miR-148a-5p参与了高蛋氨酸饮食诱导ApoE-/-小鼠的肝细胞凋亡

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2349

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (35): 5632-5637.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2349

• 组织构建实验造模 experimental modeling in tissue construction • 上一篇下一篇

miR-148a-5p参与了高蛋氨酸饮食诱导ApoE-/-小鼠的肝细胞凋亡

马芳1，张辉2，李桂忠2，3，4，马胜超2，3，4，沈江涌2，5，孙磊2，郝银菊6，马生贤2，姜怡邓2，3，4

宁夏医科大学，1临床医学院，2基础医学院，6药学院，宁夏回族自治区银川市 750004；3国家卫生健康委代谢性心血管疾病研究重点实验室，宁夏回族自治区银川市 750004；4宁夏血管损伤与修复研究重点实验室，宁夏回族自治区银川市 750004；5宁夏医科大学总医院烧伤整形外科，宁夏回族自治区银川市 750004

收稿日期:2019-11-01 修回日期:2019-11-13 接受日期:2020-01-13 出版日期:2020-12-18 发布日期:2020-10-17
通讯作者: 姜怡邓，博士，教授，宁夏医科大学基础医学院，宁夏回族自治区银川市 750004；国家卫生健康委代谢性心血管疾病研究重点实验室，宁夏回族自治区银川市 750004；宁夏血管损伤与修复研究重点实验室，宁夏回族自治区银川市 750004
作者简介:马芳，女，1994年生，宁夏回族自治区海原县人，回族，宁夏医科大学在读硕士，主要从事心血管病理生理学方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81670416)；国家自然科学基金(81660088)；宁夏自然科学基金(2018AAC03265)；宁夏医科大学2018年“大学生创新创业计划项目”(201810751007)

Involvement of miR-148a-5p in ApoE-/- mouse hepatocyte apoptosis induced by high methionine diet

Ma Fang1, Zhang Hui2, Li Guizhong2, 3, 4, Ma Shengchao2, 3, 4, Shen Jiangyong2, 5, Sun Lei2, Hao Yinju6, Ma Shengxian2, Jiang Yideng2, 3, 4

1School of Clinical Medicine, 2School of Basic Medicine, 6School of Pharmacy, Ningxia Medical University; 3State Key Laboratory of Metabolic Cardiovascular Disease, National Health Commission of China; 4Ningxia Key Laboratory of Vascular Injury and Repair; 5Department of Plastic Surgery, General Hospital of Ningxia Medical University

Received:2019-11-01 Revised:2019-11-13 Accepted:2020-01-13 Online:2020-12-18 Published:2020-10-17
Contact: Jiang Yideng, MD, Professor, School of Basic Medicine, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; State Key Laboratory of Metabolic Cardiovascular Disease, National Health Commission of China, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; Ningxia Key Laboratory of Vascular Injury and Repair, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China
About author:Ma Fang, Master candidate, School of Clinical Medicine, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81670416 and 81660088; Ningxia Natural Science Foundation, No. 2018AAC03265; 2018 College Students Innovation and Entrepreneurship Project of Ningxia Medical University, No. 201810751007

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

凋亡：是一种程序性细胞死亡，其特征是进行性的核和细胞质收缩、染色质浓缩和凋亡小体脱落。凋亡由称为半胱天冬酶的特定类型的半胱氨酸蛋白酶执行，一旦激活，就可以裂解细胞底物并导致细胞死亡。最常见的凋亡指标为抑制凋亡基因Bcl-2和促进凋亡基因Bax，Bcl-2增高，细胞凋亡减少；Bax增高，细胞凋亡增加。

微小RNA(miRNA)：是一组内源性非编码小RNA，在动物、植物、病毒和其他生物中普遍存在，可调节将近60%的基因表达，这些基因负责细胞的增殖、分化、凋亡和其他生理过程。miRNA可以在多种疾病中异常表达，并对这些疾病的诊断和预后评估起重要作用。

背景：高蛋氨酸饮食可以导致ApoE^-/-小鼠发生肝损伤，微小RNA(miRNA)参与细胞存活、分化和细胞凋亡等各种细胞过程，具有重要意义。

目的：探讨miR-148a-5p在高蛋氨酸饮食诱导ApoE^-/-小鼠肝细胞凋亡中的作用。

方法：12只ApoE^-/-小鼠随机分为2组，每组6只，ApoE^-/-对照组为普通饮食，ApoE^-/-高蛋氨酸组为高蛋氨酸饮食。苏木精-伊红染色观察2组肝组织形态学变化；TUNEL染色观察肝细胞的凋亡情况；Western blot测定Bax、Bcl-2的表达改变；荧光定量PCR检测miR-148a-5p的表达；运用Target Scan靶基因预测软件预测miR-148a-5p的靶基因；双荧光素酶活性实验明确其靶向关系。

结果与结论：①与对照组相比，ApoE-/-高蛋氨酸组肝脏组织肝小叶结构发生明显紊乱，部分细胞呈胞浆疏松化变性，肝细胞凋亡增加，Bax的表达明显上升且Bcl-2的表达显著下降(P < 0.01)；②荧光定量PCR结果显示，ApoE-/-高蛋氨酸组miR-148a-5p的表达增加(P < 0.05)；③靶基因预测软件提示，Bcl-2为miR-148a-5p的潜在靶基因；④双荧光素酶活性实验确定了miR-148a-5p与Bcl-2的靶向关系(P < 0.05)；⑤肝细胞中过表达miR-148a-5p后Bax的表达显著上升且Bcl-2的表达明显下降(P < 0.01)；⑥提示在高蛋氨酸饮食诱导的ApoE-/-小鼠肝细胞中，miR-148a-5p通过负调控Bcl-2促进肝细胞凋亡，这可能是造成肝损伤的机制之一。

ORCID: 0000-0003-1524-1117(马芳)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: miR-148a-5p, Bcl-2, 高蛋氨酸饮食, 肝细胞, 凋亡, 动物

Abstract:

BACKGROUND: High methionine diet can cause liver damage in ApoE^-/-mice, and microRNAs (miRNAs) are involved in various cell processes such as cell survival, differentiation, and apoptosis, which is of great significance.

OBJECTIVE: To investigate the effect of miR-148a-5p on ApoE^-/- mouse hepatocyte apoptosis induced by high methionine diet.

METHODS: Twelve ApoE^-/- mice aged 5 weeks were randomly divided into two groups with six ApoE^-/- mice in each group: ApoE^-/- control group was fed with a normal diet, and ApoE^-/- high methionine diet group (ApoE^-/-+HMD) was fed with a high methionine diet. Hematoxylin-eosin staining was used to observe the morphological changes of liver tissues in the two groups. TUNEL staining was used to observe the apoptosis of hepatocytes. The expressions of Bax and Bcl-2 were detected by western blot. Fluorescence quantitative PCR was used to detect the expression of miR-148a-5p. Target Scan prediction software was used to predict the target gene of miR-148a-5p, and double luciferase activity assay was used to verify the targeted relationship.

RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, the hepatic lobular structure of the ApoE^-/- mice with high methionine diet was obviously disturbed, and some cells showed cytoplasmic osteoporosis; hepatocyte apoptosis increased; the expression of Bax significantly increased and the expression of Bcl-2 significantly decreased (P < 0.01). Fluorescence quantitative PCR results showed that the expression of miR-148a-5p increased in the ApoE^-/- mice with high methionine diet (P < 0.05). The target gene prediction software indicated that Bcl-2 was a potential target gene of miR-148a-5p, and the targeted relationship between miR-148a-5p and Bcl-2 was confirmed by the double luciferase activity assay (P < 0.05). After miR-148a-5p was overexpressed in hepatocytes, Bax expression increased and Bcl-2 expression decreased significantly (P < 0.01). In conclusion, miR-148a-5p promoted hepatocyte apoptosis through negative regulation of Bcl-2 in ApoE^-/- mouse hepatocytes induced by high methionine diet, which may be one of the mechanisms causing liver injury.

Key words: miR-148a-5p, Bcl-2, high-methionine diet, hepatocyte, apoptosis, animal

中图分类号:

马芳, 张辉, 李桂忠, 马胜超, 沈江涌, 孙磊, 郝银菊, 马生贤, 姜怡邓. miR-148a-5p参与了高蛋氨酸饮食诱导ApoE-/-小鼠的肝细胞凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(35): 5632-5637.

Ma Fang, Zhang Hui, Li Guizhong, Ma Shengchao, Shen Jiangyong, Sun Lei, Hao Yinju, Ma Shengxian, Jiang Yideng. Involvement of miR-148a-5p in ApoE-/- mouse hepatocyte apoptosis induced by high methionine diet[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(35): 5632-5637.

图/表（结果） 5

2.1 高蛋氨酸饮食后肝组织发生形态学变化苏木精-伊红染色显示，对照组肝小叶结构基本清晰，肝细胞排列较有序，并未见明显的肝细胞形态改变；与ApoE^-/-对照组比较，ApoE^-/-高蛋氨酸组肝小叶结构发生明显紊乱，有部分细胞呈胞浆疏松化变性，见图1。

2.2 高蛋氨酸饮食后肝细胞的凋亡增加 TUNEL法检测肝细胞的凋亡，TUNEL阳性细胞核为绿色，高倍镜下可观察到染色质聚集或碎裂。与ApoE^-/-对照组相比，ApoE^-/-高蛋氨酸组凋亡明显增加。同时Western blot法检测各组肝组织中Bax和Bcl-2的表达，与ApoE^-/-对照组相比，ApoE^-/-高蛋氨酸组Bax的表达明显上升(P < 0.01)，Bcl-2的表达明显下降(P < 0.01)，说明高蛋氨酸饮食可以促进ApoE^-/-小鼠肝细胞凋亡，见图2。

2.3 ApoE^-/-小鼠肝组织miR-148a-5p的表达荧光定量PCR检测各组肝组织中miR-148a-5p的表达，与ApoE^-/-对照组相比，ApoE^-/-高蛋氨酸组miR-148a-5p的表达显著增加，说明高蛋氨酸饮食可以引起ApoE^-/-小鼠肝组织中的miR-148a-5p上调，见图3。

2.4 miR-148a-5p与Bcl-2的靶向关系采用生物信息学软件预测miR-148a-5p的靶基因，预测分析Bcl-2在miR-148a-5p的3’UTR中具有推测的结合位点，并且推测miR-148a-5p的潜在靶基因为Bcl-2。双荧光素酶活性实验显示，miR-148a-5p显著抑制Bcl-2报告载体的荧光素酶活性(P < 0.05)。双荧光素酶检测系统报告显示，Bcl-2野生型质粒载体与miR-148a-5p共转染细胞，报告荧光值较对照组显著下调(P < 0.05)，表明Bcl-2是miR-148a-5p的靶基因，见图4。

2.5 过表达miR-148a-5p对肝细胞凋亡的影响过表达miR-148a-5p后采用蛋白免疫印迹检测Bcl-2和Bax蛋白的表达，结果显示转染miR-148a-5p mimics组比未转染miR-148a-5p mimics组的Bcl-2的表达明显下降，Bax表达显著上升，见图5。这说明miR-148a-5p参与了高同型半胱氨酸血症引起的肝细胞凋亡。

参考文献

[1] ZHANG D, LOU J, ZHANG X, et al. Hyperhomocysteinemia results from and promotes hepatocellular carcinoma via CYP450 metabolism by CYP2J2 DNA methylation. Oncotarget. 2017;8(9):15377-15392.

[2] AI Y, SUN Z, PENG C, et al. Homocysteine Induces Hepatic Steatosis Involving ER Stress Response in High Methionine Diet-Fed Mice. Nutrients. 2017;9(4):346.

[3] KUMAR A, PALFREY HA, PATHAK R, et al. The metabolism and significance of homocysteine in nutrition and health. Nutr Metab (Lond) 2017;14 78.

[4] YANG A, JIAO Y, YANG S, et al. Homocysteine activates autophagy by inhibition of CFTR expression via interaction between DNA methylation and H3K27me3 in mouse liver. Cell Death Dis. 2018;9(2):169.

[5] 朱姗姗,何太平,邹堂斌.miRNAs与非酒精性脂肪肝相关信号通路[J].实用医学杂志,2016,32(23):3820-3822.

[6] GEBERT LFR, MACRAE IJ. Regulation of microRNA function in animals. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019;20(1):21-37.

[7] CHEN Z, MA T, HUANG C, et al. MicroRNA-148a: a potential therapeutic target for cancer. Gene. 2014;533:456-457.

[8] KALANI A, CHATURVEDI P, KALANI K, et al. A high methionine, low folate and vitamin B6/B12 containing diet can be associated with memory loss by epigenetic silencing of netrin-1. Neural Regen Res. 2019;14(7):1247-1254.

[9] PERŁA-KAJÁN J, JAKUBOWSKI H. Dysregulation of epigenetic mechanisms of gene expression in the pathologies of hyperhomocysteinemia. Int J Mol Sci. 2019;20(13). pii: E3140. doi: 10.3390/ijms20133140.

[10] FU Y, WANG X, KONG W. Hyperhomocysteinaemia and vascular injury: advances in mechanisms and drug targets. Br J Pharmacol. 2018;175:1173-1189.

[11] WU X, ZHANG L, MIAO Y, et al. Homocysteine causes vascular endothelial dysfunction by disrupting endoplasmic reticulum redox homeostasis. Redox Biol. 2019;20:46-59.

[12] KAR S, SHAHSHAHAN HR, KAMBIS TN, et al. Hydrogen sulfide ameliorates homocysteine-induced cardiac remodeling and dysfunction. Front Physiol. 2019;10:598.

[13] WANG D, ZHAO R, QU YY, et al. Colonic lysine homocysteinylation induced by high-fat diet suppresses DNA damage repair. Cell Rep. 2018;25:398-412.

[14] JAKUBOWSKI H. Protein n-homocysteinylation and colorectal cancer. Trends Cancer. 2019;5:7-10.

[15] GUIRAUD SP, MONTOLIU I, DA SILVA L, et al. High-throughput and simultaneous quantitative analysis of homocysteine–methionine cycle metabolites and co-factors in blood plasma and cerebrospinal fluid by isotope dilution LC–MS/MS. Anal Bioanal Chem. 2017;409(1):295-305.

[16] 谢琳,丁宁,徐灵博,等.FoxO1 DNA甲基化在同型半胱氨酸致肝细胞凋亡中的作用[J].实用医学杂志, 2018,34(16):2659-2662+ 2669.

[17] PENG YT, CHEN P, OUYANG RY, et al. Multifaceted role of prohibitin in cell survival and apoptosis. Apoptosis. 2015;20: 1135-1149.

[18] CUI J, PLACZEK WJ. Post-Transcriptional Regulation of Anti-Apoptotic BCL2 Family Members. Int J Mol Sci. 2018; 19(1). pii: E308.

[19] CAVALCANTE GC, SCHAAN AP, CABRAL GF, et al. A Cell's Fate: An Overview of the Molecular Biology and Genetics of Apoptosis. Int J Mol Sci. 2019;20(17). pii: E4133.

[20] BRAMBILLA E, NEGOESCU A, GAZZERI S, et al. Apoptosis-related factors p53, Bcl2, and Bax in neuroendocrine lung tumors. Am J Pathol. 1996;149:1941-1952.

[21] WEISS CN, ITO K. A Macro View of MicroRNAs: the discovery of micrornas and their role in hematopoiesis and hematologic disease. Int Rev Cell Mol Biol. 2017;334: 99-175.

[22] BERTOLI G, CAVA C, CASTIGLIONI I. MicroRNAs: New biomarkers for diagnosis, prognosis, therapy prediction and therapeutic tools for breast cancer. Theranostics. 2015; 5: 1122-1143.

[23] MCALINDEN A, IM GI. MicroRNAs in Orthopaedic Research: Disease Associations, Potential Therapeutic Applications, and Perspectives. J Orthop Res. 2018;36(1):33-51.

[24] ZHOU L, LIM MYT, KAUR P, et al. Importance of miRNA stability and alternative primary miRNA isoforms in gene regulation during Drosophila development. Elife. 2018;7:e38389.

[25] MORA AL, ROJAS M, PARDO A, et al. Emerging therapies for idiopathic pulmonary fibrosis, a progressive age-related disease. Nat Rev Drug Discov. 2017;16(11):810.

[26] 高红强,李志强,王海富,等.减体积肝移植模型大鼠肝脏组织miRNAs表达谱变化[J].中国组织工程研究,2016,20(5): 712-717.

[27] SONG L, ZHANG Z, ZHANG J, et al. Ratio of microRNA-122/155 in isoniazid-induced acute liver injury in mice. Exp Ther Med. 2016;12(2):889-894.

[28] YANG Y, JIN Z, DONG R, et al. MicroRNA-29b/142-5p contribute to the pathogenesis of biliary atresia by regulating the IFN-γ gene. Cell Death Dis. 2018;9(5):545.

[29] YOGI K, SRIDHAR E, GOEL N, et al. MiR-148a, a microRNA upregulated in the WNT subgroup tumors, inhibits invasion and tumorigenic potential of medulloblastoma cells by targeting Neuropilin 1.Oncoscience. 2015;2(4):334-348.

[30] JUNG KH, ZHANG J, ZHOU C, et al. Differentiation Therapy for Hepatocellular Carcinoma: multifaceted effects of miR-148a on tumor growth and phenotype and liver fibrosis. Hepatology. 2016;63(3):864-879.

[31] BABU KR, MUCKENTHALER MU. miR-148a regulates expression of the transferrin receptor 1 in hepatocellular carcinoma. Sci Rep. 2019;9(1):1518.

引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点于2018年9月至2019年10月在宁夏医科大学宁夏血管损伤与修复研究重点实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 动物模型与分组 5周龄雄性纯合子ApoE^-/-小鼠购自北京大学实验动物中心[许可证号：SYXK(京)2019-0032]。12只ApoE^-/-小鼠随机标号分为2组(n=6)：①ApoE^-/-对照组：普通饮食饲养；②ApoE^-/-高蛋氨酸组：高蛋氨酸饮食(普通饮食中加入1.7%蛋氨酸)饲养。

小鼠均饲养于SPF级环境内，分笼饲养，室内相对湿度60%左右，温度控制在25 ℃左右，动物饲养的笼具、饮水瓶定期消毒，所用垫料经过高压灭菌，饲养房内定期紫外灯消毒并自由摄食和饮水。小鼠饲养20周后，剖取肝脏组织并制作冰冻切片，进行后续实验。

1.3.2 主要试剂和仪器反转录和荧光定量PCR试剂盒(Thermo Fisher，美国)；蛋白提取试剂盒(凯基，南京)；RNA提取试剂盒(天根，中国)；TUNEL凋亡试剂盒(Roche公司，瑞士)；苏木精-伊红染色液(碧云天，中国)；Bax抗体、Bcl-2抗体(abcam，美国)；辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗(博奥森，北京)；脂质体Lipofectamine^TM 2000(Invitrogen，美国)；DMEM高糖培养基 (Gibco，美国)；胎牛血清(Gibco，美国)；引物由上海生工生物工程有限公司合成；双荧光素酶检测试剂盒、荧光素酶检测仪器(Promega，美国)；5415D型微量台式离心机(Eppendorf，德国)；荧光定量PCR仪(枫岭，上海)；电泳仪及凝胶成像系统(Rio-Rad，美国)；荧光显微镜(Olympus，日本)；超净工作台(安泰，苏州)。

1.4 方法

1.4.1 苏木精-伊红染色观察肝组织病变情况将冰冻切片固定30 s，自来水洗2 s，苏木精液染色(60 ℃)60 s，流水洗去苏木精液8 s，1%盐酸乙醇2 s，自来水洗2 s，促蓝液返蓝3 s，流水冲洗30 s，0.5%曙红液染色60 s，蒸馏水洗2 s，体积分数为80%，95%，100%，100%乙醇各1 s，二甲苯(Ⅰ) 1 s、二甲苯(Ⅱ)1 s，中性树胶封固，光镜下观察小鼠肝组织的病理学变化情况。

1.4.2 凋亡指标的检测

TUNEL法检测肝细胞凋亡：切片后先用40 g/L多聚甲醛固定15 min，乙醇∶醋酸=2∶1固定5 min，TUNEL反应混合液染色1 h，DAPI染色，激光共聚焦组织切片，蓝色为细胞核，绿色为TUNEL阳性细胞。

蛋白质免疫印迹(Western Blot)：提取小鼠肝组织的总蛋白，取30 μg总蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，0.3 A恒流转膜2 h，5%脱脂奶粉封闭2 h，Bax、Bcl-2特异性一抗4 ℃孵育过夜，第2天PBST洗涤3次，10 min/次，与HRP标记二抗孵育2 h后，加入ECL发光底物，在凝胶成像分析仪上进行成像分析。以β-actin为内参，计算Bax、Bcl-2与β-actin灰度值的比值进行分析。

1.4.3 细胞培养用含有体积分数10%胎牛血清的1640培养液培养人肝细胞(上海名劲，中国)，置于37 ℃、体积分数5%CO₂浓度的培养箱中。

1.4.4 荧光定量PCR检测肝组织中miR-148a-5p的表达采用RNA提取试剂盒提取小鼠肝组织的总RNA。根据GeneBank数据库查询miR-148a-5p基因序列并设计引物。

miR-148a-5p上游引物：5'-ACA CTC CAG CTG GGT CAG-3'；下游引物：5'-CTC AAC TGG TGT CGT GGA-3'。

U6上游引物：5'-GGT GAA GGT CGG TGT GAA CG-3'；下游引物：5'-CTC GCT GGA AGA TGG TG-3'。

荧光定量PCR扩增程序：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，70 ℃ 10 s，95 ℃ 15 s，共40个循环，设空白对照和内参(U6)对照同体系扩增。反应结束后，根据扩增曲线数据，按照计算公式2^-^∆∆Ct分析miR-148a-5p的含量。

∆∆Ct=(Ct_目的基因-Ct_内参基因)高蛋氨酸组-(Ct_目的基因-Ct_内参基因)对照组

1.4.5 生物信息学软件预测miR-148a-5p的靶基因通过microRNA靶基因数据库TargetScan进行筛选预测，预测miR-148a-5p的潜在靶基因，其中Bcl-2在miR-148a-5p的3'UTR上有结合位点。

1.4.6 细胞转染采用常规转染方法，参照Lipofectamine^TM 2000试剂盒说明书，取对数生长期的293T细胞(上海名劲，中国)接种于24孔板上培养，待细胞融合70%时，用Lipofectamine^TM 2000试剂将miR-148a-5p模拟物及阴性对照转染至293T细胞。

1.4.7 双荧光素酶活性检测在293T细胞中进行双荧光素酶报告质粒瞬时转染。将293T细胞接种于24孔板中，培养18 h，待细胞融合达70%时，按Lipofectamine^TM 2000试剂说明书步骤，将miR-148a-5p的mimics与Bcl-2 3’UTR的pCHECK重组荧光素酶报告基因质粒(pCHECK-Bcl-2)共转染293T细胞，用内参质粒pCHECK来校正转染效率的差异。37 ℃、体积分数5%CO₂条件下培养48 h后采用Dual Luciferase Assay(Promega)检测荧光值。

1.5 主要观察指标 ①高蛋氨酸饮食ApoE^-/-小鼠肝细胞的凋亡水平；②miR-148a-5p对肝细胞凋亡的影响。

1.6 统计学分析采用Prism 6.0统计软件，结果以x(_)±s表示，组间比较采用两样本均数t 检验，以P < 0.05表示差异有显著性意义。

讨论

在日常饮食中富含蛋氨酸，蛋氨酸是一种在肉、鱼、奶制品和蛋制品中发现的氨基酸，可能对心脏、肝脏和肾脏等器官有害。蛋氨酸是蛋白质中主要的含硫氨基酸，对于合成甲基化反应所需的半胱氨酸和S-腺苷甲硫氨酸是必不可少的，它们在细胞代谢中起着关键作用。虽然蛋氨酸是人类的关键氨基酸，但有证据表明过量摄取蛋氨酸会使其中间代谢产物同型半胱氨酸增加从而损害人体功能^[8]。在饲喂高蛋氨酸饮食的小鼠中，蛋氨酸-高同型半胱氨酸代谢途径的紊乱加剧了氧化应激，进而加速了血清同型半胱氨酸的水平，这种情况被称为高同型半胱氨酸血症^[9]。高同型半胱氨酸血症是血浆中高同型半胱氨酸浓度升高的医学疾病，通常定义为>15 µmol/L，在普通人群中普遍存在，可能对人类健康产生严重影响。心血管疾病和脑卒中、痴呆、精神分裂症、不育、妊娠并发症、先天缺陷、癌症、肝损伤和骨质疏松均与高同型半胱氨酸血症相关^[10-14]。肝脏是同型半胱氨酸代谢的主要器官，高水平的同型半胱氨酸与多种疾病相关，如酒精性肝硬化、慢性肝病、肝炎等^[15-16]，在这些疾病中，同型半胱氨酸会使肝细胞损伤，引起肝细胞的凋亡，而肝细胞凋亡是肝损伤的基本环节之一。

凋亡是一种高度程序化的细胞死亡，具有独特的生化和遗传途径，在细胞的发育和稳态中发挥着重要作用。凋亡被认为是非炎症性或低炎症性的，因为凋亡细胞的迅速清除触发了凋亡体上表达的磷脂酰丝氨酸等，促进吞噬细胞吞噬，从而防止细胞内容物的泄漏^[17]。细胞凋亡可在胚胎发生过程中自然发生，也可因细胞损伤或应激而发生。凋亡主要有2个调控途径：外在受体途径和内在途径，其中内在凋亡途径是由Bcl-2家族蛋白质介导的^[18]，细胞可以通过多种机制调控Bcl-2家族成员的表达。Bcl-2基因家族分为抑制和促进凋亡基因，其中最重要的2个调控基因是抑制凋亡基因Bcl-2和促进凋亡基因Bax，Bcl-2增高，细胞凋亡减少；Bax增高，细胞凋亡增加^[19-20]。在此次研究中，将ApoE^-/-小鼠分为ApoE^-/-对照组和ApoE^-/-高蛋氨酸组，对照组给予普通饮食饲养，高蛋氨酸组给予高蛋氨酸饮食饲养。作者对切片组织进行了苏木精-伊红染色和TUNEL染色，苏木精-伊红染色结果显示高蛋氨酸组的ApoE^-/-小鼠肝组织肝小叶结构发生明显紊乱，有部分细胞呈胞浆疏松化变性，这说明高蛋氨酸饮食可引起ApoE^-/-小鼠发生肝损伤。在肝组织中提取蛋白进行免疫蛋白印迹实验，实验结果显示给予高蛋氨酸饮食的ApoE^-/-小鼠与正常组相比Bax显著增高、Bcl-2表达下降，这些结果说明给予高蛋氨酸饮食的ApoE^-/-小鼠与正常组相比肝细胞凋亡明显增加。

细胞凋亡的部分途径受microRNA的调控，miRNAs是单链、内源性编码的非编码RNA，在蛋白质表达的转录后调控中发挥关键作用，因此在多种生物学过程和疾病发展中发挥重要作用。这种转录后调控对正常生理非常重要，超过60%的人类蛋白编码基因处于选择性进化压力下，以维持其3个“非翻译区”(3’-UTRs)的miRNA结合位点，也称为miRNA响应元件^[21]。miRNAs在细胞核中被编码和转录，并被输出到细胞质中，在那里它们被整合到核糖核酸蛋白沉默机制中^[22]。作为核糖核酸蛋白沉默机制的目标识别组件，miRNAs以序列特异性的方式识别特定的转录本，以进行翻译抑制和转录失稳^[23]。在人类基因组中已经发现了数千种假定的miRNAs，其中数百种已经通过实验验证能够影响已知的靶点。microRNA是基因表达的主要调控因子，通过与各自mRNA靶基因的碱基配对来调控mRNA的稳定性和翻译。单个microRNA在不同的分子通路和网络中影响多种蛋白质，因此microRNA水平或活性的改变可能对细胞功能产生深远的影响^[24]。microRNA参与多种代谢途径的调控，microRNA的改变可能反映了潜在的肝损伤或炎症^[25-26]，miR-122-5p、miR-141-3p、miR-298、miR-370、miR-146a、miR-27b、miR-214、miR-199a-3p、miR-34a等microRNA的表达与自身免疫性肝病、药物引起的肝损伤、炎症性肝损伤、酒精性肝病和肝纤维化等肝脏疾病密切相关^[27-28]。miR-148/152家族由3个高度保守的miRNA成员组成，包括miR-148a、miR-148b和miR-152，分别位于人类染色体7，12和17上，以及小鼠染色体6，15和11上^[29]。对于miR-148a的研究大多集中于各种肿瘤的发生发展，如肝细胞癌、胃癌、乳腺癌以及胰腺癌^[30-31]，但有关于其在肝细胞凋亡中的作用机制的研究少之又少。

在此次研究中，检测了ApoE^-/-对照组和ApoE^-/-高蛋氨酸组miR-148a的表达，实验结果显示ApoE^-/-高蛋氨酸组miR-148a的表达显著上升，采用在线软件预测了miR-148a-5p的靶基因，发现Bcl-2在miR-148a-5p的3’UTR中具有结合位点，进一步用双荧光素酶活性实验验证了Bcl-2为miR-148a-5p的靶标，Bcl-2为凋亡抑制基因，其主要功能为调节细胞的凋亡进程。此次研究在肝细胞中过表达miR-148a-5p后检测Bcl-2和Bax蛋白的表达，结果显示转染miR-148a-5p mimiccs组比未转染miR-148a-5p mimics组的Bcl-2的表达明显下降，Bax表达显著上升。这说明miR-148a参与了高同型半胱氨酸血症引起的肝细胞凋亡。

综上所述，miR-148a-5p通过作用于靶基因Bcl-2参与了高蛋氨酸饮食诱导的ApoE^-/-小鼠肝细胞凋亡，这为进一步研究高同型半胱氨酸引起肝细胞凋亡提供了新的实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

miR-148a-5p参与了高蛋氨酸饮食诱导ApoE-/-小鼠的肝细胞凋亡

Involvement of miR-148a-5p in ApoE-/- mouse hepatocyte apoptosis induced by high methionine diet

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 5

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	张超, 吕欣. 髋臼骨折固定后的异位骨化：危险因素、预防及其治疗进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1434-1439.
[2]	陈继铭, 吴晓静, 刘田丰, 陈海聪, 黄成硕. 水飞蓟素对四氯化碳致小鼠肝损伤和骨代谢的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1224-1228.
[3]	耿秋东, 葛海雅, 王和鸣, 李楠. 基于网络药理学探讨龟鹿二仙胶治疗骨关节炎的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1229-1236.
[4]	谭婧玉, 刘海文. 成骨细胞特异因子2基因家族的全基因组鉴定、分类及进化分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1243-1248.
[5]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.
[6]	裴丽丽, 孙贵才, 王弟. 丹酚酸B抑制骨髓间充质干细胞氧化损伤及促进分化为心肌样细胞[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1032-1036.
[7]	李时斌, 赖渝, 周毅, 廖建钊, 章晓云, 张璇. 激素性股骨头坏死发病机制及相关信号通路的靶点效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(6): 935-941.
[8]	马斌祥, 何万庆, 周广超, 关永林. 雷公藤内酯醇改善大鼠脊髓损伤后的运动障碍[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 701-706.
[9]	徐银琴, 史红美, 王光义. 通痹方热敷联合针刺治疗对退变椎间盘细胞凋亡相关基因Caspase-3、Bcl-2 mRNA的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 713-718.
[10]	张雯雯, 金颂峰, 赵国梁, 宮丽鸿. 复方中药稳斑汤减少同型半胱氨酸诱导大鼠心肌微血管内皮细胞凋亡的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 723-728.
[11]	刘青, 万碧江. 针刀治疗胶原诱导性关节炎大鼠滑膜组织Bcl-2/Bax的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 729-734.
[12]	谢崇新, 张磊. 保留与不保留残端重建前交叉韧带术后膝关节退变的比较[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 735-740.
[13]	苏丽萍, 路子扬, 刘丽, 张巍, 苏天园, 胡夏韵, 蒲红伟, 韩登峰. 二乙酰吗啡致大鼠小脑颗粒神经元细胞凋亡过程中C-Jun、Cytc和Caspase-9的作用#br#[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3943-3948.
[14]	左振魁, 韩佳瑞, 计树灵, 贺璐璐. 银杏酮酯预处理减轻辐射所致模型小鼠的急性肠损伤[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3666-3671.
[15]	张亮, 马晓燕, 王佳虹. 肾衰饮调控慢性肾功能衰竭大鼠肾脏细胞凋亡的机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3672-3677.