低浓度过氧化氢预处理增强骨髓间充质干细胞抗氧化应激损伤的能力

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1678

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (13): 1982-1988.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1678

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低浓度过氧化氢预处理增强骨髓间充质干细胞抗氧化应激损伤的能力

袁大江，彭吾训，张飞，王贞文，郑应刚

贵州医科大学，贵州省贵阳市 550004

修回日期:2018-12-19 出版日期:2019-05-08 发布日期:2019-05-08
通讯作者: 彭吾训，博士，教授，主任医师，贵州医科大学，贵州省贵阳市 550004
作者简介:袁大江，男，山东省阳谷县人，汉族，贵州医科大学在读硕士，主要从事股骨头坏死方面的研究。
基金资助:
贵州省科技厅贵州医科大学联合基金课题(黔科合LH字[2017]7197号)，项目参与人：彭吾训；贵州省卫计委基金项目(gzwjkj 2016-1-001)，项目参与人：彭吾训；贵阳市科技局基金项目(GY2016-3)，项目负责人：彭吾训

Preincubation with low-concentration hydrogen peroxide enhances anti-oxidative stress ability of bone marrow mesenchymal stem cells

Yuan Dajiang, Peng Wuxun, Zhang Fei, Wang Zhenwen, Zheng Yinggang

Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China

Revised:2018-12-19 Online:2019-05-08 Published:2019-05-08
Contact: Peng Wuxun, MD, Professor, Chief physician, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
About author:Yuan Dajiang, Master candidate, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
Supported by:
Guizhou Provincial Department of Technology & Guizhou Medical University Joint Fund Project, No. LH[2017]7197 (to PWX); Guizhou Province Health and Welfare Commission Fund Project, No. gzwjkj 2016-1-001 (to PWX); Guiyang Science and Technology Bureau Fund Project, No. GY2016-3 (to PWX)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
氧化应激：是指体内活性氧的生成增加和/或清除能力降低，氧化与抗氧化防御系统的失衡，导致细胞内产生过量的活性氧，过量的活性氧会改变细胞内的氧化还原状态，过氧化损伤DNA、蛋白质、脂质等生物大分子，改变完整的细胞结构和功能，活性氧损害线粒体，导致线粒体电子传递链功能障碍和凋亡诱导因子释放，触发多种信号转导途径，最终诱导细胞凋亡。
预处理：是指生物体在低于生理阈值的应激刺激下提高其自身稳态性或抗应激刺激能力以求生存的处理。目前，常用的预处理手段包括物理、化学、药物以及基因修饰等手段，使细胞处于最佳备用状态，以适应体外刺激和抵抗移植后所面临的严重致死性缺血缺氧、氧化应激损伤。过氧化氢预处理是指1次或多次短暂、非致死性低浓度过氧化氢预处理后，细胞获得了对更严重甚至致死性氧化应激耐受性的过程。

摘要
背景：骨髓间充质干细胞移植促进骨坏死区血管再生和骨重建，取得了一定疗效，但是骨坏死区氧化应激微环境极大地限制了移植后骨髓间充质干细胞的存活、增殖和成骨分化能力，降低了对骨坏死区的修复作用。
目的：探讨低浓度过氧化氢预处理对骨髓间充质干细胞抗氧化应激损伤的影响。
方法：取生长良好的第3代兔骨髓间充质干细胞，实验分为3组：空白对照组，高浓度过氧化氢持续处理组(500 µmol/L过氧化氢处理24 h)，低浓度过氧化氢预处理组(50 µmol/L过氧化氢预处理8 h，恢复12 h，再用500 µmol/L过氧化氢处理24 h)。根据实验分组条件进行过氧化氢处理，采用DCFH-DA荧光染料检测细胞活性氧水平，ELISA法检测各组细胞超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活力，比色法检测各组细胞丙二醛水平，JC-1法检测细胞线粒体膜电位，CCK-8法检测细胞活力，流式细胞仪和TUNEL/DAPI双染法检测细胞凋亡。
结果与结论：①与高浓度过氧化氢持续处理组相比，低浓度过氧化氢预处理组可有效减少骨髓间充质干细胞内活性氧产生(P < 0.05)；同时，低浓度过氧化氢预处理组超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活力明显升高(P < 0.05)，丙二醛水平明显降低(P < 0.05)，线粒体膜电位损伤减轻(P < 0.05)，细胞存活率提高(P < 0.05)，细胞凋亡减少(P < 0.05)；②结果表明低浓度过氧化氢预处理可显著增强骨髓间充质干细胞抗氧化应激损伤能力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-1042-5013(袁大江)

关键词: 骨髓间充质干细胞, 氧化应激, 过氧化氢, 预处理, 活性氧, 线粒体膜电位, 细胞凋亡

Abstract:

BACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cell transplantation promotes vascular regeneration and bone remodeling in osteonecrosis area, and has achieved certain effects. However, the oxidative stress microenvironment in osteonecrosis area greatly limits the survival, proliferation and osteogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells after transplantation, reducing the repairing effect on the osteonecrosis area.
OBJECTIVE: To investigate the effect of low-concentration hydrogen peroxide (H₂O₂) pretreatment on the anti-oxidative stress injury to bone marrow mesenchymal stem cells.
METHODS: The third generation of well-growing bone marrow mesenchymal stem cells were divided into three groups: blank control group, high-concentration H₂O₂ treatment group (500 µmol/L H₂O₂ treatment for 24 hours), low-concentration H₂O₂ pretreatment group (50 µmol/L H₂O₂ pretreatment for 8 hours, recovery for 12 hours, and then 500 µmol/L H₂O₂ treatment for 24 hours). Cellular level of reactive oxygen species was detected by DCFH-DA fluorescent dye; superoxide dismutase and catalase activities were detected by ELISA; malondialdehyde content was detected by colorimetry; mitochondrial membrane potential was detected by JC-1; cell viability was detected by cell counting kit-8; and cell apoptosis was detected by flow cytometry and TUNEL/DAPI double staining.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the high-concentration H₂O₂ treatment group, the low-concentration H₂O₂ pretreatment group could effectively reduce the production of reactive oxygen species in the bone marrow mesenchymal stem cells (P < 0.05); meanwhile, the low-concentration H₂O₂ pretreatment group showed significantly increased superoxide dismutase and catalase activities (P < 0.05), decreased malondialdehyde content (P < 0.05), reduced mitochondrial membrane potential damage (P< 0.05), increased cell survival rate (P < 0.05) and decreased cell apoptosis (P < 0.05). These findings indicate that low-concentration H₂O₂ pretreatment could significantly enhance the ability of bone marrow mesenchymal stem cells to resist oxidative stress injury.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Hydrogen Peroxide, Membrane Potential, Mitochondrial, Apoptosis, Tissue Engineering

中图分类号:

袁大江，彭吾训，张飞，王贞文，郑应刚. 低浓度过氧化氢预处理增强骨髓间充质干细胞抗氧化应激损伤的能力[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(13): 1982-1988.

Yuan Dajiang, Peng Wuxun, Zhang Fei, Wang Zhenwen, Zheng Yinggang. Preincubation with low-concentration hydrogen peroxide enhances anti-oxidative stress ability of bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(13): 1982-1988.

图/表（结果） 7

2.1 细胞形态学变化 倒置显微镜下观察细胞形态，空白对照组细胞生长状态良好，鱼群状生长，细胞分布均匀，见图1A；高浓度过氧化氢持续处理组细胞活力明显下降，细胞形态发生显著变化，失去完整性结构，部分细胞死亡，漂浮在正常细胞层上面，见图1B；低浓度过氧化氢预处理组细胞形态基本完整，大部分细胞依然存在正常形态，见图1C。

2.2 骨髓间充质干细胞内活性氧水平 骨髓间充质干细胞经500 µmol/L过氧化氢处理24 h后，能够结合更多的DCFH-DA探针，在525 nm处有更高的吸光强度，反应出强烈绿色荧光，与空白对照组相比差异有显著性意义，提示经高浓度过氧化氢处理后，骨髓间充质干细胞内处于一个活性氧积累大于清除的代谢失衡状态。低浓度过氧化氢预处理组荧光反应与高浓度过氧化氢持续处理组相比明显降低，氧化应激现象得到明显改善，差异有显著性意义(P < 0.01)，见图2。

2.3 骨髓间充质干细胞内超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活力及丙二醛水平 如图3所示，高浓度过氧化氢持续处理组细胞中超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性分别为(20.06±1.53) U/mg，(9.63±0.55) U/mg，明显低于空白对照组(39.60±3.13) U/mg，(22.73±1.23) U/mg (P < 0.01)；低浓度过氧化氢预处理组细胞中超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活力升高，分别为(34.11±1.72) U/mg，(17.59± 0.68) U/mg，高于高浓度过氧化氢持续处理组(P < 0.05)，说明低浓度过氧化氢预处理可显著升高超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活力。丙二醛是脂质过氧化的主要生成物之一，在生物体内可引起蛋白质、核酸等大分子的聚合反应，也可影响线粒体内关键酶活性，故而丙二醛是研究氧化损伤常用的重要指标之一。高浓度过氧化氢持续处理组细胞中丙二醛水平为(4.03±0.41) μmol/g，明显高于空白对照组(1.68±0.21) μmol/g (P < 0.01)，经低浓度过氧化氢预处理后，细胞中丙二醛水平明显降低，为(2.83±0.28) μmol/g，与高浓度过氧化氢持续处理组相比差异有显著性意义(P < 0.05)，说明低浓度过氧化氢预处理可明显降低丙二醛产生。

2.4 骨髓间充质干细胞线粒体膜电位分析 线粒体功能紊乱被认为是氧化应激损伤的主要机制之一，因此实验选用线粒体膜电位这一检测指标来间接反映线粒体的功能。正常细胞表达高红、高绿荧光。然而，当细胞暴露于高浓度过氧化氢(500 µmol/L)24 h时，Δψm快速去极化，绿色荧光增加和伴随红色荧光消失，见图4A。高浓度过氧化氢持续处理组红绿比为(36.34±5.62)%，低浓度过氧化氢预处理组红绿比为(66.52±4.71)%，见图4B，低浓度过氧化氢预处理组红绿比明显升高，提示预处理可能通过抑制线粒体损伤途径来实现抗细胞凋亡作用。

2.5 骨髓间充质干细胞存活率分析 经500 µmol/L过氧化氢处理24 h，高浓度过氧化氢持续处理组细胞在450 nm处的吸光度明显降低，细胞增殖活力只有空白对照组的(52.41±3.26)%，差异有显著性意义(P < 0.01)。低浓度过氧化氢预处理组吸光度值与高浓度过氧化氢持续处理组相比明显升高，为(77.08±4.88)%，细胞生长抑制现象明显改善，两组相比差异有显著性意义(P < 0.01)，见图5。

2.6 Annexin-V/PI双染分析细胞凋亡率 500 µmol/L过氧化氢处理24 h后，细胞凋亡率(39.67±3.30)%与空白对照组相比明显增加，差异有显著性意义(P < 0.01)，而低浓度过氧化氢预处理可明显减少细胞凋亡率(24.26±2.20)%，低浓度过氧化氢预处理组与高浓度过氧化氢持续处理组相比，差异有显著性意义(P < 0.01)，见图6。

2.7 TUNEL-DAPI双染分析细胞凋亡率 采用TUNEL-DAPI双染法检测细胞核固缩和DNA断裂情况来反映低浓度过氧化氢预处理减少骨髓间充质干细胞凋亡的程度。空白对照组几乎不产生红色荧光，经500 µmol/L过氧化氢处理的骨髓间充质干细胞呈现较多红色荧光，细胞中出现DNA的碎片，凋亡率为(25.72±2.33)%，低浓度过氧化氢预处理组红色荧光明显减少，凋亡率为(12.67± 0.72)%。结果表明低浓度过氧化氢预处理能减少DNA碎片、凋亡小体的产生，有效抑制细胞凋亡，见图7。

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点 于2018年1至8月在贵州医科大学临床研究中心完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 4-6周龄SPF级雄性新西兰白兔10只，体质量1.0-2.0 kg，由贵州医科大学动物研究中心提供。

1.3.2 实验试剂及仪器 过氧化氢(中国成都金山化学试剂有限公司)；CCK-8溶液(日本同仁化学研究所)；Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒(美国BD San Diego公司)；细胞内活性氧检测试剂盒(美国Sigma公司)；JC-1细胞线粒体膜电位检测试剂盒、TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(中国南京凯基生物有限公司)；DAPI染色剂、BCA蛋白测定试剂盒(中国北京索莱宝生物科技有限公司)；超氧化物歧化酶检测试剂盒、过氧化氢酶检测试剂盒(中国南京建成生物研究所)；丙二醛检测试剂盒(中国上海碧云天生物技术有限公司)。台式高速冷冻离心机(美国Beckman公司，Allegra 64R Cebtrifuge)；流式细胞仪(美国Beckman公司，Navios)；多功能酶标仪(美国Biotech，Synergy)；激光共聚焦显微镜(德国ZEISS公司，LSM710)。

1.4 实验方法

1.4.1 兔骨髓间充质干细胞的分离和培养 取4-6周龄新西兰大白兔，在无菌条件下抽取1.0-2.0 mL骨髓液，采用密度梯度离心法分离细胞后，置于培养箱中培养。待原代细胞汇合80%-90%时，按1∶3传代，细胞传至第3代时进行实验处理。

1.4.2 过氧化氢处理骨髓间充质干细胞 取第3代骨髓间充质干细胞，消化、离心，调整细胞密度2×10⁴/孔，均匀接种于6孔板，待细胞汇合度达到80%-90%后进行过氧化氢处理，将细胞随机分为3组：①空白对照组，常规培养基持续培养；②高浓度过氧化氢持续处理组：采用500 µmol/L过氧化氢持续处理骨髓间充质干细胞24 h；③低浓度过氧化氢预处理组：先用50 µmol/L过氧化氢预处理骨髓间充质干细胞8 h，恢复12 h，再用500 µmol/L过氧化氢处理骨髓间充质干细胞24 h。

1.4.3 DCFH-DA荧光染料检测细胞内活性氧产生 将过氧化氢处理后的细胞与DCFH-DA混合液孵育30 min，PBS轻轻洗涤2遍。激光共聚焦显微镜下进行观察，在高倍镜下随机选择5个视野，采用Image软件进行荧光强度计算。

1.4.4 细胞内超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活力及丙二醛水平检测 过氧化氢处理后，将细胞消化，离心，收集细胞沉淀，提取细胞蛋白。根据相关试剂盒说明书进行操作。

1.4.5 JC-1法检测细胞线粒体膜电位 将过氧化氢处理后的细胞与染液混合物一起在37 ℃条件下孵育30 min，PBS轻轻洗涤3遍，激光共聚焦显微镜下进行观察，随机选择5个视野，采用Image软件进行红/绿荧光比值计算。

1.4.6 CCK-8检测细胞活力 过氧化氢处理后，PBS轻洗3遍，每孔加入100 µL完全培养基、10 µL CCK-8溶液，充分混匀，防止气泡产生，孵育3 h，在酶联免疫检测仪450 nm处测定吸光度值。

1.4.7 Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡 将过氧化氢处理后的细胞进行消化、离心，冷PBS洗涤细胞2遍，将细胞重悬于1×结合缓冲液中，取100 µL溶液转移到5 mL流式管中，加入5 µL FITC和5 µL PI，轻轻涡漩细胞，并在室温下避光孵育15 min，最后向每管加入400 µL 1×结合缓冲液，流式细胞仪收集细胞进行分析。

1.4.8 TUNEL和DAPI双染法检测细胞凋亡 取出过氧化氢处理后的细胞，PBS洗涤3遍，每遍5 min，干燥5 min；加入免疫染色固定液固定细胞30 min，PBS洗涤3遍，每遍5 min；加入免疫染色强力通透液Triton X-100，室温孵育5 min，PBS洗涤3遍，每遍5 min。在高倍镜下随机选择5个视野进行凋亡细胞计数。

1.5 主要观察指标 各组骨髓间充质干细胞生长、凋亡、活性氧和线粒体膜电位损伤情况以及各种抗氧化酶的表达。

1.6 统计学分析 所有数据采用SPSS 19.0统计软件分析，计量资料以x(_)±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

研究表明，预处理对细胞具有明显保护作用^[17-19]。研究表明过氧化氢预处理心脏祖细胞能显著提高细胞存活率，改善心室收缩功能，提高疗效。Li等^[18]报道在糖尿病心肌病中，高糖和过氧化氢预处理能够显著提高细胞增殖、存活及血管再生能力，促进心脏损伤修复。该实验通过过氧化氢处理骨髓间充质干细胞模拟体内氧化应激微环境，观察低浓度过氧化氢预处理对高浓度过氧化氢损伤骨髓间充质干细胞的保护作用，发现低浓度过氧化氢预处理可显著增强骨髓间充质干细胞抗氧化应激损伤能力。

活性氧是指生物体内与氧化代谢有关的含氧自由基的总称，氧化性质异常活泼^[20]，过多的活性氧可以导致骨髓间充质干细胞膜脂质过氧化、蛋白质交联和降解、脱氧核糖核酸断裂以及线粒体功能障碍^[21-22]。生理条件下，机体不断产生活性氧，而体内的抗氧化系统又在不断清除活性氧，两者处于相对动态平衡，不会损伤机体^[23-25]。当出现有害刺激时，会产生大量活性氧，抗氧化系统清除能力有限，导致氧化损伤发生，最终诱导细胞凋亡，因此过多的活性氧是诱导细胞凋亡的最重要诱因之一^[26]。该实验发现，低浓度过氧化氢可明显减少活性氧的产生，降低细胞氧化应激损伤，当细胞中自由基过量时，为修复或阻止细胞氧化损伤，体内的抗氧化酶系统起着重要作用，包括超氧化物歧化酶、过氧化氢酶等，这些酶或单独或协同地发挥作用，清除体内过量自由基，保持细胞结构和功能的完整性。超氧化物歧化酶可以通过歧化反应将超氧阴离子转化为过氧化氢，过氧化氢酶能进一步把过氧化氢降解为水和氧气来维持体内环境处于还原状态，它们在抵制细胞氧化应激和保护细胞状态稳定过程中起到关键作用，是细胞氧化损伤的重要指标。研究发现低浓度过氧化氢对氧化损伤骨髓间充质干细胞发挥保护作用的同时，伴有超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性显著升高，丙二醛水平明显下降，提示过氧化氢预处理可通过增加超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活力，减少丙二醛水平进而抵抗氧化损伤，进一步证实了低浓度过氧化氢预处理能够减少高浓度过氧化氢诱导的骨髓间充质干细胞凋亡。

线粒体被普遍认为是细胞能量和代谢中心，也是在细胞凋亡和信号传导中起关键调节作用的细胞器^[27-28]。该实验采用JC-1法检测细胞的线粒体膜电位，进而观察过氧化氢对细胞线粒体膜电位的损伤情况。线粒体膜电位较高时，JC-1形成聚合物产生红色荧光；在线粒体膜电位降低时产生绿色荧光^[29-32]。这样就可以通过荧光强度的转变来检测线粒体膜电位的变化。该实验高浓度过氧化氢损伤组红绿色荧光的比值明显低于正常对照组，说明过氧化氢可以导致线粒体膜电位的下降，低浓度过氧化氢预处理组荧光比值明显上升，红色荧光得到明显改善，说明预处理能够有效抵抗过氧化氢对细胞线粒体的损伤，实验结果与文献报道线粒体膜电位的变化和凋亡的发生相关一致。

强烈的氧化应激会改变细胞内的氧化还原状态，损伤DNA、蛋白质、脂质等生物大分子，改变完整的细胞结构和功能等一系列的氧化损伤过程，进而诱导细胞凋亡^[33-35]。该实验为研究预处理对高浓度过氧化氢诱导的细胞凋亡的影响，采用Annexin V/PI双染法和TUNEL-DAPI双染分析观察细胞凋亡情况。Annexin V-FITC/PI流式分析结果显示，500 µmol/L过氧化氢处理24 h后，明显诱导细胞凋亡，细胞的凋亡比例达到(39.67±3.30)%，而低浓度过氧化氢预处理可明显抑制早期细胞和中晚期细胞凋亡，凋亡率为(24.26±2.20)%，说明预处理可明显减少细胞凋亡。TUNEL-DAPI染色情况同样证实低浓度过氧化氢预处理减少骨髓间充质干细胞凋亡，经500 µmol/L过氧化氢处理的骨髓间充质干细胞呈现较多红色荧光，细胞中出现较多的DNA碎片，凋亡率为(25.72±2.33)%，低浓度过氧化氢预处理组可明显减少DNA降解等，红色荧光明显减少，凋亡率为(12.67±0.72)%。结果表明低浓度过氧化氢预处理能有效减少凋亡小体的产生，显著抑制细胞凋亡，提示低浓度过氧化氢预处理对高浓度过氧化氢诱导骨髓间充质干细胞的氧化应激损伤具有明显保护作用。

总之，实验通过低浓度过氧化氢预处理，明显提高氧化应激损伤后超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性，使细胞内活性氧和丙二醛水平下降，它可以减轻DNA和线粒体膜损伤，减少细胞凋亡发生，降低氧化损伤的凋亡率，提高骨髓间充质干细胞的存活率，显著促进了细胞在氧化应激条件下的存活。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

低浓度过氧化氢预处理增强骨髓间充质干细胞抗氧化应激损伤的能力

Preincubation with low-concentration hydrogen peroxide enhances anti-oxidative stress ability of bone marrow mesenchymal stem cells

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