2.1  祛痰逐瘀方活性成分的筛选  通过TCMSP平台数据库检索的陈皮化学成分63个，半夏化学成分116个，桃仁化学成分66个，红花化学成分189个，茯苓化学成分34个，通过OB>30%和DL>0.18进一步筛选得到陈皮的潜在活性成分5个，半夏潜在活性成分13个，桃仁潜在活性成分23个，红花潜在活性成分22个，茯苓潜在活性成分15个。部分活性成分见表1。

2.2  祛痰逐瘀方治疗股骨头坏死潜在靶点的预测  通过TCMSP平台数据库检索得到OB>30%和DL>0.18的中药活性成分，并利用TCMSP平台获得这些活性成分对应的靶点基因，去除无效和重复的靶点后，共得到祛痰逐瘀方中活性成分靶点基因共124个。以Femur Head Necrosis为检索词，利用Genecard数据库平台，以筛选出股骨头坏死疾病的潜在作用靶点共1 357个；利用OMIM数据库平台得到股骨头坏死疾病的潜在作用靶点共101个。利用R语言绘制韦恩图(图1)，得到疾病和中药活性成分的共同基因靶点61个，如NCOA2，PTGS1，ESR1，RELA，BCL2，CASP3，LDLR，PPARG，APOB，SREBF1等。提示祛痰逐瘀方主要作用于这些潜在靶点发挥治疗股骨头坏死的作用。

2.3  活性成分靶点-疾病靶点网络图的构建  祛痰逐瘀方治疗股骨头坏死相关的中药活性成分共34个，前10个为sitosterol，naringenin，5，7-dihydroxy-2-(3-hydroxy-4- methoxyphenyl)chroman-4-one，Citromitin，nobiletin，Cavidine，baicalein，beta-sitosterol，Stigmasterol，gondoic acid。将中药活性成分和二者的共同基因靶点导入Cytoscape软件进行可视化分析(图2)。其中八边形代表祛痰逐瘀方，菱形代表疾病，三角形代表中药活性成分，椭圆代表基因靶点。结果显示祛痰逐瘀方-股骨头坏死中连接度为靠前的活性分子为quercetin，baicalein，kaempferol，luteolin，nobiletin，beta-sitosterol，beta-carotene，naringenin，coniferin(最少者对应6个基因靶点，最高者对应42个基因靶点)。祛痰逐瘀方作用于股骨头坏死的相关靶基因共61个，其中连接度较多的关键靶点基因为NCOA2，CHRM3，PTGS1，CASP3，BCL2，AR，PPARG，CASP8。以上成分以及基因靶点是祛痰逐瘀方治疗股骨头坏死的重要活性成分和关键基因靶点，在祛痰逐瘀方治疗股骨头坏死中具有重要意义。

2.4  关键靶点基因PPI网络的构建  将祛痰逐瘀方-股骨头坏死的61个共同基因靶点导入String数据库平台，选择物种为人类，获取蛋白质相互作用关系，利用String数据库平台平台构建蛋白关系网络(图3)。排除1个游离的基因靶点，并选择置信度分数score>0.9后，构建出的网络图共有55个节点，146个边(节点为基因靶点，边为二者的相互关系)。其中的节点可代表相互作用关系、预测关系、同源性、共表达、构造关系等。根据Count值筛选出排名前30的关键靶点蛋白(图4)。



2.4  关键靶点基因PPI网络的构建  将祛痰逐瘀方-股骨头坏死的61个共同基因靶点导入String数据库平台，选择物种为人类，获取蛋白质相互作用关系，利用String数据库平台平台构建蛋白关系网络(图3)。排除1个游离的基因靶点，并选择置信度分数score>0.9后，构建出的网络图共有55个节点，146个边(节点为基因靶点，边为二者的相互关系)。其中的节点可代表相互作用关系、预测关系、同源性、共表达、构造关系等。根据Count值筛选出排名前30的关键靶点蛋白(图4)。

2.5  GO富集分析和KEGG通路分析  GO富集分析得到84个GO条目，列举生物学功能排名较靠前的20个条目(图5)，主要为近端启动子序列特异性DNA结合(共14个靶点：NCOA2，ESR1，RELA，PPARG，SREBF1，AR，ESR2，HIF1A，FOSL1，AHRMYC，RB1，RUNX2，IRF1)、DNA结合转录活性调控(共13个靶点：ESR1，RELA，SREBF1，AR，RXRB，FOS，HIF1A，FOSL， MYC，NR1I3，PARP1，RUNX2，IRF1)、RNA聚合酶II近端启动子序列特异性DNA结合(共13个靶点：NCOA2，ESR1，RELA，PPARG，SREBF1，AR，ESR2，HIF1A，FOSL1，AHR，MYC，IRF1，RUNX2)、蛋白质异二聚化(共13个靶点：RELA，BCL2，PPARG，VEGFA，FOS，HIF1A，AHR，CAV1，CTNNB1，IKBKB，EGFR，RAF1，ERBB3)、染色质结合(共12个靶点：NCOA2，ESR1，RELA，PPARG，SREBF1，NCOA1，AR，FOS，CTNNB1，EGFR，PCNA，RUNX2)、泛素蛋白连接酶结合(共11个靶点RELA，BCL2，GSK3，HIF1A，CASP8，NFKBIA，MDM2，CHEK2，ERBB3)等多个生物学功能。表明祛痰逐瘀方可以通过参与多种生物学过程来发挥治疗股骨头坏死的作用。

KEGG通路富集分析得到120条信号通路(P < 0.05)，列举排名较靠前的20个条目(图6)，主要为甲状腺激素信号通路、白细胞介素17(IL-17)信号通路、内分泌抵抗、AGE-RAGE信号通路、细胞凋亡、缺氧诱导因子1(HIF-1)信号通路、PI3K-Akt信号通路等，除柱状图、点状图列出的通路外，还有血管内皮生长因子(VEGF)信号通路、p53信号通路、Th17细胞分化、TNF信号通路、细胞衰老、MAPK信号通路、Wnt信号通路、mTOR信号通路等值得关注。PI3K-Akt信号通路是KEGG通路富集分析中与股骨头坏死相关的分值最高、靶点最多的通路，以祛痰逐瘀方参与PI3K-Akt信号通路为例(图7)，标记靶点代表祛痰逐瘀方中活性成分的关键基因靶点在PI3K-Akt信号通路中所参与的过程，这些基因靶点在PI3K-Akt信号通路中起着关键作用。这些表明祛痰逐瘀方可以通过参与多种通路协调发挥治疗股骨头坏死的作用，提示这些关键通路可以作为研究祛痰逐瘀方治疗股骨头坏死的方向。

KEGG通路富集分析得到120条信号通路(P < 0.05)，列举排名较靠前的20个条目(图6)，主要为甲状腺激素信号通路、白细胞介素17(IL-17)信号通路、内分泌抵抗、AGE-RAGE信号通路、细胞凋亡、缺氧诱导因子1(HIF-1)信号通路、PI3K-Akt信号通路等，除柱状图、点状图列出的通路外，还有血管内皮生长因子(VEGF)信号通路、p53信号通路、Th17细胞分化、TNF信号通路、细胞衰老、MAPK信号通路、Wnt信号通路、mTOR信号通路等值得关注。PI3K-Akt信号通路是KEGG通路富集分析中与股骨头坏死相关的分值最高、靶点最多的通路，以祛痰逐瘀方参与PI3K-Akt信号通路为例(图7)，标记靶点代表祛痰逐瘀方中活性成分的关键基因靶点在PI3K-Akt信号通路中所参与的过程，这些基因靶点在PI3K-Akt信号通路中起着关键作用。这些表明祛痰逐瘀方可以通过参与多种通路协调发挥治疗股骨头坏死的作用，提示这些关键通路可以作为研究祛痰逐瘀方治疗股骨头坏死的方向。

股骨头坏死是一种由于股骨近端血供中断而引起的骨坏死，是一种潜在的破坏性疾病^[1]，实质上是由于微血管循环受损导致的骨细胞死亡^[2-3]。股骨头坏死发病率逐渐上升，每年，在中国报道的新病例有100 000-200 000^[4]。股骨头坏死的临床表现主要是疼痛以及髋关节活动范围受限，若未经治疗，有70%-80%的患者发展为继发性髋关节炎^[5]，因此针对股骨头坏死病程发展的控制尤其重要。股骨头坏死的治疗取决于其发展至不同的阶段^[6]。值得注意的是，许多非手术治疗，例如西药治疗、生物物理治疗、脉冲电磁治疗和高压氧治疗在早期可以改善疼痛和功能结局^[7]。然而，大多数现代医学保守疗法在防止其发作和延缓其发展方面缺乏广泛应用的证据^[6-7]。股骨头坏死早期的钻孔减压等手术治疗可能有效缓解症状，但这种方法在预防股骨头塌陷方面没有比保守治疗更大的价值^[8-10]。目前，中药在亚洲得到广泛应用，且已证实可为股骨头坏死患者提供止痛和改善的生活质量的作用^[11-12]。

股骨头坏死属于中医“骨蚀病”范畴。中医认为早期的骨蚀病多为痰瘀互结型^[13]，故早期治疗股骨头坏死多采用痰瘀同治法。二陈汤和桃红四物汤分别是治疗骨蚀病痰湿蕴结合和气滞血瘀的主方^[14]。二陈汤自创立以来，其化痰作用受到后世医家的认可^[15]。桃红四物汤来源于清·吴谦等所著的《医宗金鉴》，为中医传统活血化瘀经典方剂之一^[16]，有研究发现桃红四物汤对股骨头的微结构具有改善作用^[17]。二陈汤与桃红四物汤合方已被证实对痰瘀互结型的骨坏死有良好的修复作用^[18]，然而现有研究多是名家经验、动物实验、临床观察等，并未阐述合方的具体药理作用机制，故文章选取合方中半夏、陈皮、茯苓、桃仁、红花5味代表药物做深入研究。

网络药理学是围绕生物信息学、系统生物学等学科的技术和知识, 并在网络数据库检索基础上，进行生物信息网络的构建和分析。网络药理学可构建药物的“成分-靶标-通路-疾病”网络，深入探究药物与疾病的关系，从而多层次地阐明药物的作用机制^[19]。网络药理学的构建思维比传统药理学更适用于解释组方中药间的复杂关系^[20]。此次研究于二陈汤合桃红四物汤中选取5味代表药物，组成祛痰逐瘀方，并将其和股骨头坏死作为研究对象，构建祛痰逐瘀方活性成分-股骨头坏死-靶点网络，探讨其作用机制，为进一步的研究提供思路和理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  构建中药-成分-疾病-靶点调控网络，进行GO富集分析和KEGG通路分析。

1.2  时间及地点  实验于2019年11月至12月在广州中医药大学完成。

1.3  祛痰逐瘀方活性成分与作用靶点的筛选  研究采用中药系统药理学分析平台(TCMSP，http://tcmspw.com/ tcmsp.php)检索陈皮、半夏、桃仁、红花、茯苓五味中药的全部化学成分，TCMSP数据库以化合物口服生物利用度(OB)>30%和类药性(DL)>0.18作为化合物的筛选条件，筛选出所有化合物，得到的化合物具有较高的活性成分。同时通过TCMSP数据库平台获取中药活性化合物的作用靶点。

1.4  方法

1.4.1  股骨头坏死疾病靶点的确定  通过在线《人类孟德尔遗传》数据库(OMIM，https://www.omim.org/)以及GeneCards(https://www.genecards.org/)检索与股骨头坏死相关靶点。

1.4.2  活性成分靶点和疾病靶点韦恩图的绘制  利用R语言绘制将中药活性成分相关的靶点和疾病靶点进行匹配映射，并绘制韦恩图(venn)获得祛痰逐瘀方-股骨头坏死的共同作用靶点。

1.4.3  活性成分靶点-疾病靶点网络图的构建  利用韦恩图取交集，获得祛痰逐瘀方-股骨头坏死的共同靶点，并进行中药活性成分靶点-疾病靶点的网络药理学可视化分析，利用Cytoscape 3.6.1软件构建“疾病-作用靶点及中药活性成分-作用靶点”网络图，疾病、中药活性成分和作用靶点以“节点”表示，几个“节点”之间的相互联系用“边”表示。通过可视化分析可以筛选出联系最强的靶点基因和活性分子，这些作用于数量较多的基因靶点的活性分子将会是研究的重点。

1.4.4  蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络的构建  将祛痰逐瘀方-股骨头坏死共同作用靶点导入STRING (https://string-db.org/)数据库中，以置信度分数score>0.9为条件进行筛选，并隐藏网络中无联系的节点，利用该平台绘制PPI网络图。

1.4.5  基因本体(GO)富集分析和基因相互作用(KEGG)通路分析利用Bioconductor平台(https://www.bioconductor. org/)和R语言对获得的基因进行GO富集分析和KEGG通路分析。通过相关脚本利用R语言导出GO富集分析表格和KEGG富集分析表格，并分别绘制GO富集分析和KEGG富集分析的barplot柱状图。

3.1  组方分析  股骨头坏死属于中医“骨蚀病”范畴。骨蚀病在不同阶段表现为不同的证候特点，此次研究基于早期股骨头坏死痰瘀互结的分型，选取祛痰逐瘀方的半夏、陈皮、茯苓、桃仁、红花5味药进行研究，半夏和陈皮具有燥湿化痰之功，茯苓利水渗湿，桃仁、红花活血祛瘀，五者配伍气顺痰消，气行血行，痰瘀则散。元代朱丹溪的《丹溪心法》中提到“痰瘀互结”，清代唐宗海在《血证论》中指出“血积既久亦能化为痰水”“血与气本不相离”“水即气也”，表明痰瘀同源，即痰瘀同治具有临床指导价值。

3.2  活性成分分析  此次研究共收集到治疗股骨头坏死的活性成分78个，其中与股骨头坏死有共同作用靶点的活性成分共34个(部分见表1)，如槲皮素、黄芩苷等。研究表明，黄芩苷可以调控Wnt信号通路^[21]，进而调节骨髓间充质干细胞的成骨分化及增殖。另外，也有研究证明黄芩苷可以通过抑制RANKL的表达，对成骨进行调节^[22-23]。此外，研究发现，槲皮素可以通过调节VEGF信号通路和AMPK信号通路，进而影响股骨头坏死的进程^[24-25]。表明这些活性成分可以通过作用于相关靶点及信号通路来调节股骨头坏死的进程。

3.3  关键靶点及通路分析  此次研究共收集到可能和治疗股骨头坏死相关的作用靶点共61个，GO富集分析也得出祛痰逐瘀方作用于股骨头坏死的相关靶点中，PPARG、RUNX2等发挥了重要作用。相关研究显示PPARG的异常调节导致促脂肪形成和抗成骨作用的发生^[26]，增加股骨头坏死的风险。SONG等^[27]也发现RUNX2与股骨头坏死的发生有密切关系。KEGG富集通路显示，白细胞介素17信号通路、Th17细胞分化、细胞凋亡、PI3K-Akt信号通路、p53信号通路、血管内皮生长因子信号通路、Wnt信号通路、mTOR信号通路、TNF信号通路、细胞衰老、MAPK信号通路等在股骨头坏死的发生发展中发挥重要作用。ZOU  等^[28]通过研究发现白细胞介素17和Th17细胞在股骨头坏死中有较高的表达，且与疼痛关系密切，表明白细胞介素17信号通路和Th17细胞分化与股骨头坏死密切相关。VEGF在血管生成中很重要，并且能够通过促进血管内皮细胞的分裂和生长来诱导血管生成^[29-31]，并促进骨组织重塑和新的骨形成^[32]，同样，AMPK信号通路也是股骨头坏死发生发展的重要通路^[33]。此外，也有研究已经证明Wnt信号通路参与了股骨头坏死的发病机制^[34]，其可以促进成骨细胞的分化和增殖^[35]。PI3K-Akt信号通路也已被证实可对血管修复再生、成骨细胞分化增殖凋亡与破骨细胞分化相关因素进行有效调控^[36]。

从以上的结果可以看出祛痰逐瘀方借助槲皮素、黄芩苷等活性成分，作用于分子靶点以及相关的信号通路(如Wnt、血管内皮生长因子等信号通路)来协同发挥对股骨头坏死的治疗作用，其可涉及血管生成、成骨分化等多个生物过程。因此，可以得出结论，祛痰逐瘀方可能通过多个活性成分、靶点、生物过程以及多个信号通路来协同发挥对股骨头坏死的治疗作用，但其主要通过哪些具体的通路尚未可知，通过该文推测可能的通路，这将是下一步实验设计的重点。因此该文虽然只是在分子层面上对祛痰逐瘀方治疗股骨头坏死的作用机制做了初步探讨，但为进一步研究其作用机制提供了新的思路和依据，为以后的动物实验提供了基础研究。

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文题释义：

祛痰逐瘀法：是中医根据辨证论治理论对有痰瘀互结证的疾病提出的治疗方法。股骨头坏死属于中医“骨蚀病”范畴，中医认为早期的骨蚀病多表现为痰瘀互结证，因此提倡早期治疗股骨头坏死采用痰瘀同治法，常用桃红四物和二陈汤加减。

网络药理学：网络药理学是围绕生物信息学、系统生物学等学科的技术和知识，并在网络数据库检索基础上，进行生物信息网络的构建和分析，可构建药物的“成分-靶标-通路-疾病”网络，深入探究药物与疾病的关系，阐明药物的作用机制。

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股骨头坏死是骨科常见病，目前中医药治疗疗效显著，祛痰逐瘀法是治疗早期股骨头坏死的有效方法。有研究发现桃红四物汤对股骨头的微结构具有改善作用。二陈汤与桃红四物汤合方已被证实对痰瘀互结型的骨坏死有良好的修复作用，然而现有的研究多是名家经验、动物实验、临床观察等，并未阐述合方的具体的药理作用机制，故文章选取合方中半夏、陈皮、茯苓、桃仁、红花5味代表药物做深入研究。

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