2.2  股骨头组织病理学变化  对照组股骨头骨髓腔内骨小梁致密、分布均匀，骨陷窝内骨细胞形态正常，分布均匀，骨髓腔内脂肪细胞形态正常，含量适中，空缺骨陷窝率为(10.4±3.58)%。模型组骨小梁稀疏变细，间隙增大，骨细胞核边聚，部分骨陷窝内骨细胞消失，空骨陷窝数增多，空缺骨陷窝率(34.8±5.4)%，显著高于对照组(P < 0.01)。治疗组股骨头骨髓腔内脂肪细胞及空骨陷窝数较模型组明显减少，骨小梁稀疏程度较模型组轻，空缺骨陷窝率(22.8±5.76)%，显著低于模型组(P < 0.05)，但仍高于对照组(P < 0.01)，见图1，表1，图2。

2.2  股骨头组织病理学变化  对照组股骨头骨髓腔内骨小梁致密、分布均匀，骨陷窝内骨细胞形态正常，分布均匀，骨髓腔内脂肪细胞形态正常，含量适中，空缺骨陷窝率为(10.4±3.58)%。模型组骨小梁稀疏变细，间隙增大，骨细胞核边聚，部分骨陷窝内骨细胞消失，空骨陷窝数增多，空缺骨陷窝率(34.8±5.4)%，显著高于对照组(P < 0.01)。治疗组股骨头骨髓腔内脂肪细胞及空骨陷窝数较模型组明显减少，骨小梁稀疏程度较模型组轻，空缺骨陷窝率(22.8±5.76)%，显著低于模型组(P < 0.05)，但仍高于对照组(P < 0.01)，见图1，表1，图2。

2.2  股骨头组织病理学变化  对照组股骨头骨髓腔内骨小梁致密、分布均匀，骨陷窝内骨细胞形态正常，分布均匀，骨髓腔内脂肪细胞形态正常，含量适中，空缺骨陷窝率为(10.4±3.58)%。模型组骨小梁稀疏变细，间隙增大，骨细胞核边聚，部分骨陷窝内骨细胞消失，空骨陷窝数增多，空缺骨陷窝率(34.8±5.4)%，显著高于对照组(P < 0.01)。治疗组股骨头骨髓腔内脂肪细胞及空骨陷窝数较模型组明显减少，骨小梁稀疏程度较模型组轻，空缺骨陷窝率(22.8±5.76)%，显著低于模型组(P < 0.05)，但仍高于对照组(P < 0.01)，见图1，表1，图2。

2.3  各组股骨头组织中细胞凋亡情况  对照组股骨头组织凋亡细胞较少；模型组股骨头组织中存在大量凋亡细胞，细胞核呈致密浓染或呈碎块状致密浓染；治疗组中凋亡细胞数有所减少，但仍高于对照组水平，见图3。

2.4  各组股骨头组织中Caspase-9的表达  模型组Caspase-9染色较深，而治疗组染色变浅，见图4。模型组Caspase-9的平均吸光度显著高于对照组(P < 0.01)，葡萄籽原花青素治疗后其平均吸光度显著降低(P < 0.01)，与对照组相比差异无显著性意义。

2.5  各组股骨头组织中Bcl-2的表达  模型组Bcl-2染色变浅，而治疗组出现大面积深染，Bcl-2得到大量表达，见图5。模型组平均吸光度值显著降低(P < 0.05)，治疗组平均吸光度值极显著升高，差异有显著性意义(P < 0.01)。

随着糖皮质激素的广泛临床应用，临床激素性股骨头坏死病例日益增多，其严重影响患者的生活质量和劳动能力，大部分患者最终不得不接受人工关节置换，既给患者带来了精神上的痛苦，也给患者带来了沉重的经济负担。激素性股骨头坏死具有复杂的发病机制^[1]，主要包括骨内压增高、骨的灌注下降、脂肪栓塞、高凝状态等。近年来越来越多国内外研究表明糖皮质激素诱导股骨头坏死与成骨细胞凋亡密切相关，HWANG等^[2]通过激素诱导兔股骨头坏死动物模型，发现细胞凋亡确实存在于早期激素性股骨头坏死中，这为治疗早期激素性股骨头坏死寻找新的方法，并为寻找抑制细胞凋亡措施治疗股骨头坏死打下基础。

目前，分子生物学研究已逐步阐明了许多基因表达与细胞凋亡密切相关^[3-4]，其中细胞凋亡线粒体通路中的bcl-2基因家族和caspase基因家族起着重要的调节作用。Bcl-2可通过阻断细胞凋亡信号传递系统的最后共同通道而抑制细胞凋亡，是机体内最重要的抑制凋亡基因。研究表明多种因素诱导的成骨样细胞凋亡均与bcl-2表达降低有关^[5]。

      原花青素(proanthocyanidins，PC)广泛存在于蔓蓦、松树皮、越桔、绿茶等植物中^[6]，特别是葡萄籽中含有大量的原花青素。自从1961年德国科学家KARL首次在葡萄籽中分离出了2种多酚化合物开始，很多学者对各种花青素进行了广泛深入研究^[7]。大量实验数据证实原花青素具有强力的抗氧化、减少细胞酶抑制以及血管保护等活性，体外实验显示葡萄籽原花青素提取物还具有较强的抗细胞凋亡作用^[8]。然而，目前还没有报道原花青素是否具有治疗激素性股骨头坏死的作用。葡萄籽原花青素(GSPEs)是一种多酚类生物黄酮，已知具有广泛的药理活性和治疗潜力。该实验观察葡萄籽原花青素提取物对激素性股骨头坏死骨细胞凋亡及凋亡相关因子caspase-9、Bcl-2表达的影响，为其治疗激素性股骨头坏死提供理论依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  随机对照动物实验。

1.2  时间及地点  实验于2017年9月至2018年9月在内蒙古医科大学分子病理实验室完成。

1.3  材料

1.3.1  实验动物  日本大耳白兔27只，雌雄不限，体质量(2.5±0.5) kg，标准饮食，单笼喂养，由北京富豪动物养殖中心提供，动物合格证编号：2017100507。

1.3.2  实验试剂  大肠杆菌内毒素(中国药品生物制品检定所)；甲基强的松龙(比利时法玛西亚普强公司)；葡萄籽原花青素提取物、细胞凋亡Hoechst染色试剂盒(碧云天生物技术研究所)；Caspase-9抗体、Bcl-2抗体(Abnova公司)；DAB显色试剂(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.3.3  实验仪器  超净工作台(日本SUKUN公司)；高速台式离心机(德国EPPENDORF公司)；超低温冰箱(日本SANYO公司)；PL5124型超级应用型纯水器(美国PALL公司)；凝胶成像分析仪(北京六一生物科技有限公司)；倒置光学显微镜(德国LEICA公司)；PTC-200 PCR仪(美国Bio-Rad公司)；电热恒温箱(德国THERMO公司)；石蜡包埋机(上海LEICA公司)；切片机(上海LEICA有限公司)；展片机、烤片机(天津久圣医疗电子仪器有限公司)；JD801图象分析系统(江苏捷讯公司)。

1.4  实验方法

1.4.1  激素性股骨头坏死模型的建立以及实验分组  采用随机数字表法将实验兔随机分成3组，每组9只。①对照组：静脉注射生理盐水，共2次，每次100 μg/kg，间隔24 h。第2次注射完成后随即肌肉注射生理盐水20 mg/kg，共3次，每次间隔24 h。②模型组：静脉注射大肠杆菌内毒素，共2次，每次100 μg/kg，间隔24 h。在第2次注射后随即肌肉注射甲基强的松龙20 mg/kg，共注射3次，每次间隔24 h。③治疗组：静脉内注射大肠杆菌内毒素，共2次，每次   100 μg/kg，间隔24 h。在第2次注射后随即肌肉注射甲基强的松龙20 mg/kg以及葡萄籽原花青素提取物200 μg/kg，共注射3次，每次间隔24 h。④最后一次注射后的第4周空气栓塞法处死动物，无菌条件下取双侧股骨头。

1.4.2  标本制作  将股骨头组织置于体积分数为10%甲醛溶液中固定1周，15%乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙45 d，常规石蜡包埋。

1.4.3  苏木精-伊红染色观察光镜下组织形态学变化  将固定后的股骨头组织进行石蜡包埋并制成厚4 μm切片，进行常规苏木精-伊红染色，在100倍及400倍光镜下观察组织病理学改变。骨细胞坏死病理变化用空缺骨陷窝率表示，即在100倍放大倍率下，任选5个高倍镜视野，每个视野计数50个骨陷窝，计数空缺骨陷窝数，求空缺骨陷窝率。激素性股骨头坏死判定标准：正常成年家兔股骨头软骨下区空缺骨陷窝率为8%-12%，同等制片条件下股骨头软骨下空缺骨陷窝率超过此数目即提示骨坏死^[9]。

1.4.4  Hoechst染色检测股骨头细胞凋亡情况  取石蜡包埋组织块，制成厚4 μm切片；PBS漂洗2次，摇床晃动洗涤，每次3 min，吸尽液体；加入0.5 mL Hoechst 33258染色液，置摇床上染色5 min；去染色液，PBS漂洗2次，摇床晃动洗涤，每次3 min；小心将切片置于载玻片上，滴一滴抗淬灭封固液，盖上盖玻片，尽量避免气泡；荧光显微镜下可观察到呈蓝色的细胞核，激发波长350 nm左右，发射波长460 nm左右。

1.4.5  免疫组化检测Caspase-9、Bcl-2的表达

(1)切片：将标本蜡块装在切片机上，切成5 μm的薄片，然后把切片放在温水皿中展开；将展开的组织切片移到载玻片上，放在70 ℃温箱中40 min，烘干。

(2)切片脱蜡至水：取出切片，放于切片架中，烘箱60 ℃烘烤2 h；梯度乙醇脱水；取出切片架，甩净残液，放入PBS中浸泡5 min。

(3)抗原修复：将抗原修复液装入一耐热容器中，微波炉加热至沸腾。切片架放入抗原修复液中，低火持续加热10 min，停止加热，自然冷却至室温，放入PBS中浸泡     5 min，重复3次。

(4)过氧化氢孵育：每张切片用吸水纸擦干，免疫组化笔在组织周围画圈，防止滴加液体时外溢，体积分数为3%H₂O₂室温孵育15 min，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS浸泡5 min，重复3次。

(5)山羊血清封闭：滴加正常山羊血清，室温孵育15 min，倾去血清，勿洗。

(6)一抗孵育：将Caspase-9及Bcl-2一抗用PBS稀释(1∶200)，滴加至完全覆盖组织，湿盒内4 ℃过夜。取出切片，摆放在切片架上，浸泡在PBS中5 min，重复3次。

(7)二抗孵育：生物素标记山羊抗兔二抗用PBS稀释200倍，滴加至完全覆盖组织，湿盒内37 ℃孵育30 min，浸泡在PBS中5 min，重复3次。

(8)辣根酶标记：取出切片，擦干，摆放在湿盒中，滴加HRP标记亲和素，37 ℃孵育30 min。取出切片，摆放在切片架上，浸泡在PBS中5 min，重复3次。

(9)DAB显色：将DAB显色试剂A、B等量混合。切片取出，擦干周围多余水分，滴加100 μL显色试剂，待颜色刚刚变深时迅速置于水中终止反应。

(10)苏木精复染：切片架浸入苏木精中3 min，放入自来水中流水冲洗2 min。水流不可过急，不能直接冲击切片表面。取出切片架，沥干残液，浸入1%盐酸乙醇中分化3 s，立即浸入自来水中，流水返蓝20 min。

(11)脱水、透明、封固：返蓝后的切片依次浸入体积分数为75%、85%、95%乙醇中，每次2 min；依次浸入无水乙醇、二甲苯中透明；取出切片，擦干周围液体，胶头滴管滴加半滴中性树胶，盖上盖玻片，室温晾干。

(12)镜检：于显微镜下观察染色效果，×400镜下拍照。

1.5  主要观察指标  ①苏木精-伊红染色后在光镜下计数空缺骨陷窝；②Hoechst染色法观察细胞凋亡情况；③免疫组织化学染色法观察股骨头组织Caspase-9、Bcl-2的表达。

1.6  统计学分析  实验数据均以x(_)±s表示，每个样本至少设置3次重复，结果用SPSS统计软件进行分析，单变量两组数据之间的比较采用t 检验，多组资料之间的比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

股骨头缺血坏死是由于股骨头血液供应中断或破坏，导致骨细胞和骨髓成分死亡，股骨头结构改变和股骨头塌陷，进而引起关节疼痛和功能障碍。股骨头坏死的原因有2种：创伤性和非创伤性，糖皮质激素诱导的股骨头坏死在非创伤性因素引起的股骨头坏死中占很大比例^[10]。长期应用糖皮质激素会增加股骨头坏死的发生率^[11]，关节内注射糖皮质激素可以增加发生股骨头坏死的可能性^[12]。激素性股骨头坏死发病机制尚未明确，一些学者认为糖皮质激素的使用会诱导成骨细胞和骨细胞的凋亡，延长破骨细胞的寿命，从而降低骨密度^[13-14]。股骨头坏死的最后阶段是由于其血管功能差，导致骨细胞凋亡。还有研究表明骨细胞和成骨细胞凋亡在骨坏死早期发展中起着重要作用^[15]。此外，糖皮质激素诱导的股骨头坏死中骨细胞凋亡的增加也与间质液、骨血管的形成和骨强度的降低有关^[16]。研究认为糖皮质激素诱导的骨坏死是由于骨髓脂肪细胞的增加，导致骨内压力增加和骨血液灌注量减少，以及血管内脂肪栓塞和高凝状态导致股骨头血液供应减少^[17]。由于激素性股骨头坏死中脂肪栓塞的证据不足，更多的学者倾向于骨细胞凋亡在激素性股骨头坏死中起主要作用^[18-20]。该实验与之前的研究相同，在激素性股骨头坏死中糖皮质激素会诱导骨细胞凋亡增加，未发现骨髓脂肪细胞的增加与脂肪栓塞现象。糖皮质激素诱导的细胞凋亡一般分为3个阶段：①启动阶段，糖皮质激素通过其受体发生早期信号传递和基因表达谱的改变；②确认阶段，是指凋亡信号与细胞存活信号的交互作用，以确定细胞是否发生凋亡；③效应阶段，即Caspase与内核酸酶的活化，启动凋亡反应。该实验中Hochest结果显示模型组细胞凋亡明显，进一步明确了股骨头坏死中确实存在着细胞的凋亡。

线粒体是细胞死亡通路的整合元件，内含一系列与细胞凋亡密切相关的物质，如Procaspase、Cyt-c、线粒体来源Caspease第二活化子、凋亡诱导因子等^[21]。由线粒体介导的主要途径为线粒体激发途径或Caspase-9途径，此途径中细胞发生凋亡时首先表现为线粒体内膜渗透性改变(permeability transition，PT)，PT孔开放使线粒体基质和胞浆内离子得以平衡流动，引起线粒体跨膜电位迅速下降，线粒体外膜去极化，其内的Cyt-c释放入细胞浆，Cyt-c在dATP/ATP的存在下结合Apaf-1，Apaf-1寡聚化后募集Caspase-9前体，致使Caspase-9前体活化和释放^[22]，随后Caspase-9激活其下游分子Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7等成员，启动Caspase级联反应，引起细胞凋亡。此途径也是Bcl-2蛋白家族调控凋亡的主要途径，Bcl-2能够在线粒体外膜形成离子通道，通过阻止其开放进而调节线粒体跨膜电位，还可提高膜稳定性而阻止凋亡蛋白的释放，对细胞功能发挥重要的保护作用^[23]。该研究发现激素性股骨头坏死模型组Bcl-2降低，Caspase-9表达增高，骨细胞凋亡增加，进一步证实了激素性股骨头坏死中骨细胞凋亡可能通过线粒体途径传导。

在正常的生理条件下，氧化应激也是导致细胞损伤的主要原因，使用抗氧化剂可以有效抑制细胞损伤和氧化应激介导的代谢紊乱。原花青素具有显著的抗氧化能力^[24]。葡萄籽原花青素能治疗外源性H₂O₂引起的氧化损伤，体内实验发现原花青素通过抑制促凋亡转录因子和基因JNK-1和c-Jun进行抗氧化和心脏保护作用，有证据表明原花青素具有促进缺血后心肌的恢复作用^[25]。应用原花青素治疗缺血再灌注时，其心室功能得到显著改善，心肌梗死范围显著减小^[26]。原花青素可以抑制活性氧水平的提高和线粒体超氧化物的产生，具有显著的抗线粒体功能紊乱效应^[27]。该研究发现应用葡萄籽原花青素治疗激素性股骨头坏死可以显著提高Bcl-2表达，降低Caspase-9表达，并减少骨细胞凋亡发生，推测原花青素有效抑制了H₂O₂引起的细胞凋亡与线粒体功能紊乱，其机制主要通过改善线粒体功能，起到保护骨细胞氧化应激的作用。

综上，在激素性股骨头坏死早期Bcl-2表达降低、Caspase-9表达增加，进而促进了骨细胞凋亡，骨细胞凋亡参与了激素性股骨头坏死的早期发生发展，而葡萄籽原花青素可能通过改善线粒体功能起到抑制细胞氧化应激损伤的作用，进而减少骨细胞凋亡的发生，但其调节机制有待于深入研究。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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文题释义：

原花青素：广泛存在于蔓蓦、松树皮、越桔、绿茶等植物中，特别是葡萄籽中含有大量的原花青素。自从1961年德国科学家KARL首次在葡萄籽中分离出了2种多酚化合物开始，很多学者对各种花青素进行了广泛深入的研究。大量实验数据证实原花青素具有强力的抗氧化、减少细胞酶抑制以及血管保护等活性，体外实验显示葡萄籽原花青素提取物还具有较强的抗细胞凋亡作用。

含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)：是一类蛋白酶家族，成员较多，在人类已经鉴定了11种不同的Caspase，根据其蛋白酶序列的同源性可分为3个亚族：Caspase-1亚族包括 Caspase-1、4、5、11；Caspase-2亚族包括Caspase-2、9；Caspase-3亚族包括Caspase-3、6、7、8、10。

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股骨头缺血坏死是由于股骨头血液供应中断或破坏，导致骨细胞和骨髓成分死亡，股骨头结构改变和股骨头塌陷，进而引起关节疼痛和功能障碍。长期应用糖皮质激素会增加股骨头坏死的发生率，关节内注射糖皮质激素可以增加发生股骨头坏死的可能性。激素性股骨头坏死发病机制尚未明确，一些学者认为糖皮质激素的使用会诱导成骨细胞和骨细胞的凋亡，从而降低骨密度。该实验发现在激素性股骨头坏死早期Bcl-2表达降低、Caspase-9表达增加，进而促进骨细胞凋亡，说明骨细胞凋亡参与了激素性股骨头坏死的早期发生发展，而葡萄籽原花青素可能通过改善线粒体功能起到抑制细胞氧化应激损伤的作用，进而减少骨细胞凋亡的发生，但其调节机制有待于深入研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程