shRNA沉默骨膜蛋白基因抑制人骨肉瘤的血管生成

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1429

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (35): 5638-5644.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1429

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shRNA沉默骨膜蛋白基因抑制人骨肉瘤的血管生成

徐朝健，张龙，程才统，冯毅，吕嘉，孙晓娟，吕智

(山西医科大学第二医院骨科，山西省太原市 030001)

收稿日期:2019-05-09 出版日期:2019-12-18 发布日期:2019-12-18
通讯作者: 吕智，主任医师，山西医科大学第二医院骨科，山西省太原市 030001
作者简介:徐朝健，男，1980年生，山西省吕梁市人，汉族，2006年山西医科大学毕业，硕士，副主任医师，主要从事骨与软组织肿瘤研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(81772867)，项目负责人：孙晓娟；山西省应用基础研究计划项目(201801D121215)，项目负责人：吕智；山西省应用基础研究计划项目(201801D121326)，项目负责人：徐朝健

Silencing of periosteal protein gene by shRNA inhibits angiogenesis in human osteosarcoma

Xu Chaojian, Zhang Long, Cheng Caitong, Feng Yi, Lü Jia, Sun Xiaojuan, Lü Zhi

(Department of Orthopedics, the Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China)

Received:2019-05-09 Online:2019-12-18 Published:2019-12-18
Contact: Lü Zhi, Chief physician, Department of Orthopedics, the Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China
About author:Xu Chaojian, Master, Associate chief physician, Department of Orthopedics, the Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81772867 (to SXJ); the Applied Basic Research Program of Shanxi Province, No. 201801D121215 (to LZ), No. 201801D121326 (to XCJ)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
骨膜蛋白：又称成骨细胞特异性因子2，是一种细胞外基质蛋白，参与细胞的募集、黏附过程，并且在多种恶性肿瘤中呈现高表达，与肿瘤的迁移、增殖和血管生成能力有关。
小动物活体荧光断层成像技术：是小动物活体成像领域的新一代技术，利用萤火虫荧光素酶或荧光蛋白作为报告基因，通过转基因技术体外标记肿瘤细胞而直接观测肿瘤的发展变化，或者标记特定基因研究肿瘤相关基因在肿瘤发生发展中的作用。

摘要
背景：骨膜蛋白(periostin，POSTN)是一种细胞外基质蛋白，在多种肿瘤组织中表达上调，与肿瘤的迁移、增殖和血管生成能力有关。血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth factor2，VEGFR2/KDR)与其配体血管内皮生长因子结合后主要调控血管的发生和构建，但KDR与POSTN在骨肉瘤中的相互作用尚不清楚。
目的：探讨POSTN在体内、外水平对人骨肉瘤增殖和体内血管生成能力影响及其作用机制。
方法：①体外实验：qRT-PCR和Western blot检测人骨肉瘤临床标本组织中POSTN和KDR的mRNA及蛋白表达水平；qRT-PCR检测3株不同人骨肉瘤细胞系内POSTN表达，筛选基因表达最高的细胞系进行转染实验；转染慢病毒包装pPLK-POSTN-shRNA进入Saos-2细胞，选出3个作用靶点中抑制率最高的序列进行后续实验；②体内实验：取裸鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)12只，实验组(n=6)将慢病毒包装pPLK-POSTN-shRNA转染的Saos-2细胞注射至胫骨髓腔中，对照组(n=6)将慢病毒包装pPLK-Scramble-shRNA转染的Saos-2细胞注射至胫骨髓腔中，接种5周后，测量瘤体体积与质量；接种3周后，应用小动物活体成像检测血管生成情况；接种5周后取瘤体组织，Western blot检测POSTN、增殖细胞核抗原、KDR和p-AKT蛋白表达，病理切片免疫组织化学染色内皮细胞黏附分子蛋白表达。实验方案经山西医科大学第二医院伦理委员会批准(编号：2018002)。
结果与结论：①体外实验：骨肉瘤组织中POSTN和KDR的mRNA及蛋白水平表达均高于正常骨组织(P < 0.01)；Saos-2细胞中的POSTN基因表达量较MG-63和U2-OS细胞高；②体内实验：实验组瘤体体积和质量均小于对照组(P < 0.05)；实验组瘤体内血管生成量少于对照组(P < 0.05)；实验组POSTN、增殖细胞核抗原、KDR和p-AKT及内皮细胞黏附分子蛋白表达均低于对照组(P < 0.05)；③结果表明：沉默POSTN基因可抑制骨肉瘤血管生成，其机制可能与KDR/PI3K/AKT通路活化有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0003-4818-901X(徐朝健)

关键词: 骨肉瘤, 骨膜蛋白, POSTN蛋白, 血管生成, KDR, PI3K/AKT通路, Saos-2细胞, 血小板内皮细胞黏附分子1

Abstract:

BACKGROUND: Periostin (POSTN) is an extracellular matrix protein that is upregulated in most tumor tissues and is associated with tumor migration, proliferation and angiogenesis. Vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2/KDR) mainly regulates the occurrence and construction of blood vessels after combining with its ligand VEGF, but the interaction between KDR and POSTN in osteosarcoma is still unclear.
OBJECTIVE: To investigate the effect of POSTN on the proliferation and angiogenesis of human osteosarcoma in vitro and in vivo and the underlying action mechanism.
METHODS: In vitro study: The mRNA and protein levels of POSTN and KDR in human osteosarcoma clinical specimens were detected by qRT-PCR and western blot analysis. POSTN expression in three human osteosarcoma cell lines was detected by qRT-PCR. POSTN shRNA plasmids were transfected into Saos-2 cells and the sequence with the highest inhibition rate among the three targets was selected for subsequent experiments. Fluorescence quantity of cells was observed under fluorescence microscope, and the transfection efficiency was detected by qRT-PCR. In vivo study: twelve nude mice (Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd., China) were randomly divided into an experimental group and a control group (n = 6/group). In the experimental group, Saos-2 cells transfected with pPLK-POSTN-shRNA were injected into the tibial medullary cavity of nude mice. In the control group, Saos-2 cells transfected with pPLK-Scramble-shRNA were identically injected. After 3 weeks of inoculation, angiogenesis was detected by in vivo imaging. After 5 weeks of inoculation, the removed tumor tissue was measured in volume and mass and then used for detecting the expression of POSTN, proliferating cell nuclear antigen, KDR and p-AKT protein by western blot analysis and the expression of endothelial cell adhesion molecule by immunohistochemical staining. This study was approved by Medical Ethics Committee, the Second Hospital of Shanxi Medical University of China (approval No. 2018002).
RESULTS AND CONCLUSION: (1) In vitro study: The mRNA and protein levels of POSTN and KDR in osteosarcoma tissues were higher than those in normal bone tissues (P < 0.01). POSTN expression in Saos-2 cells was higher than that in MG-63 and U2-OS cells. (2) In vivo study: the tumor volume and mass of the experimental group were lower than those of the control group (P < 0.05). Osteosarcoma angiogenesis in the experimental group was significantly lower than that in the control group (P < 0.05). POSTN, proliferating cell nuclear antigen, KDR and p-Akt as well as endothelial cell adhesion molecule protein levels in the experimental group were significantly lower than those in the control group (P < 0.05). (3) These results suggest that silencing POSTN gene can inhibit osteosarcoma angiogenesis, which may be related to the activation of KDR /PI3K/AKT pathway.

Key words: osteosarcoma, periostin, POSTN protein, angiogenesis, KDR, PI3K/AKT pathway, Saos-2 cells, platelet endothelial cell adhesion molecule 1

中图分类号:

徐朝健，张龙，程才统，冯毅，吕嘉，孙晓娟，吕智. shRNA沉默骨膜蛋白基因抑制人骨肉瘤的血管生成[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(35): 5638-5644.

Xu Chaojian, Zhang Long, Cheng Caitong, Feng Yi, Lü Jia, Sun Xiaojuan, Lü Zhi .

Silencing of periosteal protein gene by shRNA inhibits angiogenesis in human osteosarcoma

[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(35): 5638-5644.

图/表（结果） 3

2.1 体外实验结果

2.1.1 临床骨肉瘤样本中POSTN和KDR表达 qRT-PCR检测结果显示，人骨肉瘤组织中的POSTN和KDR mRNA表达水平均明显高于正常骨组织(P < 0.01)，见图1A。Western blot检测同样显示POSTN和KDR蛋白在人骨肉瘤组织中的表达水平高于正常骨组织，见图1B。

2.1.2 人骨肉瘤细胞系中的POSTN mRNA表达相对于c-28细胞，骨肉瘤细胞系中的POSTN mRNA表达升高(P < 0.01)，且在Saos-2细胞中的POSTN mRNA表达高于MG-63和U2-OS细胞，见图2。后续以Saos-2细胞为实验对象。

2.1.3 转染效率检测转染48 h后倒置荧光显微镜下观测荧光细胞数量，结果显示两组转染效率均在80%以上，见图3A。各组细胞传代一二次后部分细胞冻存于液氮中，另有部分细胞用于RNA提取，qRT-PCR检测POSTN的mRNA表达水平，结果显示POSTN靶点2序列(target 2)质粒的沉默效率最高(P < 0.05)，见图3B。

2.2 体内实验结果

2.2.1 成瘤情况 Saos-2细胞混和Matrigel混悬液原位注射于裸鼠胫骨髓腔内，小动物X射线扫描针头位置，确保细胞混悬液注射入胫骨髓腔内，12只裸鼠全部成瘤，见图4。

2.2.2 移植瘤体积与质量根据移植瘤裸鼠的瘤体长宽度测量数据绘制生长曲线，接种5周后完整取出瘤体，包括胫骨部分但需切除瘤体未包裹的胫骨及裸鼠脚，结果显示实验组瘤体体积和质量均小于对照组，见图5。

2.2.3 血管生成接种3周后尾静脉注射AngioSense 750 EX荧光检测液，注射48 h后进行小动物活体成像扫描，显示实验组瘤体内血管生成量较对照组明显减弱(P < 0.05)，见图6。

2.2.4 蛋白检测实验组中POSTN、增殖细胞核抗原、KDR、p-AKT蛋白表达量均较对照组减弱(P < 0.05)，见图7，提示沉默POSTN可显著抑制PI3K/AKT的磷酸化过程。

2.2.5 病理观察裸鼠瘤体组织石蜡切片苏木精-伊红染色可见致密的粉红色、多型性类骨质；免疫组织化学染色显示，实验组中内皮细胞黏附分子表达较对照组减少，见图8。

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引言

骨肉瘤是原发于骨髓腔最常见的原发恶性骨肿瘤，好发于儿童和青少年，四肢为其主要的发病部位。骨肉瘤是青少年癌症相关致死因素之一，各国家的发病率高低不同，在(0.1-1)/10万之间^[1]。由于新辅助化疗及广泛切除外科边缘手段治疗的推广，骨肉瘤患者的5年生存率已有显著提高，但流行病学调查显示骨肉瘤患者的5年生存率为55%-68%，治疗效果不尽如人意^[2]。因此深入研究骨肉瘤的分子发病机制，寻找靶向性特异性更高的新的治疗手段已成为亟待解决的关键问题。

骨膜蛋白(periostin，POSTN)又称成骨细胞特异性因子2，首先是由Takcshita在小鼠体内的成骨细胞系中发现的一种新型骨分子，其原始功能可促进成骨及其前体细胞的聚集和分化，多存在于胶原丰富的结缔组织，在骨膜和牙周膜组织中高表达。近年随着对POSTN的深入研究，发现其不仅参与细胞的募集、黏附过程，而且其在多种恶性肿瘤中呈现高表达^[3-4]。研究表明POSTN在骨肉瘤组织中呈高表达，表达水平与骨肉瘤患者预后呈负相关^[5]。肿瘤生长离不开血管的养分供应，恶性肿瘤的生长和转移具有血管依赖性，当肿瘤的直径超过2 mm后，如果没有相应血管供给养分，肿瘤就会“饿死”。目前以靶向作用肿瘤血管内皮细胞进而抑制肿瘤血管生成，从而阻断肿瘤的血液供应成为抗肿瘤生长和转移复发的研究热点。血管内皮生长因子具有刺激内皮细胞增殖、增加血管通透性和新血管生成的作用，主要是通过结合和激活血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2/KDR)实现的。KDR在肺癌组织中的表达十分广泛，与肺癌的转移及预后有关^[6]。研究表明POSTN在口腔癌细胞中表达量明显升高，可增强癌细胞侵袭性和血管生成能力。研究发现POSTN对血管内皮细胞和血管形成的调控都是经过FAK/PI3K/AKT信号通路发挥作用^[7]。PI3K/AKT信号通路对肿瘤细胞的增殖和促血管生成有明显的促进作用。POSTN整合素类蛋白联合可激活FAK和Akt/PKB的活性，进而促进肿瘤的血管生成、侵袭和转移能力^[8]。但POSTN与KDR在骨肉瘤血管生成方面的机制尚不清楚。

实验对3株不同骨肉瘤细胞系内POSTN表达水平进行筛选，选出表达水平最高的Saos-2细胞系作为研究对象，通过体、内外实验探讨POSTN与骨肉瘤血管生成的关系，并深入机制研究，为临床抗骨肉瘤血管生成治疗提供理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计体外分子生物学实验与动物模型体内验证。

1.2 时间及地点实验于2018年6月至2019年1月在山西医科大学第二医院骨与关节损伤山西省重点实验室完成。

1.3 材料

临床骨肉瘤样本：2013年11月至2017年11月保存在山西医科大学第二医院病理科生物样本库中的21例骨肉瘤患者瘤体石蜡组织块及保存在液氮中的瘤体样本和5份正常骨组织，标本采用标本库的统一编号，对患者姓名及个人资料严格保密。所取样本均已获得患者签署的《山西医科大学第二医院生物样本库标本留取知情同意书》。

实验动物：12只4周龄BALBc-nu/nu雌性裸鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，体质量15-20 g，生产许可证号：SCXK(京)2014-0006，使用许可证号：SYXK(晋) 2015-0001。实验方案经山西医科大学第二医院伦理委员会批准(编号：2018002)。

实验用细胞及试剂：人骨肉瘤细胞系Saos-2、MG-63、U2-OS和人正常软骨细胞c-28均购自美国模式培养物集存库(American Type Culture Collection，ATCC)；RPMI 1640培养基、DMEM培养基、胎牛血清和胰蛋白酶消化液购自美国Gibco公司；Matrigel胶购自美国BD公司；质粒及慢病毒包装购自南京PPL质粒库；6孔板、96孔板和离心管购自美国Corning公司；免疫组织化学试剂盒购自北京中衫金桥生物公司；qRT-PCR试剂和引物购自广州锐博生物公司；增殖细胞核抗原、KDR和β-actin抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；POSTN、p-AKT和AKT抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology公司；AngioSense 750 EX购自美国PerkinElmer公司。

1.4 方法

1.4.1 细胞培养将骨肉瘤细胞系Saos-2和MG-63培养在含体积分数10%胎牛血清和1%青链霉素的RPMI 1640完全培养基中，将骨肉瘤细胞系U2-OS和人正常软骨细胞c-28培养在含体积分数10%胎牛血清和1%青链霉素的DMEM完全培养基中，在37 ℃、体积分数5%CO₂和95%湿度的恒温培养箱中培养。当细胞达到对数生长期可用于传代，用PBS(0.01 mol/L)冲洗贴壁细胞2遍，加入含有EDTA的胰蛋白消化酶(0.25%)消化细胞，静置一二分钟，镜下观察细胞变圆开始脱落时，加入常规培养液终止消化，吹打重悬细胞并传代。

1.4.2 骨肉瘤临床样本POSTN与KDR表达采用Western blot与qRT-PCR检测骨肉瘤临床标本与正常骨组织中POSTN、KDR蛋白与基因表达。

1.4.3 骨肉瘤细胞与正常软骨细胞中POSTN表达采用qRT-PCR检测骨肉瘤细胞系与正常软骨细胞中POSTN基因表达。筛选POSTN基因表达最高的骨肉瘤细胞系进行转染实验。

1.4.4 细胞转染调整Saos-2细胞浓度为4×10⁷ L^-1，接种于6孔板中，设置3个复孔，次日进行瞬时转染，实验组转染pPLK-POSTN-shRNA质粒抑制POSTN表达，针对POSTN(GenBank_ID：10631)基因的shRNA质粒设置了3个靶基因序列，分别为：PPL01278-3a (CGG TGA CAG TAT AAC AGT AAA)，PPL01278-3b (GCA ACG TGA ATG TTG AAT T)，PPL01278-3c (GGA TCT TGT GGC CCA ATT A)；对照组转染pPLK-Scramble-shRNA。转染前1 d，将细胞按照1×10⁵/孔密度接种于24孔细胞培养板中过夜培养。将pPLK-POSTN-shRNA和pPLK-Scramble-shRNA分别与Lipofectamine 3000混匀后加入孔内，使得各组shRNA终浓度为100 nmol/L，置于细胞培养箱内孵育24-48 h(依据实验决定)，荧光显微镜下观测转染效率，采用qRT-PCR检测转染效率。筛选转染效率较高的靶基因序列。

1.4.5 动物模型构建 pPLK-POSTN-shRNA和pPLK-Scramble-shRNA质粒采用慢病毒包装转染Saos-2细胞。转染前1 d，将细胞按照1×10⁴/孔密度接种于6孔细胞培养板中过夜培养。将慢病毒-pPLK-POSTN-shRNA (MOI=20)和慢病毒-pPLK-Scramble-shRNA(MOI=20)分别与5 mg/L的Polybrene均匀混合后加入孔内，置于细胞培养箱内孵育24-96 h，定期细胞换液。后期用3 mg/L嘌呤霉素筛选细胞。荧光显微镜下观测转染效率，并采用qRT-PCR检测转染效率。

将200 μL转染后的Saos-2细胞(1×10⁹ L^-1)与200 μL Matrigel胶低温条件下均匀混合，用于接种。麻醉12只裸鼠，麻醉满意后平稳固定在手术操作台上，碘伏局部消毒，先用无菌的胰岛素注射器(1 U)垂直胫骨平台刺入胫骨髓腔约1 mm，轻微旋转拔出针头，采用25 g针头的微量进样器吸取细胞混悬液，从上述针刺孔道进入，轻微注射50-100 μL混悬液并慢慢向外退针但不要拔出针头，1 min后拔针并用无菌棉球按压数10 s，再次确保混悬液无泄露。定期测量瘤体长度(L)、宽度(W)，按照公式V=1/6×π×L×W²计算体积。

接种3周后，应用小动物活体成像检测血管生成情况；接种5周后颈脱臼处死小鼠，肿瘤称质量，拍照，置于-80 ℃保存，Western Blot检测瘤体组织中POSTN、增殖细胞核抗原、KDR、p-AKT基因及蛋白表达。瘤体组织在甲醛中固定后进行苏木精-伊红染色与免疫组织化学分析。

1.4.6 检测方法

qRT-PCR检测：用Trizol裂解各组细胞或组织，提取总RNA。采用Bulge-Loop^TM miRNA qRT-PCR Starter Kit试剂盒以反转录成果cDNA为模板，进行扩增。SYBR Green Mix试剂包括：Taq 酶、dNTP mix、PCR Buffer、SYBR GreenⅠ。POSTN的相对含量以RS18作为内参，以 2^-^??^Ct 方法计算其相对值为最终结果。POSTN基因上游引物序列：5'-CCC CGT GAC TGT CTA TAA GC-3'，下游引物序列：5'-AAA TGA CCA TCA CCA CCT TCA-3'；KDR基因上游引物序列：5'-GCC CTG CTG TGG TCT CAC TAC-3'，下游引物序列：5'-CAA AGC ATT GCC CAT TCGAT-3'；RS18基因上游引物序列：5'-GCC ATC AAG GGT ATC GGT AGA C-3'，下游引物序列：5'-CTG CCT GTT AAG GAA CCA GTC AG-3'；扩增程序：95 ℃ 15 min预变性；95 ℃ 30 s变性；55 ℃ 5 s退火；72 ℃ 5 s，延伸收集信号40次；85 ℃熔解曲线分析。

Western Blot检测：用蛋白裂解液裂解各组细胞或组织，提取总蛋白。采用BCA蛋白定量试剂盒检测浓度，分装并低温保存备用。蛋白液与Loading Buffer充分混匀后后100 ℃煮10 min，分别制备分离胶(12%)和浓缩胶(5%)。按照每孔50 μg蛋白上样，加入分离胶中的十孔梳子孔内，电泳转膜并封闭，一抗在4 ℃摇床上过夜孵育：anti-POSTN：sc-398631，1∶800稀释；anti-PCNA：cat.2586，1∶2 000稀释；anti-KDR：cat.9698，1∶1 000稀释；anti-p-AKT：sc-7985-R，1∶500稀释；anti-AKT：sc-5298，1∶800稀释；anti-β-actin：cat. 4970，1∶1 000稀释。次日TBST洗膜，二抗常温孵育1 h，再次TBST洗膜后滴加ECL发光液检测。

免疫组织化学：将移植瘤样本常规脱水石蜡包埋，病理切片，组织厚度5 µm。切片常规脱蜡至水，抗原采用热修复。一抗4 ℃孵育过夜，阴性对照组为加入PBS代替一抗。自然晾干滴后加二抗室温孵育15 min。DAB显色，最后脱水透明，封固镜检。采用全自动玻片扫描仪(3DHISTECH)检测，扫描控制软件计数内皮细胞黏附分子阳性细胞数。

1.5 主要观察指标 ①体外实验检测POSTN和KDR在人骨肉瘤组织和细胞内的表达情况；②体内实验检测POSTN对瘤体生长和血管生成的影响，并检测瘤体组织中POSTN对KDR表达和PI3K/AKT磷酸化过程的影响。

1.6 统计学分析使用SPSS 20.0统计软件分析，瘤体质量和体积数据呈正态分布，以x(_)±s表示，两组间比较采用t 检验，多组间比较采用单因素方差分析，两两间比较采用 SNK-q检验；应用 GraphPad Prism 5软件绘制剂量反应曲线和瘤体生长曲线图，检验水准：α=0.05。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

骨肉瘤是最常见原发性骨组织恶性肿瘤，多发于青少年，以恶性程度高、侵袭性强、复发和转移率高为特点，其中复发与转移仍是目前临床治疗面临的2大难题^[9]。目前骨肉瘤的主要治疗采用手术切除与全身化疗的新辅助疗法，使得骨肉瘤患者术后5年生存率上升至60%^[10]，但并非所有患者的疗效都尽如人意，尤其是发生远处转移或复发的患者，预后更差^[11]。尽管近年来骨肉瘤的临床和基础研究取得相当卓越的进步，但是有关骨肉瘤复发和转移性等决定性问题仍未得到清楚的阐释，其相关生物学分子机制尚不清楚，缺乏有效的特异性生物靶向治疗药物，故进一步的分子机制研究仍需要很长的路要走。

恶性肿瘤的生长和转移具有明显血管依赖性，当肿瘤的直径超过2 mm后，如果缺少血管供给养分肿瘤就会“饿死”^[12]。以肿瘤血管内皮细胞为靶点抑制肿瘤血管生成，进而而阻断肿瘤血液供应成为当前抗肿瘤生长和转移复发的研究热点。血管内皮生长因子是一种可以选择性促进血管内皮细胞形成的糖蛋白，研究表明其和肿瘤血管形成、侵袭转移有密切联系，抑制肿瘤血管形成可以有效抑制肿瘤的发生和转移^[13]。血管内皮生长因子通过与其受体结合进而在血管生成中发挥作用。血管内皮生长因子与血管内皮细胞上KDR的细胞外结合域结合后，使每2个单体受体分子在膜上形成二聚体，并致受体细胞内结合域尾部酪氨酸残基发生磷酸化，进而激活下游信号通路，发挥一系列生物学效应，促使肿瘤血管生成^[14-15]。目前已知有3个血管内皮生长因子的酪氨酸激酶受体，即血管内皮生长因子受体1、KDR、血管内皮生长因子受体3。KDR在人肿瘤细胞中呈高表达，但是在人正常成熟内皮细胞中表达水平却很低。在动物基因组内，编码KDR的基因突变会导致已有的血管内皮细胞通过出芽方式生成血管减少及其功能减弱，但不会影响间质细胞分化成为血管内皮细胞和血细胞的生成，结果提示KDR是血管生成的关键调控因子^[16]。

KDR在血管内皮生长因子介导的血管生成作用中扮演主要角色。血管内皮生长因子与KDR与结合后，活化KDR胞内激酶区特定的酪氨酸残基交叉并产生磷酸化，在细胞增殖、迁移和分化方面发挥巨大作用^[17]。研究表明KDR的高表达与肺癌患者不良预后存在显著相关性^[18]，且KDR在骨肉瘤组织中血管周围肿瘤细胞质呈强阳性表达^[19]。miR-370-3p可通过作用于KDR且阻滞AKT/FOXO1信号通路抑制脑动脉瘤的进展^[20]。实验对骨肉瘤临床组织样本的POSTN和KDR表达水平进行检测，发现POSTN和KDR表达水平呈正相关，均在骨肉瘤中均呈现高表达水平，提示POSTN与KDR的高表达可能与骨肉瘤血管生成有关。

POSTN是成骨细胞中具有黏附作用的细胞外基质分泌蛋白，参与恶性肿瘤细胞的增殖和迁移等病理进程。研究表明POSTN可通过P13K/AKT信号通路的激活促进结肠癌细胞的增殖和血管生成^[21]。另外，POSTN还可通过激活P13K/AKT通路促进非小细胞肺癌细胞的存活能力^[22]。POSTN在结直肠癌中过表达，提示与患者预后不良存在明显临床相关性^[23]。重要的是，有研究报道在人乳腺癌发展进程中POSTN诱导的血管生成增加，并非是通过增加血管内皮生长因子的表达量起作用，而是通过增加KDR的表达进而促进乳腺癌血管的生成^[24]。

血管内皮生长因子/KDR下游诸多的信号通路中，AKT是一个关键的连接点，它不仅连接信号转导，还参与了NO的生成及前列腺素的生物合成，所以PI3K/AKT这条信号通路的激活是血管生成过程中重要的一步^[25]。POSTN可与整合素结合，通过PI3K/AKT通路改变肿瘤细胞微环境进而促进增殖^[26]。实验对荷瘤小鼠瘤体蛋白检测PI3K/AKT信号通路蛋白和KDR的表达，检测shRNA沉默POSTN基因对抑制人骨肉瘤血管生成的正性作用，并采用免疫组织化学检测内皮细胞黏附分子的表达情况，借此反映瘤体组织内血管生成情况。

实验首先对临床骨肉瘤患者瘤体组织的POSTN和KDR表达水平进行检测，发现POSTN和KDR表达水平呈正相关，并且在骨肉瘤中均呈现高表达水平，提示POSTN与KDR的高表达可能与骨肉瘤血管生成有关。进一步检测骨肉瘤细胞系中POSTN的表达，发现其在骨肉瘤细胞中表达较正常细胞明显升高。接着通过质粒构建并瞬时转染技术沉默POSTN表达，选择沉默POSTN效率最高的靶点进行后续体内实验。通过慢病毒包装质粒转染Saos-2细胞构建骨肉瘤动物模型，验证沉默POSTN可在体抑制骨肉瘤小鼠移植瘤生长，采用小动物活体成像技术验证沉默POSTN可抑制血管生成活性。追溯机制，实验对小鼠瘤体蛋白检测PI3K/AKT信号通路蛋白和KDR的表达，证实了shRNA沉默POSTN基因可抑制人骨肉瘤血管生成。实验中敲减POSTN后经小动物活体成像发现小鼠瘤体血管生成减少，证实沉默POSTN的抑制血管生成作用，并经内皮细胞黏附分子的免疫组织化学结果验证。但Western blot发现KDR表达及AKT磷酸化减弱，抗血管生成作用还需后续更多实验验证。另外实验中采用的是慢病毒转染技术，与临床治疗尚存在较大差别，故课题组在以后的研究中会采用更接近目前临床治疗的给药途径，如脂质纳米颗粒载体经静脉给药途径，使得研究方法更接近临床治疗途径、结果更加可靠，为骨肉瘤的分子靶向治疗提供科学依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

shRNA沉默骨膜蛋白基因抑制人骨肉瘤的血管生成

Silencing of periosteal protein gene by shRNA inhibits angiogenesis in human osteosarcoma

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