持续低氧对小鼠胚胎成纤维细胞增殖及饲养层制备的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0478

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (9): 1450-1456.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0478

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持续低氧对小鼠胚胎成纤维细胞增殖及饲养层制备的影响

魏含清¹，裴轶劲¹，王丹丹¹，蒋杨²，王春¹，李洪梅³

广东医科大学，¹基础医学院生理学教研室，干细胞与再生医学研究所，²基础医学院生理科学实验室，³病理学系，广东省东莞市 523808

修回日期:2018-01-26 出版日期:2018-03-28 发布日期:2018-04-03
通讯作者: 裴轶劲，博士，广东医科大学基础医学院生理学教研室，干细胞与再生医学研究所，广东省东莞市 523808
作者简介:魏含清，女，1993年生，湖北省荆州市人，汉族，广东医科大学在读硕士，主要从事干细胞与发育毒性的相关研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81173136)；广东省科技计划项目(2013B022000003)；广东省基础与应用基础研究专项(广东省自然科学基金)(2015A030313524)；广东省东莞市国际科技合作项目(2015508102004)；广东医科大学科研基金自然科学类面上项目(M2015019)

Effects of sustained hypoxia on proliferation of mouse embryonic fibroblasts and preparation of feeder layers

Wei Han-qing¹, Pei Yi-jin¹, Wang Dan-dan¹, Jiang Yang², Wang Chun¹, Li Hong-mei³

¹Department of Physiology, Institute of Stem Cell and Regenerative Medicine, ²Laboratory of Physiological Science, ³Department of Pathology, Guangdong Medical University, Dongguan 523808, Guangdong Province, China

Revised:2018-01-26 Online:2018-03-28 Published:2018-04-03
Contact: Wei Han-qing, Master candidate, Department of Physiology, Institute of Stem Cell and Regenerative Medicine, College of Basic Medicine, Guangdong Medical University, Dongguan 523808, Guangdong Province, China
About author:Wei Han-qing, Master candidate, Department of Physiology, Institute of Stem Cell and Regenerative Medicine, College of Basic Medicine, Guangdong Medical University, Dongguan 523808, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81173136; the Scientific Research Project of Guangdong Province, No. 2013B022000003; the Natural Science Foundation of Guangdong Province, No. 2015A030313524; the International Scientific Cooperation Project of Dongguan in Guangdong Province, No. 2015508102004; the Scientific Research Foundation of Guangdong Medical University, No. M2015019

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
饲养层：是关系着胚胎干细胞培养和传代过程中保持活力和维持不分化特性的重要因素，胚胎干细胞饲养层一般为小鼠胚胎成纤维细胞或小鼠成纤维细胞经γ射线照射或丝裂霉素C处理后制备的单细胞层，能起到促进胚胎干细胞增殖和抑制分化的作用。
干细胞干性：包括干细胞的自我更新、多向分化潜能及高增殖等特性，这些特性的维持依赖于细胞生长的微环境，体外培养的干细胞干性维持与细胞培养系统存在密切的关联，受多种因素影响容易发生分化，因此完善干细胞培养体系维持干细胞干性受到研究者们的关注。

摘要
背景：在传统的胚胎干细胞培养体系中，饲养层细胞制备和胚胎干细胞的培养扩增大都是在常氧条件下进行的，氧培养条件的改变有可能影响饲养层细胞，从而改变胚胎干细胞的生长特性或分化能力，但尚未见到这方面的系统研究报道。
目的：观察低氧培养对饲养层细胞及小鼠胚胎干细胞干性维持的影响。
方法：原代小鼠胚胎成纤维细胞分为常氧组(体积分数20%O₂)和低氧组(体积分数5%O₂)持续传代培养，绘制生长曲线，检测活性氧水平和线粒体膜电位。将小鼠胚胎干细胞分为常氧组(饲养层为常氧组小鼠胚胎成纤维细胞，体积分数20%O2条件下培养)和低氧组(饲养层为低氧组小鼠胚胎成纤维细胞，体积分数5%O₂条件下培养)，观察胚胎干细胞的生长形态，检测干细胞多能性指标Oct4、Sox2以及低氧诱导因子HIF-1α mRNA表达。
结果与结论：①与常氧组相比，低氧组小鼠胚胎成纤维细胞增殖较快，线粒体膜电位上升，产生活性氧减少(P < 0.05)；②胚胎干细胞碱性磷酸酶染色阳性，Oct4、Sox2高表达，低氧组形成的中小集落及HIF-1α mRNA表达比常氧组显著增多(P < 0.05)；③结果表明，体积分数5%O₂持续低氧培养利于维持饲养层细胞(小鼠胚胎成纤维细胞)的活力和胚胎干细胞的干性维持。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-4347-0523(魏含清)

关键词: 小鼠胚胎成纤维细胞, 小鼠胚胎干细胞, 饲养层, 低氧, 线粒体膜电位, 活性氧, 低氧诱导因子, 干性, 干细胞, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: In traditional culture systems for embryonic stem cells, feeder cell preparation and embryonic stem cell culture are mostly performed under normoxic conditions. Changes in oxygen culture conditions are likely to influence feeder cells, thereby altering the growth characteristics or differentiation ability of embryonic stem cells, but there is still no relevant systematic report until now.
OBJECTIVE: To investigate the effects of sustained hypoxia culture on the pluripotency of mouse embryonic stem cells cultured on mouse embryonic fibroblast feeder layers.
METHODS: Primary mouse embryonic fibroblasts were persistently subcultured under normoxia (20% O₂) and hypoxia (5% O₂) conditions. Cell proliferation was measured for drawing growth curve. Reactive oxygen species level and mitochondria membrane potential of the feeder cells were detected respectively. Mouse embryonic stem cells were divided into two groups: normoxia group (plated on mouse embryonic fibroblast feeder layers under 20% O₂), and hypoxia group (plated on mouse embryonic fibroblast feeder layers under 5% O₂). The cell morphology was observed and the pluripotency of embryonic stem cells were detected by measurement of Oct4 and Sox2 expressions. Hypoxia inducible factor-1α mRNA expression was also tested in the four groups.
RESULTS AND CONCLUSION: As compared to the normoxia group, mouse embryonic fibroblasts in the hypoxia group proliferated faster, reactive oxygen species significantly declined, and the mitochondria membrane potential level increased significantly (P < 0.05). Embryonic stem cells were positive for alkaline phosphatase, and highly expressed Oct4 and Sox2 mRNA. Much more median- or small-sized colonies formed in the hypoxia group than the normoxia group (P < 0.05). The mRNA expression of hypoxia inducible factor-1α in embryonic stem cells had a significant difference between the hypoxia and normoxia groups (P < 0.05). These findings indicate that a sustained hypoxia environment can significantly promote the viability of mouse embryonic fibroblasts as feeder layers and maintain the pluripotency of embryonic stem cells under 5% O₂.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Embryonic Stem Cells, Fibroblasts, Cell Hypoxia, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

魏含清，裴轶劲，王丹丹，蒋杨，王春，李洪梅. 持续低氧对小鼠胚胎成纤维细胞增殖及饲养层制备的影响[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(9): 1450-1456.

Wei Han-qing, Pei Yi-jin, Wang Dan-dan, Jiang Yang, Wang Chun, Li Hong-mei. Effects of sustained hypoxia on proliferation of mouse embryonic fibroblasts and preparation of feeder layers[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(9): 1450-1456.

图/表（结果） 2

2.1 不同氧体积分数持续培养的小鼠胚胎成纤维细胞形态特征及增殖状况 在体积分数5%O₂和体积分数20%O₂中分别持续培养小鼠胚胎成纤维细胞，在传代后数小时开始贴壁生长，两组细胞形态一致，均呈典型成纤维细胞形态，梭状或多角状或不规则状，细胞质均匀，细胞核呈卵圆形，可见多个核仁(图1A，B)。细胞贴壁后，细胞增殖加快，第2天进入对数生长期，细胞逐渐排列紧密，细胞与细胞之间形成连接(图1C，D)。低氧组细胞数在第6天达到高峰，进入平台期，而常氧组细胞数在第7天达到高峰。低氧组细胞群体倍增时间为34.87 h，常氧组群体倍增时间38.1 h。

采用MTT法检测两组小鼠胚胎成纤维细胞增殖情况，贴壁第24小时，低氧组细胞数量比常氧组稍多，但差异无显著性意义(P > 0.05)。从第2天至第7天，同一天细胞数量低氧组比常氧组显著增多，差异有显著性意义(P < 0.05，图2)，说明体积分数5%O₂持续培养的小鼠胚胎成纤维细胞生长增殖更快。

2.2 不同氧体积分数持续培养对小鼠胚胎成纤维细胞线粒体膜电位的影响 经JC-1探针染色后流式细胞仪检测，以红绿荧光平均强度比值代表线粒体膜电位，体积分数5%O₂，20%O₂下持续培养至对数生长期的小鼠胚胎成纤维细胞线粒体膜电位分别为4.60±0.29，3.72±0.09，结果显示低氧组小鼠胚胎成纤维细胞线粒体膜电位明显上升(P < 0.05，图3)。

2.3 不同氧体积分数持续培养对小鼠胚胎成纤维细胞活性氧水平的影响 经过DCFH-DA染色后流式细胞仪检测，以绿色平均荧光强度代表活性氧水平，体积分数5%O₂，20%O₂下持续培养至对数生长期的小鼠胚胎成纤维细胞的活性氧水平分别为801.00±11.31，899.50±30.41，结果显示低氧组活性氧显著下降(P < 0.05，图4)。

2.4 不同氧体积分数持续培养的小鼠胚胎成纤维细胞制备的饲养层对胚胎干细胞保持不分化状态的自我更新维持作用 两组胚胎干细胞接种后，呈集落样生长。在第2天即可观察到有小集落出现，集落呈鸟巢状隆起，集落里细胞排列紧密，细胞体积小，核大，核质比高。第3天有大量集落生成，集落增大，各集落大小不一(图5A，B)。第4天即可扩增、传代。第3天两组胚胎干细胞的集落根据大小进行分类计数统计分析，结果显示低氧组胚胎干细胞的集落总数多，其中小集落数及中等大小集落数均比常氧组显著增加(P < 0.05，表2)，而大集落数差异无显著性意义(P > 0.05，表2)。

对两组胚胎干细胞的集落用碱性磷酸酶试剂盒染色，均为蓝紫色，碱性磷酸酶表达阳性(图5C，D)。进一步检测两组胚胎干细胞的多能性基因Oct4，Sox2和三胚层标志基因HNF4(内胚层)，Brachary(中胚层)，PAX6(外胚层)的mRNA表达，结果可见两组Oct4，Sox2的mRNA都高表达，三胚层标志基因弱表达，两组细胞Oct4，Sox2表达差异无显著性意义(P > 0.05，图5E)。结果显示这两组胚胎干细胞都能在各自的培养系统里维持多能性状态。

2.5 小鼠胚胎成纤维细胞和胚胎干细胞中HIF-1α基因表达 体积分数5%O₂，20%O₂持续培养的小鼠胚胎成纤维细胞均有HIF-1α mRNA表达，两组HIF-1α mRNA表达差异无显著性意义(P > 0.05，图6A)。体积分数5%O₂，20%O₂持续培养的胚胎干细胞均有HIF-1α mRNA表达，两组比较差异有显著性意义(P < 0.05，图6B)。

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引言

胚胎干细胞是从早期胚胎内细胞团或原始生殖嵴分离出来的一种多能干细胞。在体外长期培养能自我更新且不分化，并具有多向分化潜能^[1-3]，在细胞替代治疗、组织修复、发育毒性替代模型及药物筛选等方面都有极大的应用价值^[4-7]。胚胎干细胞的经典培养系统是干细胞接种于经过丝裂霉素C或γ射线处理后的饲养层上在常氧条件下培养^[8-10]。从1981年Evans建立第一株小鼠胚胎干细胞以来，包括人胚胎干细胞、诱导性多能干细胞等多能干细胞的首次成功建立都是使用这一系统并沿用至今^[3^，^11-12]。

从孕13 d左右的小鼠胚胎组织中获得的小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts，MEFs)^[13]，可用于基因功能、重编程机制、疾病机制、衰老及干细胞生物学等方面的研究^[14-15]。经丝裂霉素或射线灭活处理后的小鼠胚胎成纤维细胞常作为干细胞体外培养扩增的饲养层细胞。在常氧培养条件下，小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上培养扩增的胚胎干细胞常发生自发分化，不利于干细胞“干性”的维持，各成分对胚胎干细胞多能性维持作用仍不十分清楚^[16]。

体外培养体细胞和干细胞通常采用与大气氧相同的培养环境^[17-18]，但生理氧体积分数远远低于大气氧^[19]。近年来陆续有报道，与生理氧体积分数近似的体外低氧环境更有利于细胞的自我更新，不仅包括骨髓间充质干细胞、神经干细胞、脐血间充质干细胞、人类胚胎干细胞等干细胞^[20-23]，也包括各种体细胞，Betts等^[24]报道在体积分数3%O₂培养条件下小鼠胚胎成纤维细胞克服老龄化，增殖迅速，在体积分数5%O₂环境中持续培养数天，小鼠胚胎成纤维细胞线粒体在细胞质中的核周分布类型及ATP水平均发生了改变^[25]，但在低氧环境长期持续传代影响小鼠胚胎成纤维细胞增殖、线粒体功能、基因表达、因子分泌等各方面的相关机制尚需进一步探索。低氧对体外培养细胞的作用十分复杂，如体积分数5%O₂对人胚胎干细胞既有促进自我更新能力的报道又有促进分化的报道^[26-27]。低氧诱导因子(hypoxia inducible factor，HIF)对低氧环境中细胞生长及分化的作用受到重视^[28]，但低氧对小鼠胚胎成纤维细胞和胚胎干细胞的作用及机制仍远未阐明。一般情况下，与胚胎干细胞共培养的饲养层细胞都是选用在大气氧体积分数条件下培养。在低氧培养条件下制备饲养层细胞，并在低氧条件下对胚胎干细胞进行培养扩增，可能有利于胚胎干细胞干性的维持。

实验探讨持续低氧对小鼠胚胎成纤维细胞增殖、线粒体膜电位、活性氧及HIF-1α表达的影响，并用不同氧体积分数培养的小鼠胚胎成纤维细胞制备饲养层，以观察对胚胎干细胞不分化自我更新的作用，为优化小鼠胚胎成纤维细胞和胚胎干细胞培养系统及进一步了解低氧对小鼠胚胎成纤维细胞和胚胎干细胞的作用提供实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2016年3月至2017年11月在广东医科大学完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物及小鼠胚胎干细胞 性成熟昆明小鼠30只，其中雄鼠10只，雌鼠20只，6-8周龄，体质量20 g左右，由中山大学实验动物中心提供。将雄鼠与雌鼠按1︰2比例合笼，于合笼后第2天开始，每天上午8：00观察，若发现阴栓或阴道涂片精子阳性，则定为妊娠0 d，合笼饲养。小鼠胚胎干细胞由中山大学实验动物中心提供。

1.3.2 实验用主要试剂和设备 引物(生工生物工程(上海)有限工司)；胎牛血清、高糖DMEM、Trizol、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸、DPBS、白血病抑制因子、非必需氨基酸、丙酮酸钠、β-巯基乙醇、谷氨酰胺、M-MLV反转录试剂盒、SYBR Select MasterMix(美国Life Technologies公司)；MTT (AMRESCO公司)；丝裂霉素C、二甲基亚砜(美国Sigma公司)；JC-1试剂盒、ROS试剂盒(上海碧云天公司)；实时荧光定量PCR仪、二氧化碳培养箱、三气培养箱、核酸蛋白分析仪(美国Thermo Fisher公司)；流式细胞仪(美国BD公司)；倒置相差显微镜(日本Nikon公司)；多功能酶标仪(BioTeK公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 小鼠胚胎成纤维细胞的分离与传代培养 颈椎脱臼法处死孕13.5 d小鼠，在超净台中无菌操作，取出胚胎，DPBS洗3遍，去除胚胎头、尾、内脏和四肢，留躯干部皮肤，剪碎。采用梯度消化法，准备4种不同浓度的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸，从低浓度往高浓度依次各消化5 min，1 000 r/min离心5 min，弃上清，获得细胞沉淀，用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液重悬后接种，分为常氧组(体积分数20%O₂)及低氧组(体积分数5%O₂)进行培养，每天观察细胞生长情况，更换新鲜培养液。当各组细胞处于对数生长期时，根据实验需要冻存或传代或用于制备饲养层。

1.4.2 小鼠胚胎成纤维细胞生长曲线绘制和倍增时间计算 取常氧组、低氧组培养至融合率为80%-90%的细胞，消化中止后，按5×10³/孔接种于96孔板中连续培养。每隔24 h血球计数板计数或每孔加入5 g/L MTT 10 μL，培养箱中孵育4 h后吸弃上清，每孔加入150 μL二甲基亚砜形成紫色甲臜结晶，于多功能酶标仪检测490 nm波长下的吸光度值，实验设6个复孔，重复3次。以时间为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制生长曲线。细胞倍增时间根据Patterson公式T_d=T×Lg2/(LgNt2-LgNt1)计算，T代表生长曲线中的对数增殖时间，Nt1代表对数增殖期起始时间的细胞数，Nt2代表对数增殖末期的细胞数。

1.4.3 小鼠胚胎成纤维细胞线粒体膜电位的测定 取常氧组、低氧组培养至对数生长期的细胞，消化后中止，离心弃上清，加入培养液重悬。根据试剂盒说明加入JC-1染色工作液混匀，37 ℃孵育20 min，4 ℃ 600×g离心4 min沉淀细胞，弃上清后用染色缓冲液重悬细胞，流式细胞仪检测JC-1单体时设置激发光490 nm，发射光530 nm，检测JC-1聚合物时设置激发光525 nm，发射光590 nm。以红绿相对荧光强度比值代表线粒体膜电位，实验设6个复孔，重复3次。

1.4.4 小鼠胚胎成纤维细胞活性氧的检测 取常氧组、低氧组培养至对数生长期的细胞，消化中止后，离心弃上清，根据试剂盒说明，细胞重悬于含10 μmol/L DCFH-DA的细胞培养液中，37 ℃孵育20 min，然后离心弃上清，细胞沉淀用DPBS洗3遍，用细胞培养液重悬后于流式细胞仪检测，激发光488 nm，发射光525 nm。实验设置6个复孔，重复3次。

1.4.5 饲养层的制备 各组小鼠胚胎成纤维细胞以1×10⁶/25 cm²铺于明胶包被培养瓶中，贴壁后弃培养液，加入10 mg/L丝裂霉素C工作液，于37 ℃培养箱中作用2.0-2.5 h，吸弃丝裂霉素C工作液，用DPBS洗3遍，换为含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液，并于倒置显微镜下观察饲养层状态，常氧组小鼠胚胎成纤维细胞制备的饲养层继续置于体积分数20%O₂中备用，低氧组小鼠胚胎成纤维细胞制备的饲养层继续置于体积分数5%O₂中备用。

1.4.6 胚胎干细胞的低氧、常氧培养 将胚胎干细胞复苏接种于已经准备好的饲养层上，胚胎干细胞培养液为含体积分数15%胎牛血清、1 mmol/L谷氨酰胺、0.1 mmol/L非必需氨基酸、0.1 mmol/L β-巯基乙醇、2 mmol/L丙酮酸钠、1 000 U/mL白血病抑制因子的DMEM培养液。胚胎干细胞分为常氧组(饲养层为常氧制备小鼠胚胎成纤维细胞，体积分数20%O₂培养)和低氧组(饲养层为低氧制备小鼠胚胎成纤维细胞，体积分数5%O₂培养)，每组胚胎干细胞按照平均分配的方式保证细胞接种量相同，隔天换液，每天在倒置显微镜下观察细胞生长，至对数生长期时，取部分胚胎干细胞，进行碱性磷酸酶染色或检测相关基因mRNA表达，部分细胞随机抽取10个视野，对小集落(面积< 4 000 μm²)、中集落(面积4 000-8 000 μm²)、大集落(面积> 8 000 μm²)计数。

1.4.7 胚胎干细胞碱性磷酸酶染色 取各组胚胎干细胞，弃培养液后，DPBS洗3次，每次三四分钟，弃DPBS，根据试剂盒说明，加入适量BCIP/NBT染色工作液，用蒸馏水洗涤一两次，终止显色反应，在显微镜下观察拍照。

1.4.8 Real-time PCR检测胚胎干细胞干性、胚层分化相关基因及HIF-1α的表达 每组样本用Trizol法提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度。按照反转录试剂盒说明，总RNA反转录成cDNA，立即使用或-20 ℃备用，以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR反应。反应体系为10 μL，反应条件：1个循环(95 ℃，7 min)；40个循环(变性95℃，5 s；延伸60 ℃，30 s)；1个循环(解离60 ℃，30 s)。绘制熔解曲线，并进行数据分析。以GAPDH为内参基因，待测的基因包括多能性特征基因(Oct4，Sox2)、中胚层特异基因(brachary)、外胚层特异基因(Pax6)、内胚层特异基因(HNF4)及低氧诱导因子(HIF-1α)。各基因引物序列见表1。

1.5 主要观察指标 ①小鼠胚胎成纤维细胞的形态；②小鼠胚胎成纤维细胞生长曲线；③小鼠胚胎成纤维细胞线粒体膜电位水平；④小鼠胚胎成纤维细胞活性氧水平；⑤小鼠胚胎成纤维细胞及胚胎干细胞中HIF-1α的mRNA表达；⑥胚胎干细胞的集落生成数；⑦胚胎干细胞的碱性磷酸酶表达；⑧胚胎干细胞多能性基因、三胚层特征基因的mRNA表达。

1.6 统计学分析 采用SPSS 22.0统计软件进行统计学分析，计量资料x(_)±s表示，两组间比较采用独立样本t 检验，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)；计数资料以例数表示；采用双侧检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

氧是细胞赖以生长发育的重要条件，通过模拟体内氧环境可以使卵母细胞体外成熟受到影响，早期胚胎发育至桑椹胚、囊胚的比例提高，早期胚胎中的细胞数增加^[29-32]，骨髓间充质干细胞经低氧处理后，细胞增殖和抗氧化能力增强，移植疗效提高^[33]，来源于早期胚胎内细胞团的人胚胎干细胞在低氧下自我更新能力加强^[34-36]，这些报道都说明，相对于常氧培养，体外低氧培养条件更有利于干细胞的增殖。但是最适宜的体外培养环境尚无定论，有实验发现，过度低氧(如体积分数0.1%O₂至1%O₂)多为抑制生长作用^[37-38]；中度低氧(体积分数2%O₂至5%O₂)为促进生长作用^[39]。除氧体积分数外，低氧处理时间及频率等也对细胞生长增殖有影响^[40-41]。生理条件下体内氧气在平均体积分数3%O₂至5%O₂之间^[42-44]。根据前期预实验结果，选用体积分数5%O₂条件持续培养小鼠胚胎成纤维细胞来制备饲养层，以避免细胞从常氧(体积分数20%O₂)到低氧(体积分数5%O₂)所可能导致的应激反应对实验的干扰。实验结果显示长期持续低氧条件下细胞增殖快，利于细胞生长传代，且贴壁小鼠胚胎成纤维细胞数量稍高于常氧组，但差异无显著性意义(P > 0.05)，说明持续低氧并不影响细胞贴壁率。

细胞能量、生长、凋亡等受到线粒体调控，前期研究显示持续低氧环境下，线粒体分布及能量代谢发生改变^[25^，^45-46]。实验进一步研究了持续低氧条件下小鼠胚胎成纤维细胞线粒体膜电位和活性氧水平。线粒体膜电位是线粒体内膜两侧的质子和其他离子浓度梯度形成的电位差，反映了线粒体功能完整性，是维持细胞正常生理功能的必备条件。实验结果显示，持续低氧环境下小鼠胚胎成纤维细胞的线粒体膜电位水平显著上升(P < 0.05)，说明持续低氧下小鼠胚胎成纤维细胞维持正常线粒体功能，细胞活性好。活性氧是线粒体伴随着能量代谢过程产生的，活性氧长期升高会造成细胞结构和功能的氧化性损害，导致能量代谢障碍。正常情况下，活性氧的产生与清除保持动态平衡。本实验发现，低氧组小鼠胚胎成纤维细胞活性氧水平显著低于常氧组(P < 0.05)，活性氧水平下降有利于减少细胞的氧化损伤，更利于细胞增殖。但本实验发现的低氧培养条件下线粒体膜电位上升，活性氧水平下降的机制仍不清楚，有待深入研究。

关于低氧对胚胎干细胞的自我更新和分化的影响有争议，有人认为低氧能调控胚胎干细胞自我更新防止分化^[34-36^，^47]，但也有相反报道则认为低氧可促进干细胞向心肌细胞、血管内皮细胞分化^[27^，^48-50]。本实验发现，在低氧组，碱性磷酸酶在胚胎干细胞中呈阳性表达，代表干细胞不分化的干性基因Oct4、Sox2的mRNA表达均较高，低氧组胚胎干细胞三胚层特征基因表达弱，而Oct4、Sox2的mRNA表达高，说明持续低氧环境有利于维持干细胞的干性。低氧组胚胎干细胞的集落生成数比常氧组显著上升(P < 0.05)，表明低氧培养有利于胚胎干细胞的增殖。

在其他胚胎干细胞低氧培养报道中，胚胎干细胞的饲养层细胞在常氧条件下制备，胚胎干细胞低氧处理时间长短不一，所得结果也不相同，如长期体积分数4%O₂低氧降低胚胎干细胞凋亡^[51]，而体积分数3%O₂短时间(24 h)处理抑制胚胎干细胞生长^[41]。与小鼠胚胎成纤维细胞饲养层共培养的胚胎干细胞培养系统成分复杂，涉及因素多，除与氧体积分数有关外，还有可能与其他因素有关，低氧对胚胎干细胞自我更新作用及机制尚待进一步研究。

HIF1由HIF-1α和HIF-1β构成，通过影响超过200个基因表达，参与调控细胞存活、增殖、凋亡、能量代谢、氧稳态等各种细胞功能，HIF-1α是对低氧敏感的早期调控因子，受低氧诱导或细胞因子等刺激转录，HIF-1α参与胚胎干细胞生长与分化调控^[52-54]。有报道小鼠胚胎成纤维细胞从常氧至体积分数5%O₂的8 h应激适应中，HIF-1α mRNA表达有一个增强，随后又下降的过程^[55]。本实验持续低氧环境促进小鼠胚胎成纤维细胞增殖，HIF-1α mRNA表达低氧组与常氧组相似，推测与小鼠胚胎成纤维细胞长期处于体积分数5%O₂中有关，提示HIF-1α可能并不参与持续低氧对小鼠胚胎成纤维细胞增殖的调节。而持续低氧条件下胚胎干细胞的HIF-1α mRNA明显上调，胚胎干细胞集落生成数增加，低氧环境下细胞增殖有HIF依赖途径与非HIF依赖的途径^[52]，推测持续低氧环境下胚胎干细胞增殖与HIF依赖途径有关。但持续低氧环境影响小鼠胚胎成纤维细胞和胚胎干细胞的各种信号通路调控复杂，尚待阐明。

综上所述，持续低氧促进小鼠胚胎成纤维细胞增殖，影响线粒体膜电位、活性氧。持续性低氧培养制备的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层联合持续低氧培养，可促进胚胎干细胞的增殖并有利于维持胚胎干细胞的干性。持续低氧(体积分数5%O₂)可作为扩增小鼠胚胎成纤维细胞和胚胎干细胞的体外氧环境，但是长期低氧影响小鼠胚胎成纤维细胞进而维持胚胎干细胞的自我更新机制尚待深入研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

持续低氧对小鼠胚胎成纤维细胞增殖及饲养层制备的影响

Effects of sustained hypoxia on proliferation of mouse embryonic fibroblasts and preparation of feeder layers

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