低强度脉冲超声对高糖诱导人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1679

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
血管内皮细胞：是介于血流和血管壁组织之间的一层单核细胞，可通过自分泌、内分泌、旁分泌3种途径分泌一系列血管活性物质发挥调节血管紧张性、抗血栓形成、抑制平滑肌细胞增殖及血管壁炎症反应等功能。然而血管内皮在受到一系列有害因素作用时，内皮细胞释放的舒血管因子减少，缩血管因子增多，打破血管平衡稳态，最终导致一系列心血管事件的发生。
超声脉冲反射法的优点：①灵敏度高，当反射声压为起始声压的1%时即能检测出，可发现较小的缺陷；②缺陷定位精度较高。通常仪器的水平线性误差小于2%，该类仪器定位精度较高，对不同声程上相邻缺陷的分辨力也较高；③适用范围广。改变耦台、探头和波型可实现不同方法的检测；④能确定缺陷的当量大小。

摘要
背景：研究表明，人脐静脉内皮细胞参与多种原因引起的血管结构紊乱和功能障碍，有可能成为相关疾病治疗的新靶点。
目的：探讨低强度脉冲超声对高糖环境诱导的人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用及机制。
方法：将人脐静脉内皮细胞随机分为正常对照组、高糖刺激模型组、低强度脉冲超声30，60，90 mW/cm²组。高糖刺激模型组和低强度脉冲超声组人脐静脉内皮细胞给予25 mmol/L葡萄糖高糖刺激处理24 h从而建立高糖模型；低强度脉冲超声组细胞造模后给予30，60，90 mW/cm²低频脉冲处理，每天20 min，连续7 d。采用MTT法检测各组细胞活力，流式细胞仪检测各组细胞凋亡率，比色法检测各组细胞Caspase-3、9活性，分光光度法检测丙二醛水平、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶及谷胱甘肽过氧化物酶活性，Western blot及RT-PCR检测各组细胞中JNK的表达。
结果与结论：①与正常对照组比较，高糖刺激模型组细胞活力明显降低(P < 0.01)，细胞凋亡率升高(P < 0.01)，丙二醛水平以及Caspase-3、9活性均显著提高(P < 0.01)，超氧化物歧化酶、过氧化氢酶及谷胱甘肽过氧化物酶活性降低(P < 0.01)，JNK表达水平上调(P < 0.01)；②与高糖刺激模型组比较，低强度脉冲超声组细胞活力提高(P < 0.01)，细胞凋亡率、丙二醛水平以及Caspase-3、9活性降低(P < 0.01)，超氧化物歧化酶、过氧化氢酶及谷胱甘肽过氧化物酶活性提高(P < 0.01)，JNK表达水平下调(P < 0.01)，照射强度90 mW/cm²时以上变化最明显；③低强度脉冲超声可能通过提高细胞的抗氧化能力以及调控细胞中的JNK信号转导通路以抵抗细胞凋亡，进而抑制高糖诱导的人脐静脉内皮细胞损伤；照射强度90 mW/cm²时作用最显著。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-7060-1213(叶奎)

关键词: 人脐静脉内皮细胞, 低强度脉冲超声, 高糖刺激, 氧化应激, 细胞凋亡, JNK信号通路

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that human umbilical vein endothelial cells participate in vascular structural disorders and dysfunction due to a series of causes, which may become a new target for the treatment of related diseases.
OBJECTIVE: To investigate the protective effect and mechanism of low-intensity pulsed ultrasound on the high glucose-induced injury to human umbilical vein endothelial cells.
METHODS: Human umbilical vein endothelial cells were randomly divided into normal control group, high glucose group and 30, 60 and 90 mW/cm² low-intensity pulsed ultrasound groups. For the high glucose group and three low-intensity pulsed ultrasound groups, the high-glucose stimulation with 25 mmol/L glucose was given. Additionally, the cells in the three low-intensity pulsed ultrasound groups received 30, 60, and 90 mW/cm² low-intensity pulsed ultrasounds, 20 minutes per day for 7 continuous days, respectively. MTT was used to detect cell activity and flow cytometry was used to detect cell apoptosis in each experimental group. Colorimetry was used to detect Caspase-3 and -9 activities in the human umbilical vein endothelial cells. Spectrophotometry was used to detect malonaldehyde content, superoxide dismutase activity, catalase activity, and glutathione peroxidase activity. Expression of JNK in the cells was observed by western blot and RT-PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: After high glucose treatment, the viability of human umbilical vein endothelial cells was significantly lowered; the apoptosis rate, malonaldehyde content and activities of Caspase 3 and 9 were significantly increased (P < 0.01); the activities of superoxide dismutase, catalase and glutathione peroxidase significantly decreased (P < 0.01); and the JNK expression level was up-regulated (P < 0.01). Compared with the high glucose group, the cell viability of the low-intensity pulsed ultrasound groups (30, 60,90 mW/cm² subgroups) was increased (P < 0.01), and the apoptosis rate, malonaldehyde content, and Caspase 3, 9 activities were decreased (P < 0.01), superoxide dismutase, catalase and glutathione peroxidase activities were increased (P < 0.01), and JNK expression level was down-regulated (P < 0.01). The above changes were most obvious when the irradiation intensity was 90 mW/cm². In conclusion, low-intensity pulsed ultrasound can inhibit the high glucose-induced apoptosis of human umbilical vein endothelial cells by increasing the antioxidant capacity and regulating the JNK signaling pathway, further inhibiting the high glucose-induced injury to the human umbilical vein endothelial cells. The low-intensity pulsed ultrasound at 90 mW/cm² can achieve the best outcomes.

Key words: human umbilical vein endothelial cells, low-intensity pulsed ultrasound, high glucose stimulation, oxidative stress, apoptosis, JNK signaling pathway

中图分类号:

叶奎. 低强度脉冲超声对高糖诱导人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(17): 2728-2733.

Ye Kui. Low-intensity pulsed ultrasound protects against high glucose-induced injury to human umbilical vein endothelial cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(17): 2728-2733.

图/表（结果） 3

2.1 人脐静脉内皮细胞活力 由表2可知，与正常对照组相比，高糖刺激模型组细胞活力显著降低。经过低强度脉冲超声处理后，细胞活力显著提高，其中90 mW/cm²脉冲超声处理组效果最好。

2.2 人脐静脉内皮细胞的凋亡情况 由表3，图1可知，与正常对照组相比，高糖刺激模型组人脐静脉内皮细胞的凋亡率显著升高。经过低强度脉冲超声处理后，人脐静脉内皮细胞的凋亡率显著降低，其中90 mW/cm²脉冲超声处理组效果最好。

2.3 人脐静脉内皮细胞Caspase-3和Caspase-9活性 由表4可知，高糖刺激模型组人脐静脉内皮细胞中Caspase-3和Caspase-9活性均显著高于正常对照组。经过低强度脉冲超声处理后，人脐静脉内皮细胞中Caspase-3和Caspase-9活性显著降低，其中90 mW/cm²脉冲超声处理组人脐静脉内皮细胞中Caspase-3和Caspase-9活性最低。

2.4 人脐静脉内皮细胞中抗氧化生化指标水平 由表5可知，与正常对照组相比，高糖刺激模型组人脐静脉内皮细胞中丙二醛水平显著升高，超氧化物歧化酶、过氧化氢酶及谷胱甘肽过氧化物酶活性则显著降低。经过低强度脉冲超声处理后，人脐静脉内皮细胞中的丙二醛水平明显降低，而超氧化物歧化酶、过氧化氢酶及谷胱甘肽过氧化物酶的活性则显著升高，其中90 mW/cm²低强度脉冲超声组对人脐静脉内皮细胞中抗氧化生化指标的影响最为显著。

2.5 Western blot检测人脐静脉内皮细胞中JNK蛋白的表达由表6，图2可知，与正常对照组相比，高糖刺激模型组人脐静脉内皮细胞的JNK蛋白相对表达水平显著升高。与高糖刺激模型组相比，低强度脉冲超声组人脐静脉内皮细胞中JNK蛋白的相对表达水平则显著降低。

2.6 RT-PCR检测人脐静脉内皮细胞中JNK基因的表达 由表7，图3可知，与正常对照组相比，高糖刺激模型组人脐静脉内皮细胞的JNK基因相对表达水平显著升高。与高糖刺激模型组相比，低强度脉冲超声组人脐静脉内皮细胞中JNK基因表达水平显著降低。

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞学体外对比实验。

1.2 时间及地点 实验于2017年5月至2018年1月在天津市第四医院实验动物中心完成。

1.3 材料 人脐静脉内皮细胞(武汉普诺赛生命科技有限公司，细胞总量约为5×10⁵/瓶)；RPMI-1640培养基(上海博升生物科技有限公司)；胰蛋白酶(美国Sigma公司)；PBS (Hyclone公司)；Trizol试剂盒(Invitrogen公司)；ELISA试剂盒(上海隆垒生物科技有限公司)；抗氧化试剂盒和MTT试剂盒(北京益德益华科技公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 人脐静脉内皮细胞的培养

1.4.2 细胞分组和处理 将人脐静脉内皮细胞随机分为正常对照组、高糖刺激模型组、低强度脉冲超声30，60，90 mW/cm²组。

对高糖刺激模型组和低强度脉冲超声组细胞给予 25 mmol/L葡萄糖刺激处理24 h从而建立高糖模型；正常对照组人脐静脉内皮细胞给予相同体积的PBS处理。低强度脉冲超声组细胞造模后给予30，60，90 mW/cm²低频脉冲处理，每天20 min，连续7 d(每3 d细胞传代1次)。

1.4.3 MTT法检测细胞活力 干预7 d后，将3组细胞接种于96孔板上，每组设3个复孔，放于细胞培养箱中培养，细胞贴壁后继续培养48 h，向各孔中加入20 μL MTT溶液，继续孵育4 h，吸弃孔内培养上清液，每孔加入二甲基亚砜，振荡10 min，使结晶物充分溶解，用酶标仪测定490 nm处的吸光度值。

1.4.4 流式细胞仪检测细胞凋亡情况 干预7 d后，放入培养箱继续培养48 h，PBS洗涤细胞，吹打重悬，使细胞浓度为5×10⁸L^-1，用体积分数为70%冷乙醇固定，-20 ℃放置过夜；PBS洗涤去除乙醇，加入RNaseA试剂，于37 ℃放置30 min；加入碘化丙啶溶液，4 ℃避光染色30 min；流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.4.5 荧光比色法检测Caspase-3和Caspase-9的活性干预7 d后，收集各组人脐静脉内皮细胞，重悬于50 mL冷裂解缓冲液中，于冰上裂解10 min；以15 000×g离心10 min，收集上清液，测定蛋白浓度，加入50 mL特异性的荧光报告底物，通过荧光分光光度计定量检测人脐静脉内皮细胞中Caspase-3和Caspase-9的活性。

1.4.6 分光光度法检测细胞中抗氧化生化指标 干预7 d后，收集各组人脐静脉内皮细胞，严格按照细胞抗氧化生化指标试剂盒的说明测定人脐静脉内皮细胞中丙二醛水平、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶及谷胱甘肽过氧化物酶活性。

1.4.7 Western blot法检测JNK通路相关蛋白表达 干预7 d后，收集各组人脐静脉内皮细胞，加入细胞裂解液，提取蛋白，根据BCA试剂盒说明书测定细胞蛋白浓度，取40 μg蛋白，10%SDS-PAGE凝胶电泳(70 V，30 min；100 V，90 min)；转膜(200 mA，3 h)至PVDF膜；5%脱脂牛奶室温封闭2 h(或4 ℃过夜)；一抗(1∶500)室温孵育2 h(或4 ℃过夜)；TPBS洗涤3次，PBS洗涤1次；加入二抗孵育2 h，PBS洗涤后用化学发光试剂显影，扫描图像并半定量分析，测定JNK蛋白相对表达水平，以β-actin为内参。

1.4.8 RT-PCR法检测JNK通路相关基因表达 干预7 d后，收集各组人脐静脉内皮细胞，以TRIzol试剂进行总RNA提取，根据反转录说明书合成相应的cDNA并进行扩增。总反应体系50 μL(RNase Free dH₂O 20 μL、2×1 Step Buffer 25 μL、PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2 μL 、上下引物各1 μL、样品RNA 1 μL)。扩增条件：94 ℃预变性1 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环。

引物序列见表1，以β-actin基因作为内参，测定JNK通路信号JNK mRNA相对表达水平。

1.5 主要观察指标 ①细胞活力、细胞凋亡率；②细胞内丙二醛水平以及Caspase-3、9活性；③细胞内超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性以及JNK表达水平。

1.6 统计学分析 所有实验数据输入Excel 2010表格中，用生物统计学软件SPSS 16.0进行统计分析；组间比较采用单因素方差(One-way ANOVA)分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

因高血糖诱发的血管内皮细胞功能损伤是糖尿病并发心血管疾病的首要因素^[10-12]。尽管高糖刺激对内皮细胞的作用机制尚无统一的认识和定论，但是近年来研究已经表明高糖对内皮细胞确实具有直接或者间接的损伤作用。高血糖可以直接作用于血管内皮细胞，诱导内皮细胞分泌和释放多种免疫因子，诱发血管内皮的炎症反应^[13-14]；长期高血糖刺激诱发机体发生氧化应激，从而促使内皮细胞产生过多的自由基；堆积的自由基攻击血管内皮细胞并破坏内皮细胞的细胞膜结构，最终引起其功能紊乱和细胞凋亡^[15-16]；此外高糖刺激还会激活细胞凋亡信号转导通路，从而引起血管内皮细胞凋亡^[17-18]。低强度脉冲超声常应用于骨骼疾病治疗，研究表明其对骨性关节炎、骨骼肌萎缩以及骨质疏松均具有较好的治疗效果^[19]。研究显示低强度脉冲超声可以促进多种细胞因子的分泌进而修复肌肉损伤^[20]，通过上调血管内皮生长因子mRNA的表达，促进肌肉组织中血管的再生^[21]。低强度脉冲超声可以通过机械效应、热效应等多种综合效应以促进细胞生长因子的分泌，从而改善细胞的活力以及细胞膜的通透性^[22]。

实验通过低强度脉冲超声处理高糖刺激状态的人脐静脉内皮细胞，以期为糖尿病并发血管疾病寻找新的治疗途径。结果显示与正常对照组比较，高糖刺激可以引起人脐静脉内皮细胞的增殖活力显著下降以及细胞凋亡率明显升高；此外高糖刺激还会诱导人血管内皮细胞的抗氧化能力下降进而引发细胞的氧化应激，严重影响细胞活力和正常功能。在经过低强度脉冲超声处理后，脐静脉内皮细胞活力显著恢复，细胞凋亡率显著下降，细胞的抗氧化状态显著提高。此外结果显示高糖刺激可以诱导脐静脉内皮细胞内JNK/SAPK信号通路活化；用低强度脉冲超声处理后，脐静脉内皮细胞中JNK/SAPK信号转导通路JNK蛋白的表达水平显著下调。JNK信号转导通路与糖尿病、脂质代谢紊乱以及神经性疾病均有较为密切的关系^[23-25]。JNK分子存在于细胞质中，当其上游的信号被激活后通路中的JNK被磷酸化，随之转移到细胞核中激活其下游的c-Jun转录因子，引起细胞凋亡和炎症等异常反应^[26-27]。实验观察到低强度脉冲超声降低高糖刺激细胞中Caspase-3和Casapse-9的活性，二者是JNK信号转导通路下游与细胞凋亡相关的基因^[28]。低强度脉冲超声可以通过抑制与细胞凋亡相关基因的表达，缓解高糖刺激对细胞的损伤和凋亡。实验不足之处是未行JNK信号通路抑制剂的实验研究，目前对于低强度脉冲超声处理可以明显改善高糖刺激下人脐静脉内皮细胞的增殖活力和抗氧化状态，只能得出其可能通过提高细胞的抗氧化能力并调控细胞中的JNK信号转导通路抵抗细胞凋亡，进而抑制高糖诱导人脐静脉内皮细胞损伤，照射强度90 mW/cm²时作用最显著，其具体作用机制需待后继研究进一步明确。

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