2.1  高糖对人脐静脉内皮细胞中PFKFB3 mRNA表达的影响  实时荧光PCR结果显示，与正常糖组相比，高糖组PFKFB3 mRNA的表达水平明显升高(P < 0.01)，见图1。

2.2  转染人脐静脉内皮细胞后PFKFB3表达的改变    Western blot结果显示，转染PFKFB3 siRNA对人脐静脉内皮细胞的PFKFB3表达有显著的抑制效果，见图2。

2.3  PFKFB3 siRNA对高糖培养的人脐静脉内皮细胞蛋白表达的影响  Western blot结果显示，与正常糖组相比，高糖组PFKFB3蛋白的表达水平明显升高(P < 0.01)；与高糖组相比，高糖+PFKFB3-siRNA组的PFKFB3蛋白表达明显降低(P < 0.05)。但与正常糖组相比，正常糖+PFKFB3- siRNA组中磷酸化AKT/AKT蛋白比值降低(P < 0.01)，高糖组中p-AKT/AKT蛋白比值降低(P < 0.01)，高糖+PFKFB3- siRNA组中磷酸化AKT/AKT蛋白比值升高(P < 0.01)，见图3。

2.4  PFKFB3 siRNA对高糖培养的人脐静脉内皮细胞中细胞管腔形成能力的影响  与正常糖组相比，正常糖+ PFKFB3-siRNA组管腔形成总长度明显增加(P < 0.05)，高糖组管腔形成总长度明显减少(P < 0.01)，高糖+PFKFB3- siRNA组管腔形成总长度无明显变化(P > 0.05)。与高糖组相比，高糖+PFKFB3-siRNA组管腔形成总长度明显增加(P < 0.05)，见图4。

糖尿病性视网膜病变是糖尿病中最常见的微血管并发症，同时也是工作人群视力损害的主要原因^[1-2]。长期高血糖的刺激可引起视网膜毛细血管周细胞凋亡以及内皮细胞迁移增殖，最终促使视网膜大量新生血管形成^[3-5]，影响患者视力。其中，血管内皮细胞在新生血管形成中起主要作用，为血管形成提供条件^[6]。内皮细胞依赖无氧糖酵解来产生大部分的ATP^[7-10]。6-磷酸果糖激酶1作为糖酵解中的限速酶之一，可使6-磷酸果糖转换为1，6二磷酸果糖。磷酸果糖激酶2/果糖-2，6-二磷酸酶(phosphofructokinase-2/ fructose-2，6-bisphosphatase，PFKFB)是6-磷酸果糖激酶1的变构激活剂，同时也是糖酵解的有效刺激剂^[11]。在PFKFB同工酶中，PFKFB3在内皮细胞中高表达^[12]。

作者所在课题组前期研究显示，PFKFB3在增殖性糖尿病性视网膜病变患者玻璃体和血清中及糖尿病大鼠视网膜中表达均升高^[13-14]。使用化学抑制剂3PO抑制PFKFB3后可明显降低高糖条件下人脐静脉内皮细胞的增殖和迁移等能力^[15]。此次实验拟通过体外高糖环境模拟糖尿病状态，采用小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)技术沉默人脐静脉内皮细胞中PFKFB3基因表达，观察PFKFB3-siRNA在高糖环境下对人脐静脉内皮细胞的影响，并进一步探讨PFKFB3对糖尿病性视网膜病变的作用及可能机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  细胞学实验。

1.2  时间及地点 于2016年3月至2017年6月在上海市眼底病重点实验室完成。

1.3  材料  人脐静脉内皮细胞购自美国ScienCell公司。

实验使用的主要试剂及仪器：内皮生长培养基购自美国ScienCell公司；葡萄糖购自上海碧云天；牛血清白蛋白购自Sigma公司；基质胶购自美国Corning公司；Trizol试剂购自美国Invitrogen公司；反转录试剂盒及SYBY Real-time PCR试剂盒购自日本Takara公司；PFKFB3抗体购自英国Abcam公司； Akt和磷酸化Akt抗体购自美国CST公司；β-actin抗体购自Sigma公司；ECL化学发光试剂盒购自美国Millipore公司；倒置显微镜购自日本Olympus公司；实时荧光定量PCR仪、垂直电泳仪购自美国Bio-Rad公司；siRNA-Mate^TM购自上海吉玛基因。

1.4  方法

1.4.1  细胞培养及分组  将人脐静脉内皮细胞复苏，以  2.5 g/L胰蛋白酶消化后接种于培养皿，使用内皮生长培养基继续传代培养，将传代培养第5代的人脐静脉内皮细胞随机分为4组：正常糖组(5.5 mmol/L葡萄糖)、正常糖+ PFKFB3-siRNA组(5.5 mmol/L 葡萄糖+PFKFB3-siRNA)、高糖组(30 mmol/L 葡萄糖)和高糖+PFKFB3-siRNA组   (30 mmol/L 葡萄糖+PFKFB3-siRNA)。

1.4.2  细胞转染  由上海吉玛基因公司合成4条siRNA，序列见表1。将处于对数生长期的人脐静脉内皮细胞制成细胞悬液(2×10⁴/孔)接种至6孔板中，内皮生长培养基培养至细胞融合达80%时开始进行转染。将转染细胞分为4组：空载体对照组、转染1组、转染2组、转染3组。根据预实验选择最佳siRNA干预浓度(56.28 nmol/L)，将配置好的siRNA oligo-siRNA-Mate复合物逐滴加到每一个孔中，使培养板混合均匀后置于37 ℃，体积分数5%CO₂孵育箱中转染6 h，清除培养基，PBS清洗3次后加入适量含全血清完全培养基，置于37 ℃，体积分数5%CO₂孵育箱中孵育48 h待用。

1.4.3  实时荧光定量PCR检测各组PFKFB3 mRNA的表达  Trizol试剂提取各组细胞总RNA，反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，反应条件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 45 s，58.5 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，共40个循环。每组设置3个副孔，以β-actin为内参，采用∆∆Ct法进行数据分析。引物序列如下：PFKFB3：5’-AAG GAG GAG GGC AGA ATC AT-3’/5’-ATC TGC ATG GTG ATG TTG GA-3’；β-actin：5’-GGA CTT CGA GCA AGA GAT GG-3’/5’-AGC ACT GTG TTG GCG TAC AG-3’。

1.4.4  Western blot检测蛋白表达  人脐静脉内皮细胞干预48 h后，提取细胞总蛋白，经BCA法测定蛋白浓度，根据浓度计算上样量进行SDS-PAGE电泳，湿转至聚偏二氟乙烯膜，用含5%脱脂牛奶的TBST封闭2 h，TBST清洗3次后，一抗(1∶1 000)摇床孵育过夜，TBST清洗，二抗 (1∶5 000)摇床孵育1 h，TBST清洗，采用ECL化学发光试剂盒暗室曝光显影，ImageJ图像分析软件(美国国立卫生研究院)分析灰度值。

1.4.5  体外管腔形成实验  使用预冷的枪头将基质胶缓慢打入置于冰浴中的96孔板中，每孔50 μL，放入培养箱中静置1 h使基质胶聚合。将细胞消化计数后加入各组培养基，混匀后每孔加入100 μL的细胞悬液(20×10³个细胞)，继续培养4-6 h，倒置显微镜记录各时间点细胞形态及管状结构等，应用ImageJ软件分析细胞成管长度。

1.5  主要观察指标  ①在不同糖浓度下PFKFB3 mRNA表达水平；②不同siRNA对人脐静脉内皮细胞的不同效果；③在不同糖浓度及siRNA转染下，PFKFB3、AKT、磷酸化AKT的蛋白表达水平；④不同糖浓度及siRNA转染下，管腔形成能力的检测。

1.6  统计学分析  采用SPSS 17.0统计学软件进行数据处理，计量资料采用x(_)±s表示，组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

糖尿病是一种由高血糖引起的疾病。SAFI等^[16]研究表明高血糖通过四条途径引起视网膜中的氧化应激。BARBER等^[17]在早期糖尿病性视网膜病变中发现神经元凋亡。也有研究指出血管完整性的破坏，引起血管通透性增加及视网膜血管新生^[18]。一旦出现视网膜新生血管，患者则进入到增殖性糖尿病视网膜病变，将严重影响患者视力^[19-20]，因此，视网膜新生血管的治疗已成为治疗糖尿病性视网膜病变的热点。目前，视网膜激光光凝、抗血管内皮生长因子药物和玻璃体切割虽然对视网膜新生血管有一定的效果^[21-23]，但这些方法对视网膜组织有一定的损   害^[24-25]，治疗后易复发，为此，进一步寻找价格低廉且对视网膜组织无害的药物或新靶点来防治糖尿病性视网膜病变已成为糖尿病性视网膜病变的新的研究热点。

内皮细胞拥有高度的无氧糖酵解活性，促新生血管因子可以明显上调内皮细胞中PFKFB3的表达^[26]，而敲除内皮细胞中的PFKFB3可以明显减少无氧糖酵解，表明PFKFB3在内皮细胞中扮演着重要的作用，内皮细胞中的PFKFB3同时参与病理性血管生成^[12]。作者通过观察PFKFB3-siRNA对高糖环境下人脐静脉内皮细胞管腔形成的影响，发现高糖环境下人脐静脉内皮细胞的PFKFB3蛋白及其mRNA表达均明显升高，这与作者所在课题组前期研究结果一致^[15]，说明高糖可以刺激人脐静脉内皮细胞的PFKFB3增加。血管内皮细胞包括大血管内皮细胞和微血管内皮，在高糖环境下细胞功能存在一定的差异^[27]，此次实验使用脐静脉血管内皮细胞不能完全说明PFKFB3在糖尿病性视网膜病变中的作用，作者将在后续的实验中将进一步采用微血管血管内皮细胞进行相关实验，以排除这一可能差异。

ZOU等^[28]研究指出，选取沉默效果最佳的一条siRNA来进行后续的实验。此次实验参照ZOU等^[28]的方法，使用转染siRNA来沉默PFKFB3的表达，通过沉默PFKFB3后检测其下游因子及其生物学效应，研究PFKFB3的作用。结果表明，与正常糖组相比较，高糖组中的人脐静脉内皮细胞管腔形成能力明显降低，说明高糖刺激可以使人脐静脉内皮细胞管腔形成受到破坏，这与XIE等^[29]的研究结果有部分相似之处。正常糖+PFKFB3-siRNA组中人脐静脉内皮细胞的管腔形成总长度明显较正常糖组增加，同时高糖+PFKFB3-siRNA组中管腔形成总长度明显较高糖组增加，说明沉默PFKFB3后可改善人脐静脉内皮细胞的管腔形成能力，这与作者所在课题组前期研究结果有部分相似之处^[15]。

AKT是PI3K/AKT信号通路中主要的效应器。既往研究表明AKT通过作用于转录因子来影响细胞的存活，从而保护神经元细胞^[30-31]。BEHL等^[18]研究发现糖尿病性视网膜病变中视网膜神经元细胞凋亡是糖尿病性视网膜病变中重要的发病机制之一。既往研究表明，在链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠模型中细胞凋亡比例是明显高于对照组的^[32]。同时，在糖尿病患者中，视网膜神经细胞的凋亡比例也是明显升高的^[18]。在此次实验中，与正常糖组相比，正常糖+ PFKFB3-siRNA组中磷酸化AKT/AKT蛋白比值是明显降低的，说明沉默PFKFB3对内皮细胞管腔形成能力有影响，抑制新生血管，其作用机制可能与PI3K/AKT信号通路有关，从而影响细胞生长、代谢及存活。与正常糖组相比，高糖组中PFKFB3显著增加，而磷酸化AKT/AKT蛋白比值降低，说明磷酸化AKT对于血管内皮细胞还存在其他作用，高糖+PFKFB3-siRNA组中PFKFB3显著减少，而磷酸化AKT/AKT蛋白比值升高，进一步说明磷酸化AKT对血管内皮细胞存在其他作用，在作者所在课题组下一步实验中将进一步论证磷酸化AKT对于血管内皮细胞的具体作用。

综上，模拟体内高糖环境时，人脐静脉内皮细胞中PFKFB3 mRNA及蛋白表达均升高，磷酸化AKT/AKT蛋白比值降低，管腔形成能力降低，沉默PFKFB3后，人脐静脉内皮细胞管腔形成能力增加，磷酸化AKT/AKT蛋白比值增高，表明沉默PFKFB3对高糖环境下血管内皮细胞管腔形成能力有影响，其作用机制可能与PI3K/AKT信号通路有关，磷酸化AKT可能存在血管内皮细胞保护作用，但仍需进一步实验论证。故PFKFB3有望成为治疗糖尿病性视网膜病变中新生血管新的分子靶点。

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文题释义：
6-磷酸果糖激酶-2/果糖-2，6-二磷酸酶3(PFKFB3)：糖酵解作为血管内皮细胞中提供能量的主要方式，而6-磷酸果糖激酶-2/果糖-2，6-二磷酸酶作为糖酵解中重要的刺激剂，在肿瘤新生血管方面具有重要作用，在此次实验中主要用于说明在高糖环境下对血管内皮的作用。
糖尿病性视网膜病变：是糖尿病中微血管严重并发症之一，一旦产生视网膜新生血管，将严重影响工作人群的视力，此次实验主要研究脐静脉内皮细胞在高糖环境中PFKFB3的作用，以期找到缓解视网膜新生血管的新靶点。

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糖尿病性视网膜病变的主要治疗方法：①药物治疗：原则上应当首先并经常将血糖控制到正常或接近正常水平。对于血脂偏高和视网膜黄斑区及其周围有环形硬性渗出的糖尿病患者，应摄取低脂饮食，并应用降血脂药物。对糖尿病合并高血压病的患者控制血压；②光凝治疗：被认为是治疗糖尿病性视网膜病变的有效方法；③冷凝治疗：主要用于不适合做光凝治疗的患者或光凝治疗的补充疗法；④玻璃体切割：对于糖尿病性视网膜病变，玻璃体切割术的基本适应证是玻璃体出血及严重的增殖性病变。

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