C型钠肽预处理小鼠卵母细胞后的胚胎发育能力

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1707

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (17): 2722-2727.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1707

• 干细胞基础实验 basic experiments of stem cells • 上一篇下一篇

C型钠肽预处理小鼠卵母细胞后的胚胎发育能力

张春强¹，张通²，张桂英¹，刘宇¹，王淑英¹，刘改萍¹，张家新³

¹乌兰察布医学高等专科学校基础医学部，内蒙古自治区乌兰察布市012000；²大同大学医学院，山西省大同市 037009；³内蒙古农业大学动物科学学院，内蒙古自治区呼和浩特市 010000

修回日期:2019-02-01 出版日期:2019-06-18 发布日期:2019-06-18
作者简介:张春强，男，1980年生，山东省平邑县人，汉族，2014年内蒙古农业大学毕业，博士，讲师，主要从事人体解剖学与组织胚胎学方面的研究。并列第一作者：张通，男，1989年生，山西省天镇县人，汉族，2018年内蒙古农业大学毕业，博士，讲师，主要从事生殖生物学与生殖技术方面的研究。
基金资助:
内蒙古自治区高等学校科学技术研究项目(NJZY16529)，项目负责人：张春强

Embryonic development of C-type natriuretic peptide-pretreated mouse oocytes

Zhang Chunqiang¹, Zhang Tong², Zhang Guiying¹, Liu Yu¹, Wang Shuying¹, Liu Gaiping¹, Zhang Jiaxin³

¹Department of Basic Medicine, Wulanchabu Medical College, Wulanchabu 012000, Inner Mongolia Autonomous Region, China; ²School of Medicine, Datong University, Datong 037009, Shanxi Province, China; ³College of Animal Science, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010000, Inner Mongolia Autonomous Region, China

Revised:2019-02-01 Online:2019-06-18 Published:2019-06-18
About author:Zhang Chunqiang, MD, Lecturer, Department of Basic Medicine, Wulanchabu Medical College, Wulanchabu 012000, Inner Mongolia Autonomous Region, China. Zhang Tong, MD, Lecturer, School of Medicine, Datong University, Datong 037009, Shanxi Province, China. Zhang Chunqiang and Zhang Tong contributed equally to this work.
Supported by:
the Science and Technology Research Project of Higher Education in Inner Mongolia Autonomous Region, No. NJZY16529 (to ZCQ)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
C型钠肽：为钠尿肽家族成员之一，是由22个氨基酸残基组成的多肽。C型钠肽在小鼠卵泡中天然存在，且可通过结合卵丘颗粒细胞的G蛋白偶联受体NPR2，激活鸟苷酸环化酶，引起环磷酸鸟苷合成的增加，环磷酸鸟苷可通过卵丘细胞与卵母细胞之间的间隙连接转运至卵母细胞内抑制磷酸二酯酶3A的活性，维持卵母细胞内高水平的环磷酸腺苷，从而抑制卵母细胞减数分裂的恢复。
线粒体DNA：是线粒体中的遗传物质，是双链环状的DNA分子。线粒体DNA是核外遗传物质，其遗传方式表现为母系遗传。在卵母细胞成熟和早期胚胎发育的过程中，线粒体不断复制，而线粒体DNA也随之复制，且呈单拷贝状态。因此，可以通过测量线粒体DNA的拷贝数来计算线粒体的拷贝数。

摘要
背景：C型钠肽作为生理抑制剂可抑制小鼠卵母细胞的减数分裂，但其是否对所获得胚胎的发育能力具有促进作用尚不完全明确。
目的：研究C型钠肽预处理对小鼠胚胎质量的影响。
方法：利用C型钠肽预处理小鼠卵母细胞8 h后，再进行体外成熟24 h，将成熟后的卵母细胞体外受精，获得体外胚胎(实验组)，以小鼠卵母细胞常规体外成熟培养24 h后所获得的胚胎为对照组。实验方案中有关动物伦理问题已经得到乌兰察布医学高等专科学校动物实验伦理委员会的批准，伦理批号：WYZLL[2016]1601。
结果与结论：实验组平均囊胚细胞数明显高于对照组平均囊胚细胞数(P < 0.05)；2组的线粒体DNA拷贝数均随胚胎发育逐渐增加，且实验组增长速度较对照组快(P < 0.05)；实验组的活性氧水平显著低于对照组(P < 0.05)，实验组各胚胎时期胚胎细胞的谷胱甘肽水平显著高于对照组(P < 0.05)。提示C型钠肽预处理对小鼠胚胎的发育能力有了明显的提高。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-8369-7891(张春强)

关键词: C型钠肽, 两段培养体系, 小鼠胚胎, 发育能力, 囊胚细胞数, 线粒体DNA拷贝数, 谷胱甘肽, 活性氧

Abstract:

BACKGROUND: C-type natriuretic peptides as physiological inhibitors can inhibit meiosis in mouse oocytes, but whether it promotes the developmental ability of the obtained embryos or not is still unclear.
OBJECTIVE: To study the effect of C-type natriuretic peptide pretreatment on the quality of mouse embryo.
METHODS: Mouse oocytes were pretreated with C-type natriuretic peptide for 8 hours, and then undertook in vitro maturation for 24 hours. The mature oocytes were fertilized in vitro to obtain embryos (experimental group). The embryos obtained from mouse oocytes normally cultured in vitro for 24 hours were used as the control group. The study protocol in the experimental group was approved by the Animal Experimental Ethics Committee of the Wulanchabu Medical College, with the approval No. WYZLL[2016]1601.
RESULTS AND CONCLUSION: The average number of blastocysts in the experimental group was significantly higher than that in the control group (P < 0.05). The number of mitochondrial copies in these two groups increased gradually with the development of mouse embryo, but increased faster in the experimental group than the control group (P < 0.05). The reactive oxygen species level in the experimental group was significantly lower than that in the control group (P < 0.05), and the glutathione level of embryonic cells in the experimental group was significantly higher than that in the control group (P < 0.05). To conclude, C-type natriuretic peptide pretreatment has significantly improved the developmental capacity of mouse embryos.

Key words: C-type natriuretic peptide, two-stage culture system, mouse embryo, developmental ability, number of blastocysts, mitochondrial DNA copy number, glutathione, reactive oxygen species

中图分类号:

R456
R394

张春强，张通，张桂英，刘宇，王淑英，刘改萍，张家新. C型钠肽预处理小鼠卵母细胞后的胚胎发育能力[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(17): 2722-2727.

Zhang Chunqiang, Zhang Tong, Zhang Guiying, Liu Yu, Wang Shuying, Liu Gaiping, Zhang Jiaxin. Embryonic development of C-type natriuretic peptide-pretreated mouse oocytes[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(17): 2722-2727.

图/表（结果） 6

2.1 C型钠肽处理对小鼠卵母细胞生发泡率的影响 随着培养时间的延长，对照组中生发泡率逐渐减少，表明随时间的增加卵母细胞发生生发泡破裂数目增加；而实验组中0-8 h生发泡率变化不大，8-10 h卵母细胞的生发泡率迅速降低，见图1，表明C型钠肽可使卵母细胞的减数分裂停滞8 h。在此基础上实验建立了卵母细胞的成熟体系：先利用C型钠肽预处理小鼠卵母细胞8 h后，再进行体外成熟24 h。

2.2 C型钠肽处理对小鼠体外早期胚胎发育能力的影响 结果表明，利用C型钠肽预处理小鼠卵母细胞8 h后，再进行体外成熟24 h，将成熟后的卵母细胞体外受精，获得胚胎的卵裂率及囊胚率均显著高于对照组(P < 0.05)。此外，实验组囊胚率和囊胚细胞明显高于对照组(P < 0.01)，见表1。且实验组囊胚细胞也显著高于对照组(P < 0.01)，见图2及表1。

2.3 C型钠肽处理对胚胎细胞中线粒体拷贝数的影响 2组中胚胎细胞的线粒体拷贝数随着培养时间的增加，均呈递增趋势，其中，实验组胚胎线粒体拷贝数显著高于对照组(P < 0.05)，且实验组从4-细胞到囊胚期增加较为明显，显著高于4-细胞之间的增长速度，该时期实验组线粒体拷贝数明显高于实验组(P < 0.01)，见图3。

2.4 C型钠肽处理对胚胎细胞中活性氧的影响 2组的活性氧水平从8-细胞开始随培养时间的增加呈递增趋势，囊胚时期实验组活性氧水平显著低于对照组(P < 0.001)，见图4。

2.5 C型钠肽处理对胚胎细胞中谷胱甘肽水平的影响 实验组各胚胎时期胚胎细胞的谷胱甘肽水平显著高于对照组(P < 0.05)，其中在桑葚胚和囊胚期差异有显著性意义 (P < 0.01)，且实验组中胚胎细胞谷胱甘肽水平随着培养时间的增加，均呈递增趋势；对照组中胚胎细胞的谷胱甘肽水平实验组从4-细胞到囊胚期递增趋势不明显，见图5。

参考文献

[1] 赵华,腾雪梅,郭娜,等.人类胚胎线粒体ATP、ROS水平与胚胎形态学分型的关系[J].华中科技大学学报(医学版), 2018,47(3): 314-317.

[2] 邢雅欣,解其贵,杨志勇,等.HCG在小鼠卵母细胞体外受精胚胎发育过程中的作用[J].生殖医学杂志,2018,27(10):1000-1005.

[3] Dinopoulou V, Drakakis P, Kefala S, et al. Effect of recombinant-LH and hCG in the absence of FSH on in vitro maturation (IVM) fertilization and early embryonic development of mouse germinal vesicle (GV)-stage oocytes. Reprod Biol. 2016;16(2):138-146.

[4] 宋姝君.培养箱内温度和pH值对小鼠体外受精及胚胎发育的影响[D].唐山:华北理工大学,2016.

[5] 郝大勇,王兴玲,杨晓娜,等.低氧环境对人类胚胎体外受精发育潜能和临床结局的影响[J].中国优生与遗传杂志, 2014,22(1): 93-94.

[6] 辛志敏,张全乐,孙莹璞,等.早期低氧培养对体外受精-胚胎移植妊娠结局的影响[J].中国计划生育学杂志,2012,20(6):398-400.

[7] Liu J, Van der Elst J, Van den Broecke R, et al. Live offspring by in vitro fertilization of oocytes from cryopreserved primordial mouse follicles after sequential in vivo transplantation and in vitro maturation. Biol Reprod. 2001; 64(1):171-178.

[8] Del Campo MR, Donoso X, Parrish JJ, et al. Selection of follicles, preculture oocyte evaluation, and duration of culture for in vitro maturation of equine oocytes. Theriogenology. 1995;43(7):1141-1153.

[9] 张春强, 欧阳效晴,张通,等.C型钠肽预处理对牛卵母细胞体外成熟的影响[J].畜牧兽医学报,2014,45(9):1424-1431.

[10] Zhang M, Su YQ, Sugiura K, et al. Granulosa cell ligand NPPC and its receptor NPR2 maintain meiotic arrest in mouse oocytes. Science. 2010;330(6002):366-369.

[11] Hiradate Y, Hoshino Y, Tanemura K, et al. C-type natriuretic peptide inhibits porcine oocyte meiotic resumption. Zygote. 2014;22(3):372-377.

[12] Zhong Y, Lin J, Liu X, et al. C-Type natriuretic peptide maintains domestic cat oocytes in meiotic arrest. Reprod Fertil Dev. 2015. doi: 10.1071/RD14425.

[13] Zhang J, Wei Q, Cai J, et al. Effect of C-Type Natriuretic Peptide on Maturation and Developmental Competence of Goat Oocytes Matured In Vitro. PLoS One. 2015;10(7): e0132318.

[14] Sugimura S, Yamanouchi T, Palmerini MG, et al. Effect of pre-in vitro maturation with cAMP modulators on the acquisition of oocyte developmental competence in cattle. J Reprod Dev. 2018;64(3):233-241.

[15] 周永娜.应用mtDNA和Y染色体基因片段解析梅花鹿种公鹿的母系及父系类型[D].北京:中国农业科学院,2018.

[16] 周秀敏,杨永江,毕英杰,等.三个地方猪种线粒体COXⅠ基因SNPs筛选及序列分析[J].现代畜牧兽医,2017(7):10-15.

[17] 马冬雪.小鼠早期胚胎内部活性氧水平与胚胎凋亡通路关系的研究[D].延吉:延边大学,2017.

[18] 胡艳红,张凡,张楚焌,等.程序性细胞死亡形式研究进展[J]. 辽宁中医药大学学报,2018,20(12):85-89.

[19] 郭长丽.小鼠体内外胚胎MET时期抗氧化酶表达的研究[D]. 延吉:延边大学,2017.

[20] 梁琳,陈秀娟.观察体外受精中卵泡液的抗氧化能力及其对卵母细胞质量和胚胎发育的影响[J].生殖医学杂志, 2015,24(7): 532-537.

[21] Sudoh T, Minamino N, Kangawa K, et al. C-type natriuretic peptide (CNP): a new member of natriuretic peptide family identified in porcine brain. Biochem Biophys Res Commun. 1990;168(2):863-870.

[22] Santiquet NW, Greene AF, Becker J, et al. A pre-in vitro maturation medium containing cumulus oocyte complex ligand-receptor signaling molecules maintains meiotic arrest, supports the cumulus oocyte complex and improves oocyte developmental competence. Mol Hum Reprod. 2017;23(9): 594-606.

[23] Xi G, An L, Jia Z, et al. Natriuretic peptide receptor 2 (NPR2) localized in bovine oocyte underlies a unique mechanism for C-type natriuretic peptide (CNP)-induced meiotic arrest. Theriogenology. 2018;106:198-209.

[24] Koczor CA, Jiao Z, Fields E, et al. AZT-induced mitochondrial toxicity: an epigenetic paradigm for dysregulation of gene expression through mitochondrial oxidative stress. Physiol Genomics. 2015;47(10):447-454.

[25] Zeng HT, Ren Z, Yeung WS, et al. Low mitochondrial DNA and ATP contents contribute to the absence of birefringent spindle imaged with PolScope in in vitro matured human oocytes. Hum Reprod. 2007;22(6):1681-1686.

[26] May-Panloup P, Chretien MF, Malthiery Y, et al. Mitochondrial DNA in the oocyte and the developing embryo. Curr Top Dev Biol. 2007;77:51-83.

[27] 韦启鹏.活性氧、FOXO3a与高浓度葡萄糖环下小鼠早期胚胎发育阻滞的相关性研究[D].郑州:郑州大学,2014.

[28] Li L, Lu X, Dean J. The maternal to zygotic transition in mammals. Mol Aspects Med. 2013;34(5):919-938.

[29] Li XY, Harrison MM, Villalta JE, et al. Establishment of regions of genomic activity during the Drosophila maternal to zygotic transition. Elife. 2014;3:e03737.

[30] 井洋洋,方南洙,张宝修,等.活性氧对鼠早期胚胎抗氧化酶基因表达的影响[J]. 中国兽医学报,2017,37(2):335-344.

[31] de Matos DG, Furnus CC. The importance of having high glutathione (GSH) level after bovine in vitro maturation on embryo development effect of beta-mercaptoethanol, cysteine and cystine. Theriogenology. 2000;53(3):761-771.

引言

体外胚胎生产是辅助生殖过程的重要环节，且体外胚胎的质量对辅助生殖成功至关重要。长期以来，学者主要通过两大途径来提高体外胚胎的质量，一是通过改善体外胚胎培养的条件，包括能量、生长因子、pH值和培养环境中气体的含量^[1-6]、温度等；二是认为卵母细胞的成熟质量是影响体外胚胎质量的主要原因^[7-8]，因此有许多研究者在探索卵母细胞成熟的机制，以求获得提高卵母细胞体外成熟能力的途经^[9]。

抑制核减数分裂恢复是一种常用的促进卵母细胞核与质同步成熟的方法。近年来，C型钠肽已被确定为一种生理性减数分裂抑制剂，可延迟包括小鼠、猪、猫、山羊和牛等物种卵母细胞减数分裂的恢复^[9-13]。既往研究表明，排卵前卵巢卵泡内高水平的环磷酸腺苷能够维持卵母细胞减数分裂的停滞^[14]。以小鼠为模式动物的研究发现卵泡壁层颗粒细胞生理性旁分泌的C型钠肽，可通过结合卵丘颗粒细胞的G蛋白偶联受体NPR2(Natriuretic peptide receptor 2)，该受体主要在卵丘细胞上表达，能激活鸟苷酸环化酶，引起环磷酸鸟苷合成的增加，环磷酸鸟苷可通过卵丘细胞与卵母细胞之间的间隙连接转运至卵母细胞内抑制磷酸二酯酶3A的活性，维持卵母细胞内高水平的环磷酸腺苷，从而抑制卵母细胞减数分裂的恢复^[10]。利用C型钠肽构建一种新型卵母细胞体外成熟方法——模拟生理条件卵母细胞成熟的卵泡生理内环境的成熟体系，可提供一种体外模拟促进卵母细胞成熟的新思路。

线粒体是真核生物中惟一含有DNA的细胞器，也是细胞产生ATP的主要场所。线粒体DNA基本为母系遗传，可在胚胎发育过程中保持复制^[15]，而MT-COX1基因(细胞色素c氧化酶亚基I基因)为线粒体DNA编码。在卵母细胞成熟和早期胚胎发育的过程中，线粒体不断复制，而MT-COX1也随之复制，且呈单拷贝状态。因此，研究者可以通过测量MT-COX1基因的拷贝数来计算线粒体的拷贝数^[16]。活性氧是卵母细胞和胚胎发育过程中有氧呼吸的产物，其含量也是影响卵母细胞成熟和决定胚胎发育的重要因素之一^[17]。而谷胱甘肽作为重要的抗氧化剂及自由基清除剂，能顾有效清除胚胎中的活性氧，达到促进胚胎发育的目的^[18]。目前，人们大多利用活性氧-谷胱甘肽水平来判断卵母细胞和胚胎发育的质量^[19-20]。

作者拟建立小鼠卵母细胞体外成熟的两段培养体系，并将成熟的卵母细胞进行体外受精，对所获得胚胎质量进行检测，以评估该体系所获得胚胎的发育能力，为C型钠肽在辅助生殖中的应用提供依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2017年6至12月在内蒙古农业大学动物遗传育种与繁殖重点实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 动物 实验动物为雌性小鼠30只、雄性小鼠10只，鼠龄4-8周龄，体质量25-30 g，由内蒙古大学动物医学院实验中心提供，动物许可证号：SCXK(蒙)2016-0001。动物于明暗周期条件下饲养(8：00-20：00)，自由进食进水。动物实验均按照国际实验动物科学理事会的指导方针执行，乌兰察布医学高等专科学校动物实验伦理委员会批准进行此次实验，伦理批号：WYZLL[2016]1601。

1.3.2 实验用主要试剂及仪器 胎牛血清(澳洲血源)购自美国Gibco公司，注射用人绒毛膜促性腺激素、孕马血清促性腺激素购自瑞士Merck Serono公司，活性氧试剂盒、谷胱甘肽试剂盒以及氧化型谷胱甘肽试剂盒购自碧云天生物技术公司，基因组DNA试剂盒购自天根公司，Axio Imager A2荧光显微镜购自德国Carl Zeiss公司，Mx3000P实时PCR仪购自Agilent公司，SMZ1500型体视显微镜购自尼康公司，CO₂培养箱购自Eppendorf公司。

1.4 方法

1.4.1 卵母细胞的采集与体外成熟 选取常规饲养雌性小鼠30只，将小鼠随机分为实验组及对照，各15只。颈椎脱臼处死小鼠，取出卵巢，放入盛有冲卵液[基础液Ⅰ+体积分数5%胎牛血清；基础液Ⅰ：M 199+NaHCO₃(2.2 g/L) +青、链霉素(各100 000 IU/L)]的平底玻璃皿中，用解剖针和手术刀划破卵泡，使卵母细胞充分溢出。在体视显微镜下挑选形状规则、胞质均匀、色泽一致、卵丘细胞层包裹紧密完整的卵丘卵母细胞复合体。每组各挑选300枚用于后续实验。

实验组：把卵母细胞均匀移入盛有50 μL抑制液(TCM199+1%聚乙烯醇+10%无激素牛血清+0.29 mmol/L丙酮酸钠+50 μg/L C型钠肽)的液滴中，覆盖石蜡油，置于37 ℃体积分数为5%O₂+5%CO₂+90%N₂饱和湿度的CO₂培养箱中培养10 h，以(TCM199+1%聚乙烯醇+10%无激素牛血清+0.29 mmol/L丙酮酸钠)培养为对照组1。分别检测生发泡率。

将在抑制液中处理8 h的卵母细胞移入常规成熟液(TCM199+5%胎牛血清150 IU/L注射用人绒毛膜促性腺激素+5%人血清白蛋白+0.1mmol/L表皮生长因子+0.5 mg/L促卵泡刺激素+0.1 mg/L促黄体生成素+0.5 mg/L雌二醇+1%半胱胺)中继续培养24 h，卵母细胞均匀移入盛有50 μL常规成熟液的液滴中，覆盖石蜡油500 μL，置于37 ℃体积分数为5%O₂+5%CO₂+90%N₂饱和湿度的CO₂培养箱中培养培养24 h。

1.4.2 小鼠卵母细胞的体外受精及体外培养 取至少3 d未交配的健康小鼠附睾尾部及邻近输精管，将其剪成0.5-1.0 cm的小段并置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中孵育约40 min，然后将上游液中的精液转移到1.5 mL的离心管中，于室温1 300 r/min离心4 min，弃上清液，再次加入1 mL受精液(NaCl 65 g/L+KCl 3 g/L+NaH₂PO₄ 0.1 g/L+MgCl•6H₂O 1.1 g/L+CaCl₂•2H₂O 3.3 g/L+葡萄糖25.20 g/L+1%PS)离心洗涤，再次弃掉上清液，留约200 µL精液沉淀，轻轻吹打混匀，将精液密度调整为2×10⁸-5×10⁸L^-1。将精子和卵母细胞在受精液中共孵育6 h后移出，每组随机挑选200枚。

1.4.3 囊胚细胞计数 每组随机选取10枚囊胚，将囊胚在40 g/L多聚甲醛中室温固定15 min。然后将固定的囊胚在1 mg/L的4'，6-二脒基-2-苯基吲哚溶液中温育10 min后，在含有1 g/L聚乙烯醇的PBS中洗涤3次，并装载至含有抗淬灭剂的载玻片上。使用Axio Imager A2荧光显微镜检测囊胚细胞总数(激发波长365 nm，检测445 nm)，结果取平均值。

1.4.4 线粒体拷贝数的检测 通过实时荧光定量PCR技术检测样品中MT-COX1基因的拷贝数相对值来反映线粒体的拷贝数变化规律。采用基因组DNA试剂盒提取小鼠卵巢组织基因组DNA，将其稀释成30 mg/L浓度作为PCR扩增的模板。由上海Generay Biotech公司设计并合成了COX1基因特异性引物序列，引物序为：F：5'-CAG GAA CGG GAT GAA CAG-3'；R：5'-ATC AAA CAA ATA GCG GGG-3'，PCR产物长度为195 bp。参考文献[9]的方法制作标准品。

分别收集2组的2-细胞、4-细胞、8-细胞、16-细胞、桑葚胚和囊胚，每组样品收集10枚，首先用pH 2.5的PBS去除透明带，然后将样品置于PCR管中，加入10 μL裂解液(裂解液体系：50 mmol/L 1× Tris-HCl，200 mg/kg蛋白酶-K，0.1 mmol/L EDTA，0.5% Tween-20)，将样品置于55 ℃水浴中裂解2.0-3.0 h，然后置于沸水中10 min使蛋白酶失活，经1%的琼脂糖凝胶电泳检测均能获得DNA产物。

使用实时PCR仪将DNA产物和不同梯度浓度的标准品(梯度稀释为10倍)后同时进行实时定量PCR，反应体系为20 μL∶1 μL DNA产物，10 μL 2×Super Real SYBR-Green Mix，引物各1 μL，ddH₂O补足体系。反应条件为：95 ℃预变性15 min，95 ℃ 10 s变性，56 ℃ 15 s退火，72 ℃ 40 s延伸，40个循环。将获得的Ct值代入回归方程(y=-3.253 Lg(x)+37.21)即可求出线粒体DNA拷贝数。

1.4.5 单个细胞活性氧水平的检测 收集2组的2-细胞、4-细胞、8-细胞、16-细胞、桑葚胚和囊胚各10枚，并去除透明带，转入200 µL工作液(DCFH-DA，10 mmol/L)中，39 ℃条件下平衡20 min，然后，用保存液洗涤3次，移入每孔含有100 μL保存液的黑色平底酶标板中采用酶标仪(ThermoFisher)散射光：530 nm，激发光：490 nm，每孔的活性氧测定值除以胚胎细胞数即为单个胚胎细胞的活性氧水平。

1.4.6 单个细胞谷胱甘肽水平的检测 分别收集2组的2-细胞、4-细胞、8-细胞、16-细胞、桑葚胚和囊胚，每组收集30个样品置入0.2 mL离心管中，加入20 μL超纯水并反复吹打混匀，按照制造商说明书的程序，将氧化型谷胱甘肽储备液进行梯度稀释，用酶标仪测定412处吸光度值，并绘制标准曲线。将样品加入到96孔板中，然后加入150 μL的检测液，在室温下平衡5 min后，各加入50 μL NADPH (0.16 g/L)并充分混匀。立即将样品和标准曲线一起置于酶标仪中测定，并设置2个空白对照，重复进行3次实验。每孔的谷胱甘肽含量除以细胞数即为样品中单个细胞的谷胱甘肽含量。

1.5 主要观察指标 囊胚细胞数采用免疫荧光染色后计数，线粒体DNA拷贝数采用RT-PCR测定获得，活性氧水平和谷胱甘肽含量采用试剂盒处理酶标仪检测。

1.6 统计学分析 数据采用使用SPSS 13.0软件(美国，芝加哥SPSS公司)进行分析，数据以x(_)±s表示。百分数采用χ²(卡方检验)进行分析。囊胚细胞数、线粒体DNA拷贝数、活性氧水平、谷胱甘肽含量采用单因素方差分析。多重比较采用最小显著性差异法比较，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

自C型钠肽首次在猪的大脑中被分离提纯以来^[21]，已广泛应用于调控动物繁殖过程中^[22-23]。研究发现C型钠肽体外处理小鼠卵丘卵母细胞复合体后，卵母细胞内可维持较高水平的环磷酸鸟苷/环磷酸腺苷水平，进而抑制核减数分裂恢复^[10]。此次实验使用50 μg/L C型钠肽处理小鼠卵母细胞可使卵母细胞的减数分裂停滞8 h，这一结果印证了Zhang等^[10]的结论，充分表明了作者所在团队建立的培养体系可用于后续的研究。C型钠肽预处理小鼠卵母细胞8 h后，再进行体外成熟24 h后获得的成熟卵母细胞进行体外受精，发现该体系得到的胚胎卵裂率、囊胚率均高于常规成熟方法(P < 0.05)，这也与Hiradate等^[11]的结果相同。值得注意的是，此次实验所获得的囊胚率显著高于实验组(P < 0.01)。推测C型钠肽处理后的卵母细胞受精后突破2-细胞发育阻滞期的能力可能增强^[24]，从而导致胚胎进入囊胚期能力增强，通过此次实验所获得的囊胚细胞数明显高于实验组，提示胚胎的质量和发育能力也得到了较大的改善。

在附植前胚胎发育过程中，线粒体的数量只决定于卵母细胞成熟过程中的积累，线粒体DNA拷贝数对卵母细胞的正常受精和早期胚胎发育至关重要^[25]。此次实验中小鼠胚胎线粒体DNA拷贝数在胚胎发育各时期均显著高于对照组(P < 0.01)，这可能与卵母细胞中线粒体DNA的累积导致胚胎线粒体DNA拷贝数复制效率的提高有关。胚胎线粒体DNA拷贝数含量的增加意味着线粒体数目的增加，而卵母细胞中线粒体数目的多少与ATP的产量直接相关^[26]。因此，成熟卵母细胞中线粒体DNA拷贝数的高低直接反应了卵母细胞受精能力以及后续胚胎发育潜能。

小鼠卵母细胞和早期胚胎正常发育过程中，活性氧水平处于动态平衡状态，过量的活性氧容易造成DNA、蛋白质的损伤。而且，在卵母细胞受精和胚胎发育的2-细胞阶段，大量的活性氧可导致胚胎发育受阻^[27]。小鼠的合子基因组激活起始于2-细胞期即母型-合子型时期^[28]，这一时期胚胎发育受自身mRNA控制^[29]，此阶段胚胎很容易氧化应激胁迫，引起合子基因组激活激活受阻，中断基因组表达，引起胚胎发育阻滞，甚至退化、凋亡^[30]。此次实验发现，2组的活性氧水平均随胚胎的发育逐渐增加，但差异无显著性意义(P > 0.05)，这与Koczor等^[24]的研究结果一致。可能是由于体外培养过程中环境中的氧分压过高导致。而此次实验中实验组胚胎的卵裂率及囊胚率均高于常规成熟方法(P < 0.05)，这可能也与抗氧化酶的含量增加有关。研究发现，胚胎发育过程中过量的活性氧会导致许多潜在的并发症，包括胚胎非整倍体、基因组印记紊乱、表观修饰异常，然而，胚胎发育过程中谷胱甘肽的积累可以受精后胚胎免受或降低氧化损伤^[31]。作者测量的实验组的谷胱甘肽水平显著高于对照组(P < 0.05)，实验组中胚胎细胞谷胱甘肽水平随着培养时间的增加，均呈递增趋势；对照组中胚胎细胞的谷胱甘肽水平从4-细胞到囊胚期递增趋势不明显。由此推测在胚胎发育中谷胱甘肽可能发挥了抗氧化剂的作用，从而保证了胚胎的后续发育。这一结果也验证了de Matos等^[31]的结论。同时，线粒体产生的ATP也对谷胱甘肽执行活性氧的清除作用提供了能量支持。

综上，C型钠肽处理小鼠卵母细胞显著提高了卵母细胞的发育能力，同时提高了细胞质中的线粒体的含量和细胞质中的谷胱甘肽水平，达到了有效清除胚胎发育过程中所产生的活性氧，有效地提高了受精后胚胎的发育能力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

C型钠肽预处理小鼠卵母细胞后的胚胎发育能力

Embryonic development of C-type natriuretic peptide-pretreated mouse oocytes

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 6

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	朱蕊, 曾庆, 黄国志. 铁死亡与脑卒中[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3734-3739.
[2]	谢文杰, 周刚, 谢金美, 刘姣, 李鹏飞, 扬帆, 崔迪. 一次性力竭运动模型大鼠心肌氧化损伤的作用途径[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 247-252.
[3]	白振军, 刘通, 王自润, 张慧宇, 徐鹏. “腰三针”干预腰多裂肌损伤大鼠多种氧化应激因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(32): 5145-5150.
[4]	赵一朗, 刘滔, 杨惠林, 何帆. 细胞外基质增强人脐带干细胞的抗氧化能力[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(25): 3953-3958.
[5]	钟萍, 崔兴 . 黄芩苷调控自噬保护肠黏膜屏障干预肠道急性移植物抗宿主病 [J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(25): 4028-4032.
[6]	龙惠东1，2，龙玲莉1，麦庆云1，赵雯1，李宇彬1. 还原型谷胱甘肽和乌司他丁对冻融人类卵巢组织异种移植的保护作用[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(7): 1084-1089.
[7]	雷雨，刘蓉安，曾帆. 脂肪间充质干细胞移植减轻大鼠肾缺血再灌注损伤的机制[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(5): 749-755.
[8]	李博鹏，陈树春，唐勇，任路平. α-硫辛酸改善初诊2型糖尿病患者循环内皮祖细胞水平[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(5): 803-808.
[9]	皇甫志敏，徐倩，王晓，王恩平，冯玥，曾娟，朱锐，赵春玲. 红景天甙干预可改善慢性间断性缺氧模型小鼠的肺损伤[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(31): 5036-5040.
[10]	刘文华，梁锦峰，邓少杰. 白藜芦醇调节氧化应激减少磨损颗粒诱导巨噬细胞肿瘤坏死因子α的表达[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(26): 4115-4120.
[11]	黄超，黄庆华，尤荻，郭文来，瞿文瑞，朱哲，李锐. 槲皮素在创伤性脑损伤治疗中潜在分子机制和临床应用的可行性[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(23): 3760-3766.
[12]	徐庆，房好林，刘阳，张存鑫，田宝方. 原花青素可抑制高糖诱导兔髓核细胞的凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(21): 3426-3431.
[13]	袁大江，彭吾训，张飞，王贞文，郑应刚. 低浓度过氧化氢预处理增强骨髓间充质干细胞抗氧化应激损伤的能力[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(13): 1982-1988.
[14]	毋江波，谢安青，张勇 . 有氧运动通过鸢尾素改善慢性心力衰竭的机制[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(11): 1781-1787.
[15]	魏含清，裴轶劲，王丹丹，蒋杨，王春，李洪梅. 持续低氧对小鼠胚胎成纤维细胞增殖及饲养层制备的影响[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(9): 1450-1456.