转录共激活因子TAZ对人牙髓干细胞体外增殖的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0479

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
人牙髓干细胞：Gronthos等于2000年报道，通过体外培养，从健康成体牙髓组织中获得快速增殖的克隆单位，在体外可诱导分化形成牙本质样细胞，从而首次提出了牙髓干细胞的概念。与大多数成体干细胞类似，人牙髓干细胞具有多向分化潜能和增殖能力，能够形成新的功能细胞，已成为组织工程研究中的一种新型种子细胞。
转录共激活因子TAZ(Transcriptional coactivator with PDZ-binding motif)：属于14-3-3胞浆蛋白家族。前期研究表明，TAZ是Hippo信号通路下游的一个重要效应分子，能够参与胚胎发生和一些组织发育，包括骨骼、肺脏和心脏。不仅如此，TAZ对间充质干细胞的增殖和分化也具有重要作用。

摘要
背景：如何提高人牙髓干细胞体外增殖能力对于再生医学具有重要的意义。
目的：探讨转录共激活因子TAZ对人牙髓干细胞增殖的影响和潜在的作用机制。
方法：分离培养人牙髓干细胞，利用细胞免疫荧光法检测TAZ在人牙髓干细胞中的表达；用siRNA敲减TAZ表达后，通过MTT法和BrdU细胞增殖试剂盒检测人牙髓干细胞增殖情况；通过实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹法检测TAZ下游靶基因CTGF和Cry61的表达；蛋白免疫印迹法进一步检测TAZ对TGF-β通路蛋白Smad3和Smad4表达的影响。
结果与结论：①人牙髓干细胞表达TAZ蛋白；②细胞转染siTAZ 48 h后，TAZ mRNA和蛋白表达水平均显著降低；转染siTAZ 24 h和48 h后，人牙髓干细胞增殖速度均显著下降；③细胞转染siTAZ后，TAZ下游靶基因CTGF和Cyr61 mRNA和蛋白表达均受到抑制；④细胞转染siTAZ后，TGF-β通路蛋白Smad3和Smad4的表达水平降低；⑤以上结果表明，TGF-β依赖性信号通路可能参与了TAZ调节CTGF和Cyr61表达，从而调控人牙髓干细胞的增殖。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-5298-0165(张文)

关键词: 人牙髓干细胞, 转录共激活因子TAZ, 干细胞, 细胞增殖, TGF-β通路

Abstract:

BACKGROUND: How to improve the proliferation of human dental pulp stem cells (hDPSCs) in vitro is of great importance in regenerative medicine.
OBJECTIVE: To investigate the effect of TAZ, a transcriptional coactivator, on the proliferation of hDPSCs and its potential mechanisms.
METHODS: hDPSCs were isolated from human dental pulps and cultured in vitro. The expression of TAZ in hDPSCs was detected by immunofluorescence method. Then, we knocked down the expression of TAZ in hDPSCs, and the proliferation of hDPSCs was measured by MTT and BrdU kit analysis respectively. The levels of CTGF and Cry61, which are the downstream target genes of TAZ, were detected by RT-qPCR and western blot assay. We also investigated the effect of TAZ on the levels of transforming growth factor-β (TGF-β) signaling proteins, Smad3 and Smad 4 by using western blot.
RESULTS AND CONCLUSION: TAZ protein was expressed in hDPSCs. After the transfection by siTAZ for 24 hours, the mRNA and protein levels of TAZ were both significantly decreased. After the transfection by siTAZ for 24 and 48 hours, the proliferation of hDPSCs was obviously inhibited. Meanwhile, the mRNA and protein levels of CTGF and Cry61 were decreased by siTAZ transfection. The further research showed that TAZ silence also inhibited the expression of Smad3 and Smad 4, which belonged to the TGF-β signaling pathway. To conclude, TAZ may modulate the proliferation of hDPSCs through regulating the expression of CTGF and Cry61, and TGF-β-dependent signaling pathways may be involved in this regulation.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Dental Pulp, Cell Proliferation, Transcriptional Activation, RNA Interference, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

张文，罗士维，谷爱玲，何巍. 转录共激活因子TAZ对人牙髓干细胞体外增殖的影响[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(9): 1457-1462.

Zhang Wen, Luo Shi-wei, Gu Ai-ling, He Wei. Effects of TAZ, a transcriptional coactivator, on human dental pulp stem cell proliferation in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(9): 1457-1462.

图/表（结果） 2

2.1 人牙髓干细胞形态及TAZ表达 通过胰蛋白酶消化法获得人原代牙髓干细胞，主要为成纤维样细胞，其形态多为梭形(图1A)。人牙髓干细胞传至3-5代后，利用细胞免疫荧光法检测TAZ蛋白表达，结果显示人牙髓干细胞TAZ蛋白表达呈阳性，且与细胞核共定位(图1B-D)，以上结果成功证实人牙髓干细胞中有TAZ蛋白表达。

2.2 TAZ靶向小干扰RNA(siTAZ)下调了人牙髓干细胞中TAZ的mRNA和蛋白表达 为了探索TAZ对人牙髓干细胞体外增殖的影响，首先设计合成了干扰TAZ表达的小干扰RNA(siTAZ)。如图2所示，在成功转染siTAZ 48 h之后，RT-qPCR(图2A)和Western blot(图2B)结果均一致显示，siTAZ组的TAZ mRNA和TAZ蛋白表达水平均较对照组显著降低，提示siTAZ可以有效地沉默TAZ在人牙髓干细胞中的表达。

2.3 siTAZ抑制了人牙髓干细胞的体外增殖 采用MTT法检测各组细胞的体外增殖情况，如图3A所示，在siTAZ转染后24 h，siTAZ组的细胞增殖速度已显著低于空白对照组和阴性对照组；在转染后48 h，上述抑制作用较前进一步增强。为进一步验证上述实验结果，又采用BrdU细胞增殖法检测各组细胞的体外增殖情况，与MTT法检测结果类似，siTAZ组的细胞增殖速度显著低于空白对照组和阴性对照组(图3B)。以上结果提示，沉默TAZ的表达可以显著抑制人牙髓干细胞的体外增殖。

2.4 siTAZ通过下调CTGF和Cyr61的表达而抑制人牙髓干细胞的体外增殖 前期已有报道显示CTGF和Cyr61作为TAZ下游作用的重要靶蛋白，其可能与细胞的增殖、迁移和凋亡等有密切联系。因此，为进一步探索siTAZ抑制人牙髓干细胞体外增殖的潜在分子机制，实验分别检测了TAZ被沉默表达之后CTGF和Cyr61在mRNA和蛋白水平的表达变化。结果如图4所示，无论是在mRNA水平还是蛋白水平，siTAZ组CTGF和Cyr61的表达水平均较空白对照组和阴性对照组显著降低，这提示siTAZ可能是通过干扰TAZ表达，进而抑制其下游CTGF和Cyr61蛋白的表达而最终影响了人牙髓干细胞的体外增殖。

2.5 siTAZ通过TGF?β介导的信号通路来下调CTGF和Cyr61蛋白的表达 有研究报道TAZ可能通过TGF?β信号通路参与对CTGF和Cyr61蛋白的调控，因此，为深入探索siTAZ下调CTGF和Cyr61蛋白表达的分子机制，进一步检测了siTAZ转染后TGF?β信号通路中重要分子Smad3和Smad4的表达变化。结果如图5所示，siTAZ组Smad3和Smad4的表达水平均较空白对照组和阴性对照组显著降低，提示TGF?β信号通路可能参与了TAZ调控CTGF和 Cyr61蛋白的表达。

参考文献

[1] Downing TL, Soto J, Morez C, et al. Biophysical regulation of epigenetic state and cell reprogramming. Nat Mater. 2013; 12(12):1154-1162.

[2] Karaöz E, Demircan PC, Sa?lam O, et al. Human dental pulp stem cells demonstrate better neural and epithelial stem cell properties than bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Histochem Cell Biol. 2011;136(4):455-473.

[3] Liu P, Cai J, Dong D, et al. Effects of SOX2 on Proliferation, Migration and Adhesion of Human Dental Pulp Stem Cells. PLoS One. 2015;10(10):e0141346.

[4] Liu L, Wu L, Wei X, et al. Induced overexpression of Oct4A in human dental pulp cells enhances pluripotency and multilineage differentiation capability. Stem Cells Dev. 2015;24(8):962-972.

[5] Jayaraman P, Govindasamy V, Gnanasegaran N, et al. Expression patterns of immune genes in long-term cultured dental stem cells. Clin Oral Investig. 2016;20(1):109-116.

[6] Han SM, Han SH, Coh YR, et al. Enhanced proliferation and differentiation of Oct4- and Sox2-overexpressing human adipose tissue mesenchymal stem cells. Exp Mol Med. 2014;46:e101.

[7] Liu L, Wei X, Ling J, et al. Expression pattern of Oct-4, Sox2, and c-Myc in the primary culture of human dental pulp derived cells. J Endod. 2011;37(4):466-472.

[8] Jeong H, Bae S, An SY, et al. TAZ as a novel enhancer of MyoD-mediated myogenic differentiation. FASEB J. 2010; 24(9):3310-3320.

[9] Luo Z, Li D, Kohli MR, et al. Effect of Biodentine™ on the proliferation, migration and adhesion of human dental pulp stem cells. J Dent. 2014;42(4):490-497.

[10] Tate MC, García AJ, Keselowsky BG, et al. Specific beta1 integrins mediate adhesion, migration, and differentiation of neural progenitors derived from the embryonic striatum. Mol Cell Neurosci. 2004;27(1):22-31.

[11] Kanai F, Marignani PA, Sarbassova D, et al. TAZ: a novel transcriptional co-activator regulated by interactions with 14-3-3 and PDZ domain proteins. EMBO J. 2000;19(24): 6778-6791.

[12] Tian S, Tian X, Liu Y, et al. Effects of TAZ on human dental pulp stem cell proliferation and migration. Mol Med Rep. 2017;15(6):4326-4332.

[13] Pan D.The hippo signaling pathway in development and cancer. Dev Cell. 2010;19(4):491-505.

[14] Hong JH, Yaffe MB. TAZ: a beta-catenin-like molecule that regulates mesenchymal stem cell differentiation. Cell Cycle. 2006;5(2):176-179.

[15] Hong JH, Hwang ES, McManus MT, et al. TAZ, a transcriptional modulator of mesenchymal stem cell differentiation. Science. 20052;309(5737):1074-1078.

[16] Murakami M, Nakagawa M, Olson EN, et al. A WW domain protein TAZ is a critical coactivator for TBX5, a transcription factor implicated in Holt-Oram syndrome. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102(50):18034-18039.

[17] Park KS, Whitsett JA, Di Palma T, et al. TAZ interacts with TTF-1 and regulates expression of surfactant protein-C. J Biol Chem. 2004;279(17):17384-17390.

[18] Suh JS, Kim KS, Lee JY, et al. A cell-permeable fusion protein for the mineralization of human dental pulp stem cells. J Dent Res. 2012;91(1):90-96.

[19] Iohara K, Zheng L, Wake H, et al. A novel stem cell source for vasculogenesis in ischemia: subfraction of side population cells from dental pulp. Stem Cells. 2008;26(9):2408-2418.

[20] Nakamura S, Yamada Y, Katagiri W, et al. Stem cell proliferation pathways comparison between human exfoliated deciduous teeth and dental pulp stem cells by gene expression profile from promising dental pulp. J Endod. 2009;35(11):1536-1542.

[21] La Noce M, Paino F, Spina A, et al. Dental pulp stem cells: state of the art and suggestions for a true translation of research into therapy. J Dent. 2014;42(7):761-768.

[22] Liu J, Yu F, Sun Y, et al. Concise reviews: Characteristics and potential applications of human dental tissue-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells. 2015;33(3):627-638.

[23] Tirino V, Paino F, d'Aquino R, et al. Methods for the identification, characterization and banking of human DPSCs: current strategies and perspectives. Stem Cell Rev. 2011;7(3): 608-615.

[24] Conde MC, Nedel F, Campos VF, et al. Odontoblast RNA stability in different temperature-based protocols for tooth storage. Int Endod J. 2012;45(3):266-272.

[25] Hong W, Guan KL.The YAP and TAZ transcription co-activators: key downstream effectors of the mammalian Hippo pathway. Semin Cell Dev Biol. 2012;23(7):785-793.

[26] Wang K, Degerny C, Xu M, et al. YAP, TAZ, and Yorkie: a conserved family of signal-responsive transcriptional coregulators in animal development and human disease. Biochem Cell Biol. 2009;87(1):77-91.

[27] Zeng Q, Hong W. The emerging role of the hippo pathway in cell contact inhibition, organ size control, and cancer development in mammals. Cancer Cell. 2008;13(3):188-192.

[28] Lei QY, Zhang H, Zhao B, et al. TAZ promotes cell proliferation and epithelial-mesenchymal transition and is inhibited by the hippo pathway. Mol Cell Biol. 2008;28(7): 2426-2436.

[29] Chan SW, Lim CJ, Guo K, et al. A role for TAZ in migration, invasion, and tumorigenesis of breast cancer cells. Cancer Res. 2008;68(8):2592-2598.

[30] Wang Q, Xu Z, An Q, et al. TAZ promotes epithelial to mesenchymal transition via the upregulation of connective tissue growth factor expression in neuroblastoma cells. Mol Med Rep. 2015;11(2):982-988.

[31] Dhar A, Ray A.The CCN family proteins in carcinogenesis. Exp Oncol. 2010;32(1):2-9.

[32] Leivonen SK, Kähäri VM. Transforming growth factor-beta signaling in cancer invasion and metastasis. Int J Cancer. 2007;121(10):2119-2124.

[33] Kim KM, Choi YJ, Hwang JH, et al. Shear stress induced by an interstitial level of slow flow increases the osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells through TAZ activation. PLoS One. 2014;9(3):e92427.

[34] Xie JJ, Xu LY, Wu JY, et al. Involvement of CYR61 and CTGF in the fascin-mediated proliferation and invasiveness of esophageal squamous cell carcinomas cells. Am J Pathol. 2010;176(2):939-951.

[35] Labbé E, Lock L, Letamendia A, et al. Transcriptional cooperation between the transforming growth factor-beta and Wnt pathways in mammary and intestinal tumorigenesis. Cancer Res. 2007;67(1):75-84.

引言

材料方法

1.1 设计 细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点 于2015年1月至2017年1月在郑州大学第一附属医院口腔医学中心完成。

1.3 材料

1.3.1 新鲜的牙髓组织块 来源于郑州大学第一附属医院口腔医学中心就诊的因正畸减数拔除恒牙的患者，年龄16-30岁。患者及家属签署了知情同意书，研究方案经郑州大学第一附属医院伦理委员会批准。

1.3.2 实验主要试剂和仪器 DMEM培养基、血清(美国，GIBCO公司)；L-谷氨酰胺(美国，Sigma公司)；Anti-TAZ、CTGF、Cy61、Smad3、Smad4、GAPDH抗体(美国，Abcam公司)；Anti-Mouse/Rabbit荧光二抗Hoechst(美国，TermoFisher公司)；二甲基亚砜(美国，MP公司)；噻唑蓝(美国，Sigma公司)；Trizol试剂盒(美国，Invitrogen公司)；RNA反转录试剂盒(美国，Thermo公司)；实时荧光定量PCR试剂盒(美国，Thermo公司)；BrdU细胞增殖检测试剂盒(美国，罗氏公司)；凝胶成像仪(美国，Bio-Rad公司)；实时荧光定量PCR仪(美国，Bio-Rad公司)；倒置相差荧光显微镜(日本，尼康公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 人牙髓干细胞分离培养 选取因正畸减数拔除的健康恒牙，拔除后使用体积分数为75%乙醇消毒，再用含有青霉素和链霉素的PBS清洗2次。取出牙髓组织并剪碎，用2%Ⅰ型胶原酶消化约40 min，1 000 r/min离心5 min，弃上清，使用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞，接种于培养皿，37 ℃体积分数为5%CO₂恒温培养箱中培养，待细胞长至80%汇合率时，消化传代。

1.4.2 细胞免疫荧光检测 取第3-5代人牙髓干细胞，以1×10⁸ L^-1的细胞浓度接种于含有无菌盖玻片的培养板中，培养过夜后，加入40 g/L多聚甲醛室温固定10 min，PBS洗3遍，每次5 min；0.5% Triton X-100打孔5 min，PBS洗3遍，每次5 min；1% BSA室温孵育30 min后，加入1︰200稀释的Anti-TAZ抗体4℃孵育过夜，PBS洗3遍，每次5 min；1︰100稀释的Anti-Mouse荧光二抗室温避光孵育1 h，PBS洗3遍，每次5 min；Hoechst避光染色10 min，PBS洗3遍，抗淬灭封固剂封固，荧光显微镜下观察。

1.4.3 小干扰RNA(siRNA)敲减TAZ表达 取第3-5代人牙髓干细胞，以1×10⁸ L^-1的细胞浓度接种于6孔板，培养过夜后，融合密度约为80%，换无血清培养基，转染步骤根据Invitrogen公司的Lipofectamine2000试剂盒说明书操作，分别转染阴性对照siRNA(siNC)和TAZ siRNA(siTAZ)，转染6 h后，弃去上清，加入新鲜培养基，培养24 h或48 h后检测干扰效果或进行后续实验，以未处理细胞作为空白对照组。

1.4.4 RT-qPCR检测TAZ下游靶基因表达 人牙髓干细胞转染siNC和siTAZ 48 h后，移去培养液，加入Trizol裂解液，按RNA提取试剂盒说明书操作，提取总RNA并利用反转录试剂盒获得cDNA。按照RT-qPCR试剂盒说明书进行RT-qPCR操作。分别以TAZ，CTGF和Cyr61为引物，以GAPDH作为内参，反应体系为20 μL。RT-qPCR引物见表1。实验共重复3次。

1.4.5 蛋白免疫印迹法检测TAZ下游靶蛋白和TGF-β通路蛋白表达 人牙髓干细胞转染siNC和siTAZ 48 h后，移去培养液，加入细胞裂解缓冲液，冰上裂解细胞10 min，经12 000 r/min离心后提取蛋白质，采用BCA法进行蛋白定量后将其煮沸变性，取等量样品以12% SDS-PAGE进行电泳。电泳后将蛋白转印至PVDF膜上，将PVDF膜浸泡于5%脱脂牛奶中，室温封闭2 h，然后加入TAZ，CTGF，Cyr61，Smad3和Smad4抗体(1︰1 000) 4 ℃孵育过夜，再用辣根过氧化物酶标记的特异性二抗(1︰5 000)室温摇床孵育2 h，1×TBST液漂洗3次，每次8 min，加入化学发光底物并在凝胶成像系统进行显影，用美国国立卫生研究院开发的Image J软件对条带灰度进行分析。通过计算各组目的蛋白条带的灰度值与内参蛋白GAPDH灰度值的比值，对目的蛋白进行半定量并比较各组间表达水平的差异。实验共重复3次。

1.4.6 细胞增殖检测

MTT法：人牙髓干细胞铺于96孔板中培养24 h后，分别进行siNC和siTAZ转染处理24 h或48 h，移去培养液，加入0.5 g/L的MTT 37 ℃孵育4 h，弃去MTT后加入150 μL二甲基亚砜，避光条件下培养板剧烈摇晃10 min，利用酶标仪测试570 nm下吸光度值，每组实验至少重复3次并收集数据。

BrdU细胞增殖检测试剂盒法：人牙髓干细胞铺于96孔板培养24 h后，分别进行siNC和siTAZ转染处理24 h，加入BrdU 37 ℃孵育1 h，利用ELISA法检测细胞增殖情况。

1.5 主要观察指标 ①人牙髓干细胞形态及TAZ蛋白表达；②转染siTAZ后RT-qPCR检测各组细胞中TAZ，CTGF，Cyr61的mRNA表达水平；③转染siTAZ后western blot检测各组细胞中TAZ，CTGF，Cyr61，Smad3和Smad4的蛋白表达水平；④转染siTAZ后MTT法和BrdU法检测各组细胞的体外增殖情况。

1.6 统计学分析 实验数据采用Image J软件进行采集，利用统计软件 GraphPad Prism分析，所得数据用x(_)±s表示，进行t 检验或单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

人牙髓干细胞作为人类重要的一类干细胞，由于具有自我更新、多向分化潜能和相对容易获得等特点而成为组织工程领域具有应用前景的人体干细胞。该类干细胞具有以下优势：①可以从患者自身获得，获取方法简单，不存在异体排斥问题^[18]；②整个获取过程为非侵入性操作，不存在伦理方面的问题^[19-20]；③获取途径相对简单，可作为间充质干细胞的重要替代细胞^[18]。尽管目前还鲜有关于牙髓干细胞用于临床试验的报道，但是相关领域科研工作者已指出，牙髓干细胞有望应用于临床研究和疾病治疗^[21-24]。

TAZ作为存在于人体细胞中的一种重要转录因子，其参与了人体多种组织的发育过程^[13^，¹⁶^，^25]，尤其在调控细胞增殖和凋亡方面起着无可替代的作用^[26-28]。目前已有研究证实过表达TAZ可以促进发育成熟的乳腺内皮细胞的增殖、迁移和转分化过程等；反之，沉默TAZ的表达则能够明显阻碍乳腺内皮细胞的增殖和迁移^[29]。值得注意的是，尽管已有报道证明人牙髓干细胞能表达TAZ，但是TAZ在人牙髓干细胞中的作用及其对人牙髓干细胞增殖和迁移的影响仍未完全阐明。因此，实验探索了TAZ在人牙髓干细胞发育中的潜在角色和功能。当前的实验结果表明沉默人牙髓干细胞中TAZ的表达可显著抑制人牙髓干细胞的增殖，这与之前的研究报道一致，并为后续的相关机制和应用研究奠定了基础。

尽管作者的研究结果与前期文献报道均一致提示TAZ与细胞的增殖有关^[30]，但其参与调控细胞增殖的分子机制仍有待阐明。CTGF和Cyr61蛋白已被证实为TAZ下游的转录靶点，并参与了细胞发育、分化、增殖、黏附和迁移等一系列重要过程^[31-32]。研究还提示TAZ通过激活靶基因CTGF和Cyr61可以诱导细胞分化^[33]。本研究发现，沉默人牙髓干细胞中TAZ的表达，其下游靶基因CTGF和Cyr61的mRNA和蛋白水平均显著下调。以上结果均证明了TAZ对人牙髓干细胞增殖的调控可能是通过调节其下游靶基因CTGF和Cyr61的表达水平来实现的。

在肿瘤的形成和侵袭过程中，CTGF和Cyr61可作为TGF?β信号通路的靶基因来发挥对肿瘤生物学行为的影响^[34-35]。同时，Smad3和Smad4被认为参与了许多TGF?β信号通路介导的细胞过程^[30]。本研究结果显示在TAZ被沉默后，Smad3和Smad4的表达受到显著抑制，提示TGF?β信号通路受到TAZ的调控。

总之，研究结果证明TAZ能够调节人牙髓干细胞的体外增殖过程，而且其可能是通过TGF?β信号通路介导进而调节其下游CTGF和Cyr61的表达来实现的。这为后期对人牙髓干细胞的研究提供理论线索，但是更详细的分子机制和调控过程还需要在后续的研究中加以阐明。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程