同一创面不同病程糖尿病足创面组织细胞凋亡率、Bcl-2、Bax及肿瘤坏死因子α的相关性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2578

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (20): 3186-3190.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2578

• 肌肉肌腱韧带组织构建 tissue construction of the muscle, tendon and ligament • 上一篇下一篇

同一创面不同病程糖尿病足创面组织细胞凋亡率、Bcl-2、Bax及肿瘤坏死因子α的相关性

郑敏¹，殷学利²，黄素群²

重庆医科大学附属第二医院，¹呼吸与危重症医学科，²急诊科，重庆市 400010

收稿日期:2019-07-25 修回日期:2019-08-01 接受日期:2019-09-17 出版日期:2020-07-18 发布日期:2020-04-13
通讯作者: 黄素群，重庆医科大学附属第二医院急诊科，重庆市 400010
作者简介:郑敏，女，1979年生，重庆市人，汉族，2019年重庆医科大学毕业，硕士，副主任护师，讲师，主要从事急慢性疑难伤口护理研究。
基金资助:
重庆市渝中区科技计划项目(20150127)；重庆医科大学附属第二医院护理骨干科研资助计划项目(2015)

Correlation between apoptosis rate and expression of Bcl-2, Bax and tumor necrosis factor alpha in diabetic foot ulcer with different disease courses

Zheng Min¹, Yin Xueli², Huang Suqun²

¹Department of Respiratory and Critical Care Medicine, ²Department of Emergency, Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400010, China

Received:2019-07-25 Revised:2019-08-01 Accepted:2019-09-17 Online:2020-07-18 Published:2020-04-13
Contact: Huang Suqun, Department of Emergency, Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400010, China
About author:Zheng Min, Master, Associate chief nurse, Lecturer, Department of Respiratory and Critical Care Medicine, Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400010, China
Supported by:
Science and Technology Plan Project of Chongqing Yuzhong District, No. 20150127; Nursing Key Research Project of Chongqing Medical University Second Affiliated Hospital, No. 2015

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

“4C”法：通过颜色(Colour)、毛细血管出血(Capillary bleeding)、收缩力(Contractility)和紧张度(Consistency)判断是否坏死的方法。一般认为组织呈现暗紫/黄/白色、质地软、切割不出血和刺激无收缩状态，为坏死指征，在临床清创时应被清除。

细胞凋亡：是指机体为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主、有序性的死亡形式。主要分为生理和病理两大类，生理性凋亡是指机体内某些细胞生来就注定在一段时间后死去，在尽完自己的职责之后正常死亡；而病理性凋亡则是指细胞在没有完成自己的使命时受到不可抗外力刺激而不正常死亡，从而引发各种疾病。

背景：研究发现，难愈性溃疡创面不易愈合与细胞凋亡失衡和炎症失调有关，以往的研究均在不同个体的某一类型组织取样研究，研究结果数据间可能存在个体差异的影响，且无同一糖尿病足创面不同病程组织的细胞凋亡率、Bcl-2、Bax、肿瘤坏死因子α表达水平之间相关性研究报道。

目的：分析糖尿病足不同病程创面组织细胞凋亡率、Bcl-2、Bax和肿瘤坏死因子α表达水平间的关系及作用机制。

方法：重庆医科大学附属第二医院急诊科收治的15例Wagner 2，3级糖尿病足患者，选择典型的糖尿病足创面，采用“4C”法将局部感染控制后的创面组织区分为坏死、过渡和正常组织后分别采集标本，测定细胞凋亡率、Bcl-2、Bax、Bax/Bcl-2和肿瘤坏死因子α，并对结果进行统计分析。研究经重庆医科大学附属第二医院伦理委员会批准，编号：(2019)329号，所有患者均签署了知情同意书。

结果与结论：①糖尿病足创面正常、过渡、坏死组织的细胞凋亡率分别为(16.67±2.48)%、(43.68±2.22)%和(72.12±4.53)%，差异有显著性意义(P < 0.01)；②坏死、过渡和正常组织间Bcl-2、Bax、肿瘤坏死因子α表达水平和Bax/Bcl-2差异有显著性意义(P < 0.01)，Bcl-2表达：坏死组织<过渡组织<正常组织，Bax、肿瘤坏死因子α表达及Bax/Bcl-2：坏死组织>过渡组织>正常组织；③Bcl-2、Bax、Bax/Bcl-2、肿瘤坏死因子α和细胞凋亡率间呈曲线关系，曲线回归分析结果显示，糖尿病足创面内肿瘤坏死因子α与Bax、Bax/Bcl-2、细胞凋亡率呈高度正相关，与Bcl-2呈高度负相关；④从结果可得出，细胞凋亡机制与炎症反应参与了糖尿病足创面病理过程，其作用机制可能与下调Bcl-2表达，上调Bax和肿瘤坏死因子α表达，提高Bax/Bcl-2水平，引起组织细胞凋亡率增大有关。

ORCID: 0000-0002-9760-8666(郑敏)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 糖尿病足, “4C”法, 正常组织, 过渡组织, 坏死组织, 细胞凋亡率, Bcl-2, Bax, 肿瘤坏死因子α

Abstract:

BACKGROUND: Non-healing of refractory ulcer wounds is found to be associated with imbalance of apoptosis and dysregulation of inflammation. Previous studies have sampled a certain type of tissue in different individuals, but individual differences maybe exist among the study data. There is still no report on the correlation between apoptotic rate, expression levels of Bcl-2, Bax, Bax/Bcl-2 and tumor necrosis factor α (TNF-α) in wound tissue of diabetic foot ulcer with different disease courses.

OBJECTIVE: To study the relationship between apoptotic rate and expression levels of Bcl-2, Bax and TNF-α in the wound tissue of diabetic foot ulcer with different disease courses and the mechanism of action.

METHODS: Fifteen patients with typical diabetic foot of Wagner grades 2-3 were selected from the Department of Emergency, Chongqing Medical University. The wound tissue was classified as necrotic, transitional and normal tissue using the “4C” method after infection control. The apoptotic rate and levels of Bcl-2, Bax, TNF-α and Bax/Bcl-2 were detected using immunohistochemistry, and the results were statistically analyzed. The study protocol was approved by the Ethics Committee of the Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, with the approval No. (2019)329. All patients signed an informed consent.

RESULTS AND CONCLUSION: The apoptotic rates of normal, transitional and necrotic tissues of diabetic foot were significantly different, which were (16.67±2.48)%, (43.68±2.22)% and (72.12±4.53)%, respectively (P < 0.01). Significant differences in Bcl-2, Bax, TNF-α and Bax/Bcl-2 levels were also found in normal, transitional and necrotic tissues (P < 0.01). The Bcl-2 level was ranked as necrotic tissue < transitional tissue < normal tissue; and the Bax, TNF-α, and Bax/Bcl-2 levels were ranked as necrotic tissue > transitional tissue > normal tissue. There was a curve relationship between Bcl-2, Bax, Bax/Bcl-2, TNF-α expression and apoptotic rate. The curvilinear regression analysis indicated that the expression of TNF-α had a highly positive correlation with the expression of Bax and Bax/Bcl-2 and had a highly negative correlation with the expression of Bcl-2. Therefore, apoptotic mechanism and inflammatory reaction are involved in the pathological process of diabetic food ulcer, and the mechanism may be related to the down-regulation of Bcl-2 expression, up-regulation of Bax and TNF-α expression, and increase of Bax/Bcl-2, thereby increasing the apoptotic rate.

Key words: diabetic foot, “4C” method, normal tissues, transitional tissues, necrotic tissues, apoptosis rate, Bcl-2, Bax, tumor necrosis factor α

中图分类号:

郑敏, 殷学利, 黄素群. 同一创面不同病程糖尿病足创面组织细胞凋亡率、Bcl-2、Bax及肿瘤坏死因子α的相关性[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(20): 3186-3190.

Zheng Min, Yin Xueli, Huang Suqun. Correlation between apoptosis rate and expression of Bcl-2, Bax and tumor necrosis factor alpha in diabetic foot ulcer with different disease courses[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(20): 3186-3190.

图/表（结果） 2

2.1 参与者数量分析纳入患者15例，试验过程无脱落，全部进入结果分析。

2.2 不同病程创面组织的细胞凋亡率比较糖尿病足创面正常、过渡、坏死组织的细胞凋亡率分别为(16.67± 2.48)%、(43.68±2.22)%和(72.12±4.53)%，差异有显著性意义(F=1 416.228，P < 0.01)。进一步比较发现，正常组织显著低于过渡组织(F=1 511.398，P < 0.01)，而过渡组织显著低于坏死组织(F=698.082，P < 0.01)。

2.3 Bcl-2、Bax和肿瘤坏死因子α表达水平比较 Mauchly球形检验表明，Bcl-2和Bax未拒绝球形假设 (χ²_Bcl-2=4.926，P=0.085；χ²_Bax=4.212，P=0.122)；Bax/Bcl-2和肿瘤坏死因子α拒绝球形假设(χ²_Bax/Bcl-2= 22.589，χ²_TNF-α=19.558，P < 0.01)，采用Greenhouse- Geisser校正，ε_Bax/Bcl-2=0.548和ε_{肿瘤坏死因子}_α=0.562。单因素重复测量方差分析结果表明(表1)，不同类型创面组织间Bcl-2、Bax和肿瘤坏死因子α表达水平及Bax/Bcl-2的差异有显著性意义(P < 0.01)。进一步比较发现，Bcl-2在正常组织的表达水平显著高于过渡组织(P < 0.01)，而过渡组织显著高于坏死组织(P < 0.01)；Bax、肿瘤坏死因子α表达水平及Bax/Bcl-2则相反，结果为正常组织显著低于过渡组织(P < 0.01)，而过渡组织显著低于坏死组织(P < 0.01)。

2.4 相关性分析 Bcl-2、Bax和肿瘤坏死因子α表达水平与细胞凋亡率之间明显呈单调非线性关系，其中Bax、肿瘤坏死因子α与Bcl-2呈负相关，而肿瘤坏死因子α与Bax、Bax/Bcl-2和细胞凋亡率以及Bax/Bcl-2与细胞凋亡率之间呈正相关(图2)。曲线回归的拟合方程分别为：Bcl-2= -0.356 9-0.104 2 ln(Bax)(R²=0.933，P < 0.01)、Bax/Bcl-2= 350.356 5 肿瘤坏死因子α^1.789
9(R²=0.949，P < 0.01)、Bcl-2=0.001 4 肿瘤坏死因子α^-^{0.935 2}(R²=0.924，P < 0.01)、Bax=0.055 7+0.009 6 ln(肿瘤坏死因子α)(R²=0.930，P < 0.01)、细胞凋亡率=79.772 3+15.696 7 ln(Bax/Bcl-2)(R²= 0.952，P < 0.01)和细胞凋亡率=172.582 3+28.280 9 ln(肿瘤坏死因子α)(R²=0.915，P < 0.01)。

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引言

材料方法

1.1 设计病历分析，对比观察。

1.2 时间及地点病例来自重庆医科大学附属第二医院急诊科2017年6月至2018年12月收治的糖尿病足患者。

1.3 对象糖尿病足创面标本取自重庆医科大学附属第二医院急诊科收治的糖尿病足患者。

1.3.1 纳入标准 ①糖尿病诊断参照美国糖尿病协会(ADA)2016年标准，空腹血糖≥7.0 mmol/L和/或餐后2 h血糖≥11.1 mmol/L；②Wagner分级法2级至3级的创面；③能够根据“4C”法将创面区分为坏死、过渡和正常组织区域的创面。

1.3.2 排除标准 ①创面仅为正常健康组织或坏死组织；②精神疾病、心肺功能障碍性疾病、出血性疾病、严重全身性疾病者；③既往有局麻药过敏史者。

研究共纳入15例糖尿病足患者，其中男性12例，女性3例；年龄36-88(59.7±12.3)岁；糖尿病病程4-30(13.6±8.8)年，糖尿病足病程4-60(27.9±27.0) d；创面面积16-96 (40.7±20.8) cm²；Wagner分级2级4例，3级11例。每例患者选取1个典型创面进行研究。研究经重庆医科大学附属第二医院伦理委员会批准，编号：(2019)329号，所有患者均签署了知情同意书。

1.4 方法

1.4.1 研究步骤选取的典型创面在局部感染控制后，并且能够根据“4C”法将创面区分为坏死、过渡和正常组织区域时取样。具体方法为：①创面清洗：用5%聚维酮碘消毒创面周围皮肤后，使用生理盐水以55.16-82.74 kPa的压力进行创面冲洗，去除创面异物、细菌等；②创面组织的区域划分：不考虑骨骼和肌腱，按照“4C”法，将创面上呈现暗紫/黄/白色、质地软、切割不出血和刺激无收缩状态的部分划分为坏死组织区域，而呈现鲜红/牛肉红色、质地有弹性、切割立即出血和刺激立即收缩的部分划分为正常组织区域，程度介于二者之间的为过渡组织区域(图1)；③标本采集：对坏死和正常组织区域，在对应区域中心位置附近切取长宽为0.3-0.5 cm的标本1个；对过渡组织区域，在充分考虑其内部组织在颜色、紧张度、收缩性及毛细血管出血(即“4C”特征)方面差异的基础上，在每一个创面上切取2个不同程度的长宽为0.3-0.5 cm的标本，以2个标本的平均测定值作为过渡组织的观测值。所有标本提取后用40 g/L多聚甲醛溶液固定，然后进行石蜡包埋切片，随后测定Bcl-2、Bax、Bax/Bcl-2、肿瘤坏死因子α和细胞凋亡率。

1.4.2 计算细胞凋亡率取包埋的组织为样本，每个样本取切片1张，用TUNEL法进行凋亡细胞染色检测。按试剂盒说明流程进行操作。每张切片随机挑选3个200倍视野进行拍照。应用Image-Pro Plus 6.0软件选取相同的棕黄色细胞核作为判断所有照片阳性细胞(即凋亡细胞)的统一标准，选取相同的蓝色细胞核为阴性细胞的统一标准，计算细胞凋亡率=阳性细胞数/(阳性细胞数+阴性细胞数)× 100%。

1.4.3 检测Bcl-2、Bax和肿瘤坏死因子α表达取包埋的组织为样本，每个样本取切片1张，采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法(S-P法)进行免疫组织化学染色，分别以Bax抗体、Bcl-2抗体(均美国Bioworld公司)和肿瘤坏死因子α抗体(武汉博士德生物工程公司)作为一抗，检测Bcl-2、Bax和肿瘤坏死因子α的表达。每张切片随机挑选3个200倍视野进行拍照。应用Image-Pro Plus 6.0软件选取相同的棕黄色作为判断所有照片阳性的统一标准，进行Bcl-2、Bax和肿瘤坏死因子α表达的半定量分析，以平均吸光度值(A)表示，A值越大表明阳性表达水平越高。

1.4.4 计算Bax/Bcl-2 Bax/Bcl-2为Bax与Bcl-2表达水平之比，计算公式为Bax/Bcl-2=Bax÷Bcl-2。

1.5 主要观察指标 ①不同病程创面组织的细胞凋亡率；②Bcl-2、Bax和肿瘤坏死因子α表达；③相关性分析。

1.6 统计学分析统计分析使用SPSS 22.0。计量资料以 x(_)±s表示；不同类型创面组织间比较采用单因素重复测量方差分析，若不满足球形假设，则进行Greenhouse-Geisser校正；相关性分析采用曲线回归。以P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

细胞凋亡在创面损伤与修复各阶段过程中均有参与，若细胞凋亡过度或凋亡受阻，将会导致创面愈合不良^[8]。宋春雨等^[9]对近期相关文献的研究结果表明，糖尿病及其并发症的发生与细胞凋亡的关系尤为密切。吕晓玉等^[3]研究也发现，糖尿病足溃疡创面标本中细胞凋亡分子的含量显著高于对照组的正常创面标本(P < 0.01)。细胞凋亡分为生理性和病理性两大类，糖尿病人体内的细胞凋亡就是指病理性的^[10]。付小兵等^[11]通过TUNEL法观察糖尿病慢性溃疡创面发现，从溃疡边缘到溃疡中心部位，凋亡阳性细胞不仅明显增多，而且也呈现一些特征性改变，如发生核固缩与边缘化，认为在某些创伤与疾病条件下组织修复细胞发生过度凋亡将导致创面愈合发生障碍，是某些慢性难愈合创面的发病机制之一。此次研究发现，细胞凋亡率在不同病期组织间差异显著(P < 0.01)，其中坏死组织细胞凋亡率(72.12±4.53)%高于过渡组织(43.68±2.22)%(P < 0.01)，过渡组织则高于正常组织(16.67±2.48)%(P < 0.01)，表明在糖尿病足致病因子共同作用下，随着病程发展，病理性凋亡迅速增加，创面组织发生细胞过度凋亡，导致创面愈合发生障碍，是引起糖尿病足创面慢性难愈的发病机制之一。

有文献指出，各种因素可能通过影响创面组织细胞的Bcl-2、Bax基因及其产物表达的变化，引起糖尿病溃疡创面凋亡细胞数量的增多^[12]，这可能是最终导致创面迁延不愈的原因之一。Bcl-2与Bax是一对作用相互对抗的因子，前者具有抗凋亡作用，后者则可促使细胞凋亡^[13]，它们在细胞中的表达对调控细胞凋亡具有重要意义^[14]。当Bcl-2表达上调即抑制细胞凋亡，而Bax表达上调即导致细胞凋亡^[15-16]。OLTVAI等^[17]认为Bcl-2与Bax存在着严格的化学计量关系，其比值对于决定细胞接受信号后是否存活有关键性的作用。陈聪等^[18]认为，Bax是重要的细胞凋亡因子，其表达水平的异常与糖尿病各种并发症发生发展密切相关。目前，有关糖尿病足创面上细胞凋亡发生机制的报道还较少，与此次研究相关的是陈伟等^[19]的研究，该研究观察临床证实的难愈性溃疡上Bax和Bcl-2蛋白在溃疡、溃疡边缘和正常皮肤组织中的表达特征及其对溃疡形成的影响，结果表明从正常皮肤到溃疡组织，Bcl-2含量逐渐下降，而Bax蛋白表达呈升高趋势，Bax和Bcl-2两种蛋白可能与溃疡创面处细胞凋亡增加相关，从而导致伤口愈合迟缓和溃疡的发生。此次研究发现，Bcl-2、Bax高度负相关，呈单调递减的对数函数关系，Bcl-2=-0.356 9- 0.104 2 ln(Bax)(R²=0.933，P < 0.01)。同时，同一创面不同病期组织间Bcl-2、Bax、Bax/Bcl-2表达水平的差异显著(P < 0.01)。其中，正常组织中Bcl-2表达较多，Bax少量表达，Bax/Bcl-2很小，细胞凋亡率较低；随着病程发展，Bcl-2表达逐渐降低，Bax表达逐渐增高，Bax/Bcl-2急剧增大，细胞凋亡率也以单调递增的对数函数关系随着Bax/Bcl-2增加而迅速增大。这一结果说明，随着病程发展，各种致病因子引起创面组织中Bax与Bcl-2表达水平发生有规律的变化，使Bax/Bcl-2变大，造成凋亡细胞数增加，直至组织坏死，是糖尿病足创面组织病理发生发展的重要调控机制。另外，通过观察Bax/Bcl-2与细胞凋亡率关系曲线，发现二者在过渡组织阶段变化尤为剧烈，而后渐趋平缓，提示应在糖尿病足创面组织病程早期开展治疗，降低Bax/Bcl-2水平，避免细胞过渡凋亡，促进创面愈合。

炎症失调是慢性创面的主要病理学因素之一，从损伤部位炎症因子的最初释放，到炎性细胞从组织损伤部位开始消除，直至炎症完全消退的整个过程中，炎症的失调都会导致严重后果^[6]。肿瘤坏死因子α是由单核巨噬细胞分泌的细胞因子，既具有强大的促炎活性，也具有引起组织发生炎症损伤的活性^[20]。相关研究发现糖尿病足溃疡过度产生肿瘤坏死因子α，局部炎症增加，减少了创面细胞迁移及增值，促进细胞凋亡，影响伤口愈合^[21]。此次研究结果表明，肿瘤坏死因子α表达呈现正常组织(0.004 2±0.000 7)明显低于过渡组织(0.010 5±0.000 6)，过渡组织则明显低于坏死组织(0.029 4±0.004 0)规律(P < 0.01)，说明随着病程发展，糖尿病足创面组织发生炎症反应过度激活，进而加重创面内炎症反应所造成的组织损伤。

糖尿病溃疡创面内细胞过度凋亡是重要的病理特征，但具体的调控机制尚未完全明确^[3]。一种观点认为，肿瘤坏死因子α诱导细胞凋亡经历了起始、效应、降解3个阶段^[22]。起始阶段肿瘤坏死因子α与细胞膜上的肿瘤坏死因子受体相结合引发细胞内一系列生化反应而形成一条或数条信号转导通路，效应阶段通过抗凋亡因子与促凋亡因子之间的不平衡来决定细胞的死亡，最终细胞进入降解阶段，发生凋亡。曲线回归分析结果显示，糖尿病足创面内肿瘤坏死因子α与Bax、Bax/Bcl-2、细胞凋亡率呈高度正相关，与Bcl-2呈高度负相关，提示肿瘤坏死因子α可能介导创面组织细胞Bcl-2、Bax表达的变化，导致Bcl-2表达下调和Bax表达上调，Bax/Bcl-2水平明显升高，造成创面凋亡细胞数量显著增加，甚至使组织坏死，致使创面迁延不愈。同时，凋亡发生是一个复杂的、由天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)家族成员介导的蛋白酶级联反应过程，Caspase-3是哺乳动物细胞凋亡中的关键蛋白酶，是凋亡下游的关键执行者^[23]。肿瘤坏死因子α能特异性地与广泛分布于各种细胞膜表面的受体结合，激活Caspase-3导致细胞凋亡^[24]。因此，肿瘤坏死因子α→Bax/Bcl-2→细胞凋亡率间关系还表现出了明显的级联效应特征。这进一步证明在病程早期控制炎症细胞因子的过度分泌，减轻创面内炎症反应所造成的组织损伤，对促进糖尿病足创面愈合的重要性。

结论：此次研究选择典型的糖尿病足创面，通过重复测量的单因素设计，采用“4C”法将局部感染控制后的创面组织区分为坏死、过渡和正常组织后分别采集标本，测定Bcl-2、Bax、Bax/Bcl-2、肿瘤坏死因子α和细胞凋亡率水平，探讨同一创面内不同病程组织的细胞凋亡失衡和炎症失调特征及其相互关系。结果显示，细胞凋亡机制与炎症反应参与了糖尿病足创面病理过程，其作用机制可能与下调Bcl-2表达，上调Bax和肿瘤坏死因子α表达，提高Bax/Bcl-2水平，引起组织细胞凋亡率增大有关，初步证明了同一糖尿病足创面不同病程组织的细胞凋亡、炎症失控的进程及相互作用，值得进一步研究。同时研究结果也显示，在创面组织病程早期开展治疗，下调Bax/Bcl-2和肿瘤坏死因子α水平，对促进创面愈合具有重要意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

同一创面不同病程糖尿病足创面组织细胞凋亡率、Bcl-2、Bax及肿瘤坏死因子α的相关性

Correlation between apoptosis rate and expression of Bcl-2, Bax and tumor necrosis factor alpha in diabetic foot ulcer with different disease courses

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