得出牛膝的活性成分。
1.3.2 牛膝作用靶点与LDH靶点的预测运用Perl软件对收集到的牛膝有效成分作用靶标进行预测，通过UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)将筛选出的靶点蛋白名转换为基因名，合并其中重复的有效成分作用靶点，同时删除无法找到基因名的靶点蛋白，以便后续PPI网络构建与通路分析。以“lumbar disc herniation”“LDH”等为检索词在GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)、OMIM数据库(http:// www.omim.org/)中检索与LDH相关的所有靶点基因，并将上述疾病靶点与中药潜在靶点进行取交集，即牛膝治疗LDH的潜在靶点。
1.3.3 药物-成分-疾病-靶点调控网络的构建与分析将上述所得LDH与牛膝交集靶点的数据输入Cytoscape 3.7.2软件中，构建“药物-成分-疾病-靶点”调控网络。其中，网络的四种节点分别代表中药牛膝及其有效成分、LDH、LDH与牛膝的共同靶点。同时使用Cytoscape 3.7.2软件中的“Network analyzer”插件对上述网络节点的交叉值进行统计，数值越大，表示该靶点在调控网络中发挥核心作用。
1.3.4 PPI网络的构建与核心靶标的筛选将LDH与牛膝的共同靶点输入STRING(http://string-db.org)数据库中，筛选条件中物种选择“Homo sapiens”，其余条件为默认，构建牛膝治疗LDH蛋白相互作用的PPI网络，并将所得文件输入R语言绘制条形图，得到蛋白互作网络中的核心靶蛋白。
1.3.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析利用Bioconductor中的R包对LDH与牛膝交集靶点进行GO富集分析和KEGG通路注释分析，设定阈值 P < 0.05，并将牛膝成分与分析得到的靶点通路相对应，从而分析药物治疗疾病的可能机制。

讨论

此次研究是基于网络药理学方法研究牛膝治疗腰椎间盘突出症的作用机制。通过对牛膝的化学成分进行筛选后，共得到20个潜在的有效成分，据“中药-成分-疾病-靶点”网络调控图分析结果显示，槲皮素、山柰酚、汉黄芩素、黄芩素、β-谷甾醇等成分的节点度值较高，是牛膝对LDH发挥治疗作用的主要有效成分。周银芝等[10]研究表明，槲皮素可通过影响成骨细胞分化和破骨细胞分化相关基因的表达，减轻小鼠的氧化应激从而提高骨性能；司海超等[11]研究发现，槲皮素可能通过抑制Wnt/β-catenin通路及其下游靶分子COX-2和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达从而减轻大鼠的神经病理性疼痛，可见槲皮素在改善LDH症状方面具有潜在的应用前景。WONG等[12]通过一项体内外研究发现，山奈酚主要是通过抑制脂肪生成、炎症反应、氧化应激、破骨细胞自噬和成骨细胞凋亡等一系列方式达到骨保护作用。汉黄芩素与黄芩素均为黄酮类化合物，二者具有抗氧化、抗炎镇痛的药理作用[13]，且有研究表明黄芩素可通过上调miR-29a-3p的表达来抑制MAP2K6的磷酸化，以提高骨细胞活性、抑制细胞凋亡[14]。β-谷甾醇是常见的一种植物甾醇，其在抗氧化、抗炎和调节免疫等方面发挥良好的药理作用[15]，曾莉萍等[16]研究发现β-谷甾醇能够有效地提高成骨细胞护骨素(OPG)与破骨细胞分化因子(ODF)的比值，是发挥调节骨代谢平衡的作用机制之一。除此之外，尚存在一些未被报道或鲜有研究的生物过程及活性成分，而这些生物过程和活性成分的药理作用将成为未来研究牛膝治疗LDH的潜在方向，如多孔甾-7，22-二烯-3β-醇、二齿苷、δ7-豆甾烯醇等，其药效学及作用机制有待进一步研究。
文章结果显示有21个靶标蛋白与LDH相关，通过PPI网络分析显示，节点度值较高的靶点蛋白包括 IL-6、EGFR、VEGFA、CCND1、MAPK8等，可能是牛膝治疗LDH的核心靶点，上述提示牛膝在治疗LDH过程中具有多组分、多靶点的特点。白细胞介素6(IL-6)属于机体炎性因子，可参与组织生长及炎性反应的调控，促进炎症细胞的聚集及纤维因子表达，使局部退行性病变及突出，进而参与腰椎间盘突出症病情的进展[17-19]。EGFR属于ErbB受体酪氨酸激酶家族，MARTIN等[20]证实EGFR基因与慢性疼痛相关联，EGFR可能是持续疼痛状况的合适治疗靶点。EGFR还可能参与退变椎间盘组织中新生血管的形成和浸润，从而诱发或加重椎间盘髓核的退变[21]。VEGFA可通过刺激内皮细胞的增殖和迁徙，进而增加血管的通透性，有效改善局部血液循环从而缓解症状[22]。研究发现，MAPK在椎间盘退变中发挥炎症递质浓聚作用，其过度表达将导致纤维环变硬，维持高度和分散负荷的能力逐渐下降及生化成分的改变，从而加速椎间盘整体退变，通过抑制MAPK的表达和活性可阻断椎间盘的退变[23]。此次研究所聚焦的相关靶基因，可作为日后牛膝治疗LDH实验验证的重要关注对象。
为了阐明牛膝治疗LDH的分子作用机制，将21个作用靶点进行GO富集分析，通过结果显示并结合临床实际，认为这些靶点主要通过影响一氧化氮合酶调节活性、NF-κB、生长因子等在椎间盘退变过程中发挥着治疗作用。有研究证实，LDH患者的髓核组织对诱导型一氧化氮合酶(iNOS) mRNA进行表达，并导致一氧化氮(NO)的过量释放，从而增强了基质金属蛋白酶和胶原酶活性，抑制合成基质蛋白多糖，且增加了Ⅱ型胶原裂解，最终造成椎间盘的退变[24]，而一氧化氮合酶(NOS)抑制剂可降低其活性，进而有效抑制NO的过量释放，对延缓椎间盘的退变发挥积极作用[25]。NF-κB通路与椎间盘退变之间的关系是骨科学术界目前研究热点，主要体现为细胞在受氧化应激、病原微生物、毒素、炎症递质和细胞因子等刺激下，IκB激酶作用于抑制性IκB，使其从三聚体中脱离出来而发生泛素化、磷酸化后被分解，p50亚基上的易位信号及p65亚基上的DNA结合位点由此被显露出来，使得NF-κB活性恢复，二聚体亦将由细胞质转移到细胞核中，最终与κB序列相结合，由此发挥基因转录和调节下游蛋白表达等作用[26]。生长因子对于神经组织的修复与再生发挥重要的治疗作用，并具有调控神经的再生速度与走行等作用，此外还能减轻局部炎症反应和保护受损的神经细胞[27]。
KEGG通路富集结果显示，牛膝治疗LDH的核心作用靶点编码基因主要富集在癌症相关通路、卡波济肉瘤相关疱疹病毒感染、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路和麻疹通路等，主要涉及细胞分化和凋亡、炎症反应、代谢等多种复杂的生物学过程。①细胞分化和凋亡相关通路：与之相关的信号转导通路有Relaxin、PI3K/Akt、JAK-STAT、VEGF、IBD等。其中，Relaxin是一种肽激素，具有众所周知的抗纤维化特性，许多过程，包括炎症、肌成纤维细胞活化和内皮细胞向间质转化，在纤维化的建立和进展中起作用，正是由于Relaxin抗纤维化特性，其信号转导通路可作为抑制炎症和纤维化肌成纤维细胞活化的机制[28]。PI3K/Akt是一条促进细胞存活、代谢的信号通路，对神经病理性疼痛发挥着重要作用[29]。JAK-STAT通路可促进成骨细胞分泌一氧化氮等产物，从而间接抑制破骨细胞的形成达到骨保护作用[30]。②炎症反应相关通路：炎症因子在椎间盘退变过程中发挥及其重要的作用[31]，主要涉及TNF、
IL-17、NF-κB、nod样受体信号通路等。其中，肿瘤坏死因子α(TNF-α)是引起椎间盘退变的主要炎性物质之一，其作用机制主要是通过上调椎间盘细胞中基质金属蛋白酶(MMPs)的活性表达，进而减少基质中的弹性蛋白、蛋白多糖及胶原等物质而诱发，亦有研究证实肿瘤坏死因子α与椎间盘源性疼痛的机制有着密切联系[32]。白细胞介素17(IL-17)通过p38/c-fos和JNK/c-jun途径激活转录因子AP-1，从而上调COX2的表达和PGE2的生成，从而在椎间盘组织中发挥致炎作用[33]。③代谢相关通路：此类通路是通过内分泌、激素或神经等其他相关系统直接或间接对该病进行调节，主要涉及Proteoglycans、Prolactin、HIF-1、Thyroid hormone等信号通路。其中，Proteoglycans的代谢途径的候选基因可能与腰椎间盘突出的严重程度相关[34]。缺氧诱导因子1α(HIF-1α)在人的退变腰椎间盘组织中有增高趋势，故其可能参与了腰椎间盘组织的退变过程[35]。甲状腺激素分泌的多少，也会对机体骨代谢产生影响[36]。
综上所述，牛膝中槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、汉黄芩素、黄芩素等有效成分在LDH的治疗中发挥着重要作用，其有效成分可能通过抗细胞分化和凋亡、减少炎症反应、抗氧化应激和促进代谢等生物过程来对LDH发挥治疗作用，其特点具有多成分、多靶点、多途径。通过网络药理学方法可获得牛膝治疗LDH的潜在有效成分和作用机制，为后续相关的临床试验疗效评价指标的选择提供依据和方向。但此次研究仅为预测分析，上述结论及具体作用机制有待后续实验加以验证。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

牛膝治疗腰椎间盘突出症潜在作用机制的网络药理学分析

Potential mechanism of Achyranthes bidentata in the treatment of lumbar disc herniation based on network pharmacology

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