大鼠肝脏冷缺血再灌注损伤时姜黄素后处理对肝细胞凋亡的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2531

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (14): 2211-2216.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2531

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大鼠肝脏冷缺血再灌注损伤时姜黄素后处理对肝细胞凋亡的影响

邹海波，施鹏，孙晓峰

沈阳医学院附属中心医院，辽宁省沈阳市 110000

收稿日期:2019-07-27 修回日期:2019-07-31 接受日期:2019-09-02 出版日期:2020-05-18 发布日期:2020-03-16
通讯作者: 孙晓峰，博士，主任医师，沈阳医学院附属中心医院，辽宁省沈阳市 110000
作者简介:邹海波，1981年生，辽宁省沈阳市人，2008年中国医科大学毕业，硕士，副主任医师，主要从事临床危重症患者麻醉的器官保护性研究。
基金资助:
辽宁省教育厅一般项目(L2015540)；辽宁省自然科学基金指导计划项目(20180550621)；沈阳医学院青年基金项目(20162029)；沈阳医学院科学研究基金(20191013)

Effects of curcumin post-conditioning on hepatocyte apoptosis in rats with liver cold ischemia/reperfusion injury

Zou Haibo, Shi Peng, Sun Xiaofeng

Affiliated Central Hospital of Shenyang Medical College, Shenyang 110000, Liaoning Province, China

Received:2019-07-27 Revised:2019-07-31 Accepted:2019-09-02 Online:2020-05-18 Published:2020-03-16
Contact: Sun Xiaofeng, MD, Chief physician, Affiliated Central Hospital of Shenyang Medical College, Shenyang 110000, Liaoning Province, China
About author:Zou Haibo, Master, Associate chief physician, Affiliated Central Hospital of Shenyang Medical College, Shenyang 110000, Liaoning Province, China
Supported by:
General Project of Liaoning Provincial Department of Education, No. L2015540; Liaoning Provincial Natural Science Foundation (Guidance Project), No. 20180550621; Youth Foundation of Shenyang Medical College, No. 20162029; Scientific Research Fund of Shenyang Medical College, No. 20191013

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
姜黄素：是从姜科、南星科一些植物根茎中提取的一种化学成分，具有抗氧化应激、抑制炎症细胞因子释放、抗细胞凋亡等广泛的药理活性。
冷缺血再灌注：从冷缺血开始至器官重新恢复血供的时间间隔(整个过程器官都在低温环境中)称为冷缺血时间，随后发生的器官恢复血液供应，即是冷缺血再灌注。

背景：姜黄素预处理可减轻肢体缺血再灌注对肝脏的损伤，但姜黄素后处理对肝脏冷缺血再灌注损伤是否有保护作用及其机制目前研究甚少。

目的：探讨大鼠肝脏冷缺血再灌注损伤时姜黄素后处理对肝细胞凋亡的影响。

方法：选取成年雄性SD大鼠80只，采用随机数字表法将其分成4组(n=20)：假手术组、冷缺血再灌注组、姜黄素后处理组、地塞米松组。使肝脏血流处于完全阻断状态，随后以脾静脉作为流入道和右肾上腺静脉作为流出道注入0 ℃复方乳酸林格液，冷灌注30 min；停止冷灌注后，结扎近端脾静脉和右肾上腺静脉，切除脾脏，随即恢复肝脏血流，完成制作冷缺血再灌注模型。在大鼠冷缺血30 min后，姜黄素后处理组经尾静脉注射姜黄素60 mg/kg，地塞米松组尾静脉注射地塞米松0.5 mg/kg，其他组以等量的生理盐水替代。再灌注6 h时经下腔静脉取血，检测血清天门冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸转移酶水平，随后处死大鼠，取肝组织检测丙二醛水平；采用苏木精-伊红染色观察肝脏病理变化；Hoechst33258染色法检测肝细胞凋亡指数；Western blot检测肝组织Bcl-2和Bax蛋白表达；RT-PCR检测肝组织促细胞凋亡基因Caspase-9 mRNA表达；ELISA检测肝组织肿瘤坏死因子α及白细胞介素1β水平。

结果与结论：①与假手术组比较，冷缺血再灌注组天门冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸转移酶、丙二醛和凋亡指数明显升高(P < 0.05)；苏木精-伊红染色切片可见肝血窦内有大量炎性细胞浸润，肝细胞嗜酸性变，胞浆内疏松化，肝细胞呈气球样变，偶可见斑片状坏死，散在点状坏死灶；Bcl-2表达下降，Bax表达明显升高(P < 0.05)；Caspase-9 mRNA表达、肿瘤坏死因子α及白细胞介素1β水平明显升高(P < 0.05)；②与冷缺血再灌注组比较, 姜黄素后处理组天门冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸转移酶、丙二醛和凋亡指数明显下降(P < 0.05)；苏木精-伊红染色可见肝血窦内炎性浸润明显减轻，胞浆嗜酸性变和气球样变的肝细胞明显减少，但偶可见少量散在的点状坏死；Bcl-2表达升高，Bax表达明显下降(P < 0.05)；Caspase-9 mRNA表达、肿瘤坏死因子α及白细胞介素1β水平明显下降(P < 0.05)；③姜黄素后处理组上述各指标与地塞米松组比较差异无显著性意义(P > 0.05)；④综上所述，姜黄素后处理可减轻大鼠肝脏冷缺血再灌注损伤，其作用机制可能通过上调Bcl-2/Bax比值，抑制凋亡启动子Caspase-9 mRNA的表达，减少炎性因子肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β的释放，发挥抗凋亡的肝保护作用。

ORCID: 0000-0002-8442-8113(邹海波)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 姜黄素, 后处理, 肝脏, 冷缺血再灌注, Bcl-2, Bax

Abstract:

BACKGROUND: Curcumin pre-conditioning can alleviate liver injury induced by limb ischemia/reperfusion (I/R), but whether curcumin post-conditioning has protective effect against liver cold I/R injury and its mechanism are still poorly studied.

OBJECTIVE: To investigate the effects of curcumin post-conditioning on hepatocyte apoptosis in rats with liver cold I/R injury in rats.

METHODS: Eighty adult male Sprague-Dawley rats were randomly divided into four groups (n=20 per group) by using a random number table: sham group, I/R group, curcumin post-conditioning group (I/R+Cur group), and dexamethasone group (I/R+Dex group). The liver blood flow was completely blocked. Then the splenic vein and the adrenal vein were used as the inflow and outflow tracts to inject 0 ^oC compound Ringer lactate solution followed by cold perfusion for 30 minutes. After stopping cold perfusion, the proximal splenic vein and the right adrenal vein were ligated to remove the spleen, and then the blood flow in the liver restored. The cold I/R model was successfully established. After 30 minutes of cold ischemia, 60 mg/kg curcumin was injected into the rat tail vein in the I/R+Cur group, 0.5 mg/kg dexamethasone was injected into the rat tail vein in the I/R+Dex group, and the same amount of saline was injected in the other groups. Blood sample was taken from the carotid artery at 6 hours after reperfusion. Serum levels of aspartate aminotransferase and alanine transferase were detected. Then the rats were sacrificed to detect malondialdehyde level in liver tissue, observe liver pathological changes by hematoxylin-eosin staining, measure hepatocyte apoptosis index by Hoechst 33258 staining, detect expression of Bcl-2 and Bax protein by western blot, expression of caspase-9 mRNA by RT-PCR, and levels of tumor necrosis factor-α and interleukin-1β by ELISA.

RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the sham group, aspartate aminotransferase, alanine transferase, malondialdehyde levels and apoptosis index in the I/R group increased significantly (P < 0.05). Hematoxylin-eosin staining showed a large number of inflammatory cells infiltrated in the hepatic sinusoids, eosinophilic changes of hepatocytes, cytoplasmic loosening, balloon-like changes of hepatocytes, occasional patchy necrosis, and scattered punctate necrosis foci in the I/R group. The I/R group had significantly decreased expression of Bcl-2, and increased expression of Bax (P < 0.05), Caspase-9 mRNA, tumor necrosis factor-α and interleukin-1β (P < 0.05). Compared with the I/R group, aspartate aminotransferase, alanine transferase, malondialdehyde levels and apoptosis index in the I/R+Cur group decreased significantly (P < 0.05). Hematoxylin-eosin staining showed that inflammatory infiltration in the hepatic sinusoids decreased significantly, eosinophilic and balloon-like hepatocytes decreased significantly, but occasionally a small amount of scattered punctate necrosis was observed in the I/R+Cur group. There was significantly increased Bcl-2 expression, and significantly decreased Bax (P < 0.05), Caspase-9 mRNA, tumor necrosis factor-α and interleukin-1β (P < 0.05). No significant differences were observed between I/R+Cur group and I/R+Dex group (P > 0.05). In a word, curcumin-post conditioning can alleviate liver injury induced by cold I/R in rats. Its mechanism may be related to down-regulation of Bcl-2/Bax ratio, inhibition of caspase-9 mRNA expression, and reduction of the release of tumor necrosis factor-α and interleukin-1β, therefore playing an anti-apoptotic role in liver protection.

Key words: curcumin, post-conditioning, liver, cold ischemia-reperfusion, Bcl-2, Bax

中图分类号:

邹海波, 施鹏, 孙晓峰. 大鼠肝脏冷缺血再灌注损伤时姜黄素后处理对肝细胞凋亡的影响[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(14): 2211-2216.

Zou Haibo, Shi Peng, Sun Xiaofeng. Effects of curcumin post-conditioning on hepatocyte apoptosis in rats with liver cold ischemia/reperfusion injury [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(14): 2211-2216.

图/表（结果） 7

2.1 实验动物数量分析 80只SD大鼠均进入结果分析，无脱落。

2.2 各组生化指标比较与假手术组比较，缺血再灌注组天门冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸转移酶、丙二醛水平显著升高(P < 0.05)；与缺血再灌注组比较，姜黄素后处理组天门冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸转移酶、丙二醛水平显著下降(P < 0.05)；姜黄素后处理组与地塞米松组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见表1。

2.3 各组苏木精-伊红染色比较见图1。在光镜下可见，假手术组肝细胞条索排列整齐，肝窦内可见红细胞和少量白细胞浸润；缺血再灌注组可见肝血窦内有大量炎性细胞浸润，肝细胞嗜酸性变，胞浆内疏松化，肝细胞呈气球样变，偶可见斑片状坏死，散在点状坏死灶；姜黄素后处理组可见肝血窦内炎性浸润明显减轻，胞浆嗜酸性变和气球样变的肝细胞明显减少，但偶可见少量散在的点状坏死；地塞米松组视野内无点状坏死灶，肝血窦内炎性浸润接近假手术组，但仍有少量的肝细胞胞浆呈浓缩改变，累及单个或几个细胞。

2.4 各组肝细胞凋亡指数、肿瘤坏死因子α及白细胞介素1β水平见图2和表2。与假手术组比较，缺血再灌注组肝细胞凋亡指数、肿瘤坏死因子α及白细胞介素1β水平明显升高(P < 0.05)；与缺血再灌注组比较，姜黄素后处理组肝细胞凋亡指数、肿瘤坏死因子α及白细胞介素1β水平显著下降(P < 0.05)；姜黄素后处理组与地塞米松组比较差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.5 各组肝脏Bcl-2和Bax蛋白表达见表3。与假手术组比较，缺血再灌注组Bcl-2蛋白表达下降，Bax蛋白表达明显升高(P < 0.05)；与缺血再灌注组比较，姜黄素后处理组Bcl-2蛋白表达升高，Bax蛋白表达显著下降(P < 0.05)；姜黄素后处理组与地塞米松组比较差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.6 各组肝脏促细胞凋亡基因Caspase-9 mRNA的表达见图3。

图3可见，与假手术组比较，缺血再灌注组Caspase-9 mRNA表达明显升高(P < 0.05)；与缺血再灌注组比较，姜黄素后处理组Caspase-9 mRNA表达显著下降(P < 0.05)；姜黄素后处理组与地塞米松组比较差异无显著性意义(P > 0.05)。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 2018年9月在沈阳医学院附属中心医院动物实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验药品、试剂与仪器姜黄素(批号：86M1611V，Sigma公司，美国)；碱性磷酸酶标记二抗(Santa Cruz，美国)；Scion Image图像分析系统(Apple，美国)；Trizol (Invitrogen，美国)；Caspase-9 mRNA引物[宝生物工程(大连)有限公司]；兔抗大鼠Bcl-2和Bax多克隆抗体、兔抗大鼠β-actin多克隆抗体(Abcam，美国)；生物素化抗体工作液和终止液(北京勤邦生物技术有限公司)；Hoechst33258染色液(上海通蔚生物有限公司)；ES-1000 SPM超声血流仪(Hayashi Denki，日本)；DYY-6B型电泳仪(北京六一仪表厂)；全自动生化分析仪(Olympus，日本)；PCR扩增仪(Biometra，德国)；BX-41型显微镜(Olympus，日本)。

1.3.2 实验动物分组选用成年雄性SD大鼠80只，体质量250-300 g，由中国医科大学实验室中心提供；采用随机数字表法分为4组(n=20)：假手术组、缺血再灌注组、姜黄素后处理组、地塞米松组。

1.4 实验方法

1.4.1 肝脏缺血再灌注模型制备及各组干预方法造模前12 h禁食，自由饮水。参照胡建平法^[7]，脾静脉近端插管作为肝脏灌注液的流入道，右肾上腺静脉作为灌注液流出道。夹闭肝固有动脉、幽门静脉及肠系膜上静脉，距门静脉远端0.8 cm处结扎脾动、静脉；向肝脏灌注2 mL含肝素温生理盐水，夹闭流经肝脏的上、下腔静脉，使全肝处于血流阻断状态；开放流出道，经导管持续滴0 ℃复方乳酸林格液，维持滴速6-8 mL/min，压力10 kPa(1 kPa= 7.5 mm Hg)，冷灌注时间为30 min；停止冷灌注后，结扎近端脾静脉和右肾上腺静脉，切除脾脏，随即恢复肝脏血流，进行再灌注。肝血流再灌注6 h后处死动物，留取血液和肝脏标本。

在大鼠冷缺血30 min后，姜黄素后处理组经尾静脉注射姜黄素60 mg/kg，地塞米松组尾静脉注射地塞米松 0.5 mg/kg，其他组以等量的生理盐水替代。

1.4.2 生化指标的检测经下腔静脉取血4-6 mL，放入4 ℃离心机高速离心，取上层血清，用Olympus5400全自动生化分析仪检测血清中天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸转移酶(ALT)水平；取肝脏组织，测定肝组织内丙二醛水平。

1.4.3 肝组织苏木精-伊红染色将新鲜肝组织置入体积分数为10%甲醛溶液中固定，石蜡包埋、切片，苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察。

1.4.4 肝细胞凋亡检测常规包埋切片，PBS洗涤；加入Hoechst33258染色液0.5 mL染色5 min，PBS洗涤；将切片置于载玻片上，滴入抗淬灭封固液，上盖玻片，在400倍视野荧光显微镜下观察。镜下可见正常细胞的细胞核呈圆形、暗蓝色；凋亡细胞的染色质固缩，细胞核致密浓染或呈碎块状致密浓染，颜色变白，发亮。每张切片随机取5个视野，每个视野计数100个细胞。以凋亡细胞数占肝细胞总数的比例作为凋亡指数，表示肝细胞凋亡情况。

1.4.5 Westen blot法检测Bcl-2和Bax蛋白表达取10%肝脏组织匀浆，离心提取总蛋白，进行蛋白定量。经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、转膜、封闭后，分别加入兔抗大鼠Bcl-2、Bax、β-actin多克隆抗体，4 ℃孵育过夜；加入碱性磷酸酶标记二抗，室温孵育2 h，酶法显色，扫描。采用Scion Image图像分析系统分析，目的产物与β-actin灰度值的比值反映Bcl-2、Bax蛋白表达水平。

1.4.6 RT-PCR检测Caspase-9 mRNA表达水平取10%肝脏组织匀浆，Trizol法抽提总RNA，反转录合成cDNA，然后PCR扩增，引物序列如下：Caspase-9上游引物：5'-GGC TGT CTA CGG CAC AGA GA-3'，下游引物：5'-GTG GCT CGG GGT TAG-3'；β-actin上游引物：5'-GGG ACG CGT GAG CAT-3'，下游引物：5'-CAA GGA TGG GAC CCA CT-3'。Caspase-9反应条件：94 ℃预变性2 min；95 ℃ 45 s，57 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，35个循环；72 ℃延伸5 min。β-actin反应条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃ 40 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 60 s，30个循环；72 ℃延伸5 min。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，凝胶成像仪成像。采用Scion Image图像分析系统分析，目的产物与β-actin灰度值的比值反映Caspase-9 mRNA表达水平。

1.4.7 ELISA法检测肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β水平取10%肝脏组织匀浆，每组5孔，将肿瘤坏死因子α标准品按倍比梯度稀释，分别加入检测孔(100 μL/孔)。收集上清液，依次加入待测孔(100 μL/孔)，封板，37 ℃温箱避光孵育2 h；洗涤，加入生物素化抗体工作液(100 μL/孔)，封板，室温孵育1 h；洗涤，加入HRP工作液(100 μL/孔)，室温孵育20 min；洗涤，加入显色剂(100 μL/孔)，避光孵育20 min；加入终止液(50 μL/孔)，轻轻摇匀后置于酶标仪上测 450 nm处吸光度值作为测量值。采用Curve Expert软件做出标准曲线，并输入相应的吸光度值计算出肿瘤坏死因子α水平；同理，检测白细胞介素1β水平。

1.5 主要观察指标 ①血清天门冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸转移酶水平；②肝组织丙二醛水平；③肝组织光镜下形态结构；④肝细胞凋亡指数；⑤肝组织肿瘤坏死因子α及白细胞介素1β水平；⑥肝组织Caspase-9 mRNA表达水平；⑦肝组织Bcl-2、Bax蛋白表达水平。

1.6 统计学分析采用SPSS 13.0软件进行分析，正态分布的计量资料以x(_)±s表示，组间比较采用单因素方差分析和LSD检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

随着外科领域高端手术的开展，“精准手术”和“精准麻醉”的理念越来越引起医疗界的关注。在肝移植手术中，如何最大限度地保证供者器官在离体后的正常功能，便成为了首要任务^[7]。因此，任何可能造成损伤的环节都值得引起临床医务工作者足够的重视。虽然在肝移植围术期已经应用了各种手段减少肝脏缺血再灌注引起的损伤，但冷缺血再灌注期间，仍然是影响肝脏正常功能最严重的阶段，如何能够在冷缺血再灌注期间降低肝脏损伤便成为现阶段肝移植手术的热点话题。

冷缺血再灌注是指离体脏器冷藏开始，到器官恢复血运灌注的过程^[8-9]。最新研究表明，虽然离体肝脏进入冷藏后可以减轻肝脏由于缺血诱发的损伤，但在此过程中仍然存在肝细胞的凋亡和不同程度的坏死^[10-11]；再灌注发生后缺血肝脏得到了充足的血运供应，但损伤却并未终止；相反，再灌注所释放大量氧自由基、肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β等炎性递质，驱动中性粒细胞集聚、黏附、渗出，进一步加剧肝脏功能的损伤^[12-13]。

姜黄素是从姜科、南星科中一些植物根茎中提取的一种化学成分^[14]。有研究证明，姜黄素具有抗氧化应激、抑制炎症细胞因子释放、抗细胞凋亡等广泛的药理活性^[15-17]。姜黄素抗炎和抗氧化作用已引起国内外学者的广泛认同。

Bcl-2/Bax比值是机体细胞走向存活和凋亡的风向标^[18-19]。Bcl-2蛋白是bcl-2原癌基因的编码产物，是机体细胞赖以生存的存活促进因子^[20-21]，归属于细胞膜整合蛋白，分子量为26 kDa，定位于线粒体、内质网和连续的核周膜，在胚胎组织中广泛表达。Bax是Bcl-2同源的水溶性相关蛋白，是bcl-2基因家族中细胞凋亡促进基因，Bax过度表达可拮抗Bcl-2的保护作用，从而诱导细胞凋亡^[22-23]。正常生理状态下，Bcl-2/Bax比值比较稳定，但在外源性或内源性伤害性刺激诱导下，Bcl-2/Bax比值明显降低，此时提示细胞正在向凋亡的趋势转化^[24]。

Caspase是一组存在于细胞质中具有类似结构的蛋白酶，其中Caspase-9是一种促凋亡因子，参与细胞内在凋亡途径^[25-26]，以级联的方式切割一系列胞内蛋白，最终导致细胞凋亡^[27]。

既往的研究证实，姜黄素预处理对大鼠肝脏缺血再灌注造成的损伤具有保护作用^[28]，但姜黄素后处理对大鼠肝脏是否具有保护作用及其机制，目前尚无定论。大鼠肝脏冷缺血再灌注发生后，光镜下可见满视野肝血窦内炎性细胞浸润，肝细胞水肿，胞浆疏松化，呈气球样变，并可见斑片样坏死灶；进一步应用Western blot法和RT-PCR法分别检测到Bcl-2/Bax比值下降和Caspase-9 mRNA表达增加；应用ELISA法检测到炎性细胞因子肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β大量释放。肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β是启动炎症反应的主要细胞因子。姜黄素后处理组肝脏冷缺血再灌注损伤明显减轻，胞浆内嗜酸性染色明显减少，肝细胞变性有所减轻，但仍可见少量散在的点状坏死；同时Bcl-2/Bax显著升高，Caspase-3 mRNA、肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β也显著下降，提示姜黄素后处理可以有效降低肝脏冷缺血再灌注造成的损伤。姜黄素后处理组和地塞米松组差异无显著性意义，进一步证实了姜黄素后处理的保护作用。实验表明，姜黄素后处理通过上调Bcl-2蛋白家族的促凋亡成员和抗凋亡成员之间相互作用的细胞内平衡，从而抑制凋亡小体的组装，抑制凋亡启动者Caspase-9的活性，最终发挥肝脏保护作用。在临床下肢外科手术中，术后很多患者出现消化功能障碍，表现为恶心、呕吐、肝功异常等，其发生原因和发病机制目前没有统一定论。结合前期研究已经证实，姜黄素后处理可以下调Notch2/Hes-1信号通路，对缺血再灌注造成的损伤具有保护作用^[29-30]；另有文献表明，姜黄素后处理可以通过下调TLR4/NF-κB信号通路，从而抑制肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β等炎性因子的释放^[31-32]。因此推测，姜黄素后处理抗凋亡作用的机制可能与下调Notch2/Hes-1和TLR4/NF-κB信号通路有关。

综上所述，姜黄素后处理可减轻大鼠肝脏冷缺血再灌注损伤，其作用机制可能是通过上调Bcl-2/Bax比值，抑制凋亡启动子Caspase-9 mRNA的表达，减少炎性因子肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β的释放，发挥抗凋亡的肝保护作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

大鼠肝脏冷缺血再灌注损伤时姜黄素后处理对肝细胞凋亡的影响

Effects of curcumin post-conditioning on hepatocyte apoptosis in rats with liver cold ischemia/reperfusion injury

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