乙醛脱氢酶3B1在人骨髓间充质干细胞自然衰老过程中的表达

doi:10.12307/2022.007

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (1): 40-44.doi: 10.12307/2022.007

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乙醛脱氢酶3B1在人骨髓间充质干细胞自然衰老过程中的表达

麦丽萍，何国东，陈少贤，朱杰宁，侯兴华，张梦珍，李晓红

广东省人民医院，广东省医学科学院医学研究部，广东省华南结构性心脏病重点实验室，广东省广州市 510080

收稿日期:2021-01-06 修回日期:2021-01-08 接受日期:2021-02-18 出版日期:2022-01-08 发布日期:2021-10-23
通讯作者: 李晓红，副研究员，广东省人民医院，广东省医学科学院医学研究部，广东省华南结构性心脏病重点实验室，广东省广州市 510080
作者简介:麦丽萍，女，1985 年生，广东省广州市人，汉族，硕士，主管技师，主要从事药理学相关研究。
基金资助:
广东省医学科学技术研究基金项目(A2019287)，项目负责人：麦丽萍；广东省自然科学基金项目 (2018A0303130266)，项目负责人：李晓红

Expression of aldehyde dehydrogenase 3B1 during human bone marrow mesenchymal stem cells senescence

Mai Liping, He Guodong, Chen Shaoxian, Zhu Jiening, Hou Xinghua, Zhang Mengzhen, Li Xiaohong

Department of Medical Research, Guangdong Provincial People’s Hospital, Guangdong Academy of Medical Sciences, Guangdong Provincial Key Laboratory of South China Structural Heart Disease, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China

Received:2021-01-06 Revised:2021-01-08 Accepted:2021-02-18 Online:2022-01-08 Published:2021-10-23
Contact: Li Xiaohong, Associate researcher, Department of Medical Research, Guangdong Provincial People’s Hospital, Guangdong Academy of Medical Sciences, Guangdong Provincial Key Laboratory of South China Structural Heart Disease, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China
About author:Mai Liping, Master, Technician-in-charge, Department of Medical Research, Guangdong Provincial People’s Hospital, Guangdong Academy of Medical Sciences, Guangdong Provincial Key Laboratory of South China Structural Heart Disease, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China
Supported by:
Guangdong Medical Science and Technology Research Fund in China, No. A2019287 (to MLP); the Natural Science Foundation of Guangdong in China, No. 2018A0303130266 (to LXH)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
干细胞自然衰老：干细胞具有多能分化和自我更新、损伤修复能力，但其与体细胞一样，在自然增殖过程中会出现衰老，再生能力会随着细胞的衰老而降低，甚至出现功能失调的现象。
细胞衰老：细胞停留在细胞周期G0/G1期，并且无法进入S期，使细胞增殖、分化功能发生衰退的现象。

背景：人骨髓间充质干细胞在体外培养传代过程中存在着细胞老化现象，但其机制尚不明确。乙醛脱氢酶3B1具有抗氧化应激的作用，且氧化应激是导致细胞衰老的重要因素之一。乙醛脱氢酶3B1的表达异常是否与人骨髓间充质干细胞衰老相关尚未见报道。
目的：观察乙醛脱氢酶3B1在人骨髓间充质干细胞衰老过程的表达变化，为探讨干细胞的衰老机制提出新研究方向。
方法：建立人骨髓间充质干细胞自然衰老模型并进行鉴定，Bisulfit甲基化检测衰老前后的乙醛脱氢酶3B1基因表达变化，采用RT-qPCR、免疫荧光和Western blot检测乙醛脱氢酶3B1的mRNA和蛋白表达变化。
结果与结论：①人骨髓间充质干细胞传代扩增培养，β-半乳糖苷酶染色显示阳性细胞不断增多，传至第7-13代时，阳性细胞最为明显；②甲基化测序显示第16代人骨髓间充质干细胞中乙醛脱氢酶3B1的表达下调；③在人骨髓间充质干细胞体外传代过程中乙醛脱氢酶3B1的mRNA和蛋白表达均下调；④结果表明，乙醛脱氢酶3B1在人骨髓间充质干细胞自然衰老中表达下调，但其作用机制还需进一步研究。
https://orcid.org/0000-0001-8644-2376(麦丽萍)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓间充质干细胞, 细胞衰老, 自然衰老, 乙醛脱氢酶3B1, 模型

Abstract: BACKGROUND: Human bone marrow mesenchymal stem cells have the phenomenon of cell aging during passage in vitro, but the mechanism by which it occurs is not yet clear. Aldehyde dehydrogenase 3B1 has antioxidant effect. Oxidative stress is one of the important factors leading to cell senescence. Whether the expression level of aldehyde dehydrogenase 3B1 is related to human bone marrow mesenchymal stem cells senescence is still unclear.
OBJECTIVE: To observe the expression of aldehyde dehydrogenase 3B1 in cellular senescence, providing a new research direction for aging mechanism of stem cells.
METHODS: The natural senescent model of human bone marrow mesenchymal stem cells was established and identified. The mRNA expression of aldehyde dehydrogenase 3B1 in human bone marrow mesenchymal stem cells was detected by bisulfite methylation sequencing and real-time qPCR. The protein level of aldehyde dehydrogenase 3B1 was detected by immunofluorescence and western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Human bone marrow mesenchymal stem cells were cultured in subculture. β-Galactosidase staining showed that positive cells increased continuously, and the positive cells were the most obvious at passage 7 to 13. (2) Methylation sequencing showed that in passage 16 human bone marrow mesenchymal stem cells, the methylation level of aldehyde dehydrogenase 3B1 was down regulated. (3) The mRNA and protein levels of aldehyde dehydrogenase 3B1 were down regulated during the passage of human bone marrow mesenchymal stem cells in vitro. (4) The results show that aldehyde dehydrogenase 3B1 is down regulated in the natural senescence of human bone marrow mesenchymal stem cells, but its mechanism needs further study.

Key words: stem cells, bone marrow mesenchymal stem cells, cellular senescence, natural senescence, aldehyde dehydrogenase 3B1, model

中图分类号:

麦丽萍, 何国东, 陈少贤, 朱杰宁, 侯兴华, 张梦珍, 李晓红. 乙醛脱氢酶3B1在人骨髓间充质干细胞自然衰老过程中的表达[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 40-44.

Mai Liping, He Guodong, Chen Shaoxian, Zhu Jiening, Hou Xinghua, Zhang Mengzhen, Li Xiaohong. Expression of aldehyde dehydrogenase 3B1 during human bone marrow mesenchymal stem cells senescence[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(1): 40-44.

图/表（结果） 5

参考文献

[1] 袁宇,徐林.骨髓间充质干细胞联合3D生物打印技术治疗骨缺损的研究进展[J].中国医学物理学杂志,2021,38(1):110-126.
[2] PROCKOP DJ. “Stemness” does not explain the repair of many tissues by mesenchymal stem/multipotent stromal cells (MSCs). Clin Pharmacol Ther. 2007;82(3):241-243.
[3] 姜涛,马磊,李志强,等.血小板衍生生长因子BB诱导骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化[J].中国组织工程研究,2021,25(25):3937-3942.
[4] SUBBURAYAN K, THAYYULLATHIL F, PALLICHANKANDY S, et al. Par-4-dependent p53 up-regulation plays a critical role in thymoquinone-induced cellular senescence in human malignant glioma cells. Cancer Lett. 2018;426: 80-97.
[5] ITO A, AOYAMA T, YOSHIZAWA M, et al. The effects of short-term hypoxia on human mesenchymal stem cell proliferation, viability and p16(INK4A) mRNA expression: Investigation using a simple hypoxic culture system with a deoxidizing agent. J Stem Cells Regen Med. 2015;11(1):25-31.
[6] LEGZDINA D, ROMANAUSKA A, NIKULSHIN S, et al. Characterization of Senescence of Culture-expanded Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells. Int J Stem Cells. 2016;9(1):124-136.
[7] ALESSIO N, STELLAVATO A, SQUILLARO T, et al. Hybrid complexes of high and low molecular weight hyaluronan delay in vitro replicative senescence of mesenchymal stromal cells: a pilot study for future therapeutic application. Aging (Albany NY). 2018;10(7):1575-1585.
[8] HOLMES RS. Biochemical genetics of opossum aldehyde dehydrogenase 3: evidence for three ALDH3A-like genes and an ALDH3B-like gene. Biochem Genet. 2010;48(3-4):287-303.
[9] MARCHITTI SA, ORLICKY DJ, BROCKER C, et al. Aldehyde dehydrogenase 3B1 (ALDH3B1): immunohistochemical tissue distribution and cellular-specific localization in normal and cancerous human tissues. J Histochem Cytochem. 2010;58(9):765-783.
[10] XIA Z, SHANG H, CHOLEWA J, et al. The Effect of Exercise on Gene Expression and Signaling in Mouse Melanoma Tumors. Med Sci Sports Exerc. 2020; 52(7):1485-1494.
[11] NIU H, HADWIGER G, FUJIWARA H, et al. Pathways of retinoid synthesis in mouse macrophages and bone marrow cells. J Leukoc Biol. 2016;99(6):797-810.
[12] PARK SB, HWANG KT, CHUNG CK, et al. Causal Bayesian gene networks associated with bone, brain and lung metastasis of breast cancer. Clin Exp Metastasis. 2020;37(6):657-674.
[13] 刘雨薇,曲艺,颜晓菁.ALDH3B1在急性淋巴细胞白血病中的表达及意义[J].中国医科大学学报,2019,48(10):896-900.
[14] SUN H, ZHANG M, LI L, et al. ALDH3B1 Is an Independent Prognostic Biomarker of Lung Adenocarcinoma. Technol Cancer Res Treat. 2020;19: 1533033820946018.
[15] KITAMURA T, NAGANUMA T, ABE K, et al. Substrate specificity, plasma membrane localization, and lipid modification of the aldehyde dehydrogenase ALDH3B1. Biochim Biophys Acta. 2013;1831(8):1395-1401.
[16] ZHOU L, CHEN X, LIU T, et al. SIRT1-dependent anti-senescence effects of cell-deposited matrix on human umbilical cord mesenchymal stem cells. J Tissue Eng Regen Med. 2018;12(2):e1008-e1021.
[17] RATUSHNYY AY, RUDIMOVA YV, BURAVKOVA LB. Replicative Senescence and Expression of Autophagy Genes in Mesenchymal Stromal Cells. Biochemistry (Mosc). 2020;85(10):1169-1177.
[18] BERTOLO A, GUERRERO J, STOYANOV J. Autofluorescence-based sorting removes senescent cells from mesenchymal stromal cell cultures. Sci Rep. 2020;10(1):19084.
[19] BANIMOHAMAD-SHOTORBANI B, KAHROBA H, SADEGHZADEH H, et al. DNA damage repair response in mesenchymal stromal cells: From cellular senescence and aging to apoptosis and differentiation ability. Ageing Res Rev. 2020;62:101125.
[20] VONO R, JOVER GARCIA E, SPINETTI G, et al. Oxidative Stress in Mesenchymal Stem Cell Senescence: Regulation by Coding and Noncoding RNAs. Antioxid Redox Signal. 2018;29(9):864-879.
[21] KORNICKA K, HOUSTON J, MARYCZ K. Dysfunction of Mesenchymal Stem Cells Isolated from Metabolic Syndrome and Type 2 Diabetic Patients as Result of Oxidative Stress and Autophagy may Limit Their Potential Therapeutic Use. Stem Cell Rev Rep. 2018;14(3):337-345.
[22] CAKOUROS D, GRONTHOS S. The changing epigenetic landscape of Mesenchymal Stem/Stromal Cells during aging. Bone. 2020;137:115440.
[23] JUNG KJ, LEE GW, PARK CH, et al. Mesenchymal Stem Cells Decrease Oxidative Stress in the Bowels of Interleukin-10 Knockout Mice. Gut Liver. 2020;14(1):100-107.
[24] YU K, ZENG Z, CHENG S, et al. TPP1 Enhances the Therapeutic Effects of Transplanted Aged Mesenchymal Stem Cells in Infarcted Hearts via the MRE11/AKT Pathway. Front Cell Dev Biol. 2020;8:588023.
[25] CASADO-DÍAZ A, ANTER J, DORADO G, et al. Effects of quercetin, a natural phenolic compound, in the differentiation of human mesenchymal stem cells (MSC) into adipocytes and osteoblasts. J Nutr Biochem. 2016;32:151-162.
[26] ZHANG DY, PAN Y, ZHANG C, et al. Wnt/β-catenin signaling induces the aging of mesenchymal stem cells through promoting the ROS production. Mol Cell Biochem. 2013;374(1-2):13-20.
[27] JUNG YH, LEE HJ, KIM JS, et al. EphB2 signaling-mediated Sirt3 expression reduces MSC senescence by maintaining mitochondrial ROS homeostasis. Free Radic Biol Med. 2017;110:368-380.
[28] 吴奇,王顺,程霄,等.神经干细胞衰老与核因子E2相关因子2/抗氧化反应元件信号通路的关系[J].解剖学报,2020,51(6):815-820.
[29] MARCHITTI SA, BROCKER C, ORLICKY DJ, et al. Molecular characterization, expression analysis, and role of ALDH3B1 in the cellular protection against oxidative stress. Free Radic Biol Med. 2010;49(9):1432-1443.
[30] KITAMURA T, TAKAGI S, NAGANUMA T, et al. Mouse aldehyde dehydrogenase ALDH3B2 is localized to lipid droplets via two C-terminal tryptophan residues and lipid modification. Biochem J. 2015;465(1):79-87.
[31] JEFF JM, ARMSTRONG LL, RITCHIE MD, et al. Admixture mapping and subsequent fine-mapping suggests a biologically relevant and novel association on chromosome 11 for type 2 diabetes in African Americans. PLoS One. 2014;9(3):e86931.
[32] CHEN G, ZHANG Y, YU S, et al. Bmi1 Overexpression in Mesenchymal Stem Cells Exerts Antiaging and Antiosteoporosis Effects by Inactivating p16/p19 Signaling and Inhibiting Oxidative Stress. Stem Cells. 2019;37(9):1200-1211.
[33] MA C, SUN Y, PI C, et al. Sirt3 Attenuates Oxidative Stress Damage and Rescues Cellular Senescence in Rat Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells by Targeting Superoxide Dismutase 2. Front Cell Dev Biol. 2020;8:599376.
[34] KHANH VC, YAMASHITA T, OHNEDA K, et al. Rejuvenation of mesenchymal stem cells by extracellular vesicles inhibits the elevation of reactive oxygen species. Sci Rep. 2020;10(1):17315.

引言

骨髓间充质干细胞具有多向分化功能和较强的可塑性，目前被认为是细胞移植中理想的种子细胞之一。骨髓间充质干细胞可诱导分化为成骨细胞，修复骨缺损[1]，还可以分泌血管内皮细生长因子、血小板源性生长因子等，改变组织微环境，参与皮肤组织工程创面的修复[2-3]，但骨髓间充质干细胞在体外培养中出现增殖抑制等衰老特征，影响其在临床中的进一步应用。越来越多科学家开始对骨髓间充质干细胞的衰老机制进行研究，阻止细胞衰老的发生，如通过低氧培养或转染癌基因等方法，但成功率不高。
关于骨髓间充质干细胞的衰老研究，目前认为与特异性基因相关[4-7]。在细胞体外培养过程中，端粒缩短性老化与应激性过早老化两种因素可能导致细胞衰老的发生，目前认为p53-p21-pRb通路主要介导端粒缩短衰老，而p16-pRb通路则主要介导应激性过早老化。CDK2b基因编码细胞周期依赖性激酶阻滞剂，参与肿瘤细胞和骨髓间充质干细胞的衰老，转化生长因子β可以诱导CDK2b基因表达上调，但其机制尚不明确。
乙醛脱氢酶是细胞内一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)依赖的酶家族，参与了多种生物学过程[8-9]。乙醛脱氢酶3B1(aldehyde dehydrogenases 3B1，ALDH3B1)是乙醛脱氢酶家族中的一员，主要定位在细胞浆，在人体肺、前列腺、肾脏以及一些肿瘤中均可表达，参与慢性疾病、肺癌、急性淋巴细胞白血病等疾病的发生与发展[10-14]。乙醛脱氢酶3B1与活性氧的代谢相关，细胞内活性氧超负荷会增加氧化应激，导致生物体中蛋白质和DNA发生改变，醛类物质增多，而乙醛脱氢酶3B1可通过代谢多种醛类减弱氧化应激的作用[15]。
研究表明，氧化应激与干细胞衰老相关，H2O2可通过抑制Sirt1进而上调p16和p21的表达，诱发人脐带间充质干细胞早衰[16]，但乙醛脱氢酶3B1在衰老中的表达极少报道。该研究拟通过建立自然衰老模型，观察乙醛脱氢酶3B1在人骨髓间充质干细胞衰老过程中的表达变化。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞模型，乙醛脱氢酶3B1的mRNA和蛋白表达变化采用t检验分析。
1.2 时间及地点实验于2018年10月至2020年11月在广东省人民医院医学研究部完成。
1.3 材料
1.3.1 细胞株人骨髓间充质干细胞株购买自赛业生物科技有限公司，货号：HUXMA-01001，已有质检报告。
1.3.2 实验试剂和仪器 0.25% Trypsin-EDTA(GIBCO公司，美国，货号：25200056)；胎牛血清(GIBCO公司，美国，货号：10099141C)；PBS(GIBCO公司，美国，货号：C20012500BT)；细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒(Cell signaling technology公司，美国，货号：9860s)；TRIZOL(Invitrogen公司，美国，货号：15596026)；PrimeScript RT master mix (TaKaRa公司，日本，货号：RR036A)；SYBR Premix EX TaqTM Ⅱ(TaKaRa公司，日本，货号：RR820A)；RIPA(Millipore，美国，货号：20-188 )；变性预制SDS-PAGE凝胶(南京金斯瑞生物科技有限公司，中国，货号：M00652)；乙醛脱氢酶3B1抗体(Absin公司，中国，货号：abs111723，种属：兔)；β-actin抗体(Cell Signaling Technology公司，美国，货号：4970s ，种属：兔)；辣根过氧化物酶标记抗体(Jackson ImmunoResearch公司，美国，货号：111-035-003，种属：山羊)； BCA蛋白浓度测定试剂盒(Thermo公司，美国，货号：23225)；荧光定量PCR仪(Bio-Rad公司，美国，型号：CFX connect )；荧光显微镜(Nikon公司，型号：TI-S )。
1.4 实验方法
1.4.1 人骨髓间充质干细胞衰老全基因组Bisulfite甲基化测序课题组前期对原代和第16代人骨髓间充质干细胞分别进行全基因组Bisulfite甲基化测序，基因组DNA经过超声后得到100-300 bp片段，末端修复后进行Bisulfite处理、脱盐处理，选择文库片段，进行全基因组Bisulfite甲基化测序(广州基迪奥生物科技有限公司)，分析差异的甲基化区域(differentially
methylated regions，DMRs)。
1.4.2 β-半乳糖苷酶染色检测人骨髓间充质干细胞体外增殖过程中的动态衰老变化细胞传代至第1，3，5，7，9，11，13代，分别进行β-半乳糖苷酶染色，每代需要染色的细胞培养于30 mm培养皿内，细胞生长融合度约为80%时，弃去培养基；加入2 mL PBS至培养皿中，轻微摇晃后弃去；加入1 mL固定液，室温静置15 min后弃去；加入2 mL PBS轻轻摇晃后弃去；加入1 mL β-半乳糖苷酶染色剂B液，盖上培养皿的盖子，使用封口膜包裹边缘，密封培养皿。将培养皿放入37 ℃培养箱中孵育过夜(约12 h)；孵育完成后取
出，光学显微镜下观察细胞染色情况；β-半乳糖苷酶染色阳性细胞呈蓝色；观察5个不同区域β-半乳糖苷酶染色阳性细胞占全部细胞的比例，随机拍照保存。
1.4.3 Real time-PCR 检测人骨髓间充质干细胞体外增殖过程中乙醛脱氢酶3B1基因的表达待第3，7，13代细胞生长融合度约为80%时，分别收集细胞；TRIZOL法进行细胞总RNA提取：先用预冷PBS洗细胞3次，在30 mm培养皿中加入1 mL Trizol室温裂解5 min，将样品收集于EP管中，加入0.2 mL氯仿，剧烈振荡15 s，室温放置5 min，4 ℃，
12 000×g离心15 min，将上层无色水相层(约500 μL)转移至另一EP 管中，加入0.5 mL异丙醇，室温放置10 min，4 ℃，12 000×g离心10 min，使RNA沉淀，弃上清，加入1 mL体积分数为75%乙醇洗涤沉淀，4 ℃，7 500×g离心5 min，空气干燥或真空干燥 RNA，用 20 μL无核酶水溶解RNA。使用NANODROP 1000 spectrophotometer测定总RNA浓度，选择纯度值>1.8的总RNA，使用Prime Script RT master mix试剂进行反转录实验，反应体系为20 μL，生成cDNA，使用SYBR Premix EX TaqTM Ⅱ试剂进行Q-PCR检测，反应体系为10 μL，
退火温度为 58 ℃。实验重复3次。各基因引物序列如下：
乙醛脱氢酶3B1-F-Primer：5'-CGA GGC CAT CGA GTT CAT CA-3'；
乙醛脱氢酶3B1-R-Primer：5'-GTC ATG TGC ATG AAG CCG TC-3'。
β-actin-F-Primer：5'-GCC AAC ACA GTG CTG TCT G-3'；
β-actin-R-Primer：5'-TAC TCC TGC TTG CTG ATC CA-3'。
1.4.4 Western blot检测人骨髓间充质干细胞体外增殖过程中乙醛脱氢酶3B1蛋白的表达细胞自然传代，待第3，7，13代细胞生长融合度约80%时，用 4 ℃ PBS洗3次，加入适量 RIPA冰上裂解细胞约30 min；刮下细胞，收集裂解液，4 ℃ 12 000 r/min离心15 min，吸取上清液，-80 ℃保存备用。取少量蛋白，BCA法进行蛋白定量后，将总蛋白上样量调成一
致；使用变性预制SDS-PAGE凝胶进行电泳，电压调至110 V，电泳90 min；卸下电泳胶，转膜，200 mA 恒流电流，电转90 min；随后将转上蛋白的PVDF膜用5%脱脂奶粉室温封闭1 h；孵育一抗(1∶1 000)，4 ℃冰箱过夜；次日，TBST洗膜3次，5 min/次；室温孵育二抗(1∶5 000)1 h；TBST洗膜3次，5 min/次；ECL发光、显影和曝光。以β-actin作为内参。
1.4.5 细胞免疫荧光检测人骨髓间充质干细胞体外增殖过程中乙醛脱氢酶3B1基因的表达细胞自然传代，待第3，7，13代细胞生长融合度约为80%时，去除培养基，PBS洗3次；40 g/L多聚甲醛室温固定15 min；PBS洗3次，5 min/次；室温下0.2% TritonX-100通透15 min；室温下4%BSA/0.2% TritonX-100封闭30 min；去除多余液体；加入兔来源单克隆乙醛脱氢酶3B1一抗，4 ℃孵育过夜；PBS清洗3次，
5 min/次；去除多余液体；加入羊抗兔二抗，室温下避光孵育
1 h，PBS清洗3次，5 min/次；去除多余液体；DAPI复染细胞核后封固；荧光显微镜下观察细胞并随机拍照。
1.5 主要观察指标 ①β-半乳糖苷酶染色观察人骨髓间充质干细胞体外增殖过程中衰老动态变化；②RT-qPCR、免疫荧光和Western blot检测第3，7，13代人骨髓间充质干细胞中乙醛脱氢酶3B1的mRNA和蛋白表达。
1.6 统计学分析采用 SPSS 22.0统计软件进行数据分析，所有数据均以x±s表示，组间均数比较采用t检验分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

骨髓间充质干细胞在体外易于获得和分离，且具有自我更新、多向分化能力和低免疫原性，已成为细胞治疗领域极具吸引力的供体细胞之一，是细胞治疗和再生医学的重要资源。骨髓间充质干细胞在体外增殖能力极强，但经过一定数量的传代后，会出现增殖抑制等衰老现象，其形态、生物学特征以及表观遗传特征等均有不同程度的变化[17-18]，这些因素都为骨髓间充质干细胞的临床应用增加了难度和不确定因素。该研究结果显示：人骨髓间充质干细胞自然传代至第7代时，细胞体积逐代增大，胞质铺开，形态变得扁平，生长速度减慢；β-半乳糖苷酶染色阳性率开始增多，提示人骨髓间充质干细胞在体外增殖过程中发生衰老，细胞传代越多，衰老越明显。关于人骨髓间充质干细胞衰老发生发展的机制，目前尚未明确。有学者认为，细胞衰老与氧化应激、细胞增殖、端粒缩短和形态改变有关[19-20]。氧化应激是衰老的主要原因之一，自然衰老过程总是伴随着内源性氧化应激水平的升高和外源性氧化剂的作用，导致细胞衰老的发生。
人骨髓间充质干细胞长期暴露于氧化环境中会导致细胞衰老和功能障碍。氧化应激可能降低线粒体活性，引起细胞衰老，参与多种慢性疾病和肿瘤的发生和发展[21-23]。H2O2可降低p-AKT和p-ERK表达，使cleaved caspase-3和PARP1表
达上调，引起间充质干细胞损伤。
目前，衰老与氧化应激相关的分子机制研究热点目前集中在AKT/mTOR、Sirt3、Nrf2、Wnt/β-catenin信号通路[24-26] 。
Sirt3可使细胞线粒体内活性氧水平降低，延缓间充质干细胞衰老的发生[27]。神经干细胞衰老与抑制Nrf2/ARE抗氧化信号通路相关[28]。
乙醛脱氢酶家族由19个成员组成，可以存在于不同的染色体上。乙醛脱氢酶作为一种催化酶，参与体内各种脂类和氨基酸代谢，能催化醛类氧化成反应性较低的羧酸，减轻醛类诱导的细胞毒性。乙醛脱氢酶3B1是乙醛脱氢酶家族中的一员，与细胞内活性氧的代谢相关，可通过代谢多种醛类，清除细胞内活性氧，在抗氧化应激中发挥作用。研究表明，4-羟基壬烯醛可上调ARPE-19细胞中乙醛脱氢酶3B1蛋白的表达，减轻氧化应激对细胞的损伤[29]。乙醛脱氢酶3B1参与慢性退行性疾病和肿瘤的发生与发展，可能与其抗氧化应激能力减退相关[30-31]。课题组对人骨髓间充质干细胞衰老全基因组Bisulfite甲基化测序发现，第16代人骨髓间充质干细胞中乙醛脱氢酶3B1的表达下调。衰老与机体的氧化应激相关，Sirt3通过减轻活性氧诱导的损伤以及上调超氧化物酶2的表达和活性来抑制间充质干细胞自然衰老。p16/p19信号失活能抑制氧化应激发挥抗间充质干细胞衰老的作用[32-34]。该研究结果表明，乙醛脱氢酶3B1在人骨髓间充质干细胞体外增殖中表达下调，与干细胞衰老相关；由此推测，人骨髓间充质干细胞在体外传代过程中，伴随着内源性氧化应激水平的升高，同时长期暴露于外源性氧化环境中，细胞内活性氧超负荷，导致生物体中蛋白质和DNA发生改变，醛类物质增多，乙醛脱氢酶3B1表达降低，未能通过代谢多种醛类减弱氧化应激的作用，促进了细胞的衰老；上调乙醛脱氢酶3B1表达，或许能延缓细胞衰老的发生，但其衰老表型和分子机制尚待进一步研究。
综上所述，该研究初步验证了乙醛脱氢酶3B1在人骨髓间充质干细胞自然衰老中表达下调，为下一步研究乙醛脱氢酶3B1在人骨髓间充质干细胞衰老中的作用机制奠定基础，减轻干细胞衰老，对推动干细胞的临床应用具有重要意义。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

乙醛脱氢酶3B1在人骨髓间充质干细胞自然衰老过程中的表达

Expression of aldehyde dehydrogenase 3B1 during human bone marrow mesenchymal stem cells senescence

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[1]	谭新访, 郭艳幸, 秦晓飞, 张斌清, 赵东亮, 潘琨琨, 李瑜卓, 陈皓宇. 顺轴疲劳运动对兔髌股关节软骨损伤的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(在线): 1-6.
[2]	王宝娟, 郑曙光, 张琪, 李田洋. 苗药熏蒸治疗膝骨关节炎模型兔可延缓细胞外基质的破坏[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1236-1242.
[3]	吕依妍, 李寒冰, 马晓庆, 张晗, 张宇航, 李根林. 采用复合因素建立内热消渴小鼠模型的特点分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1243-1249.
[4]	陈世坚, 李舸, 张钰, 关雅伦, 李雪娇, 刘书华, 李永超, 李韵峰, 高金风, 魏小月, 赵宇红. MPTP诱导帕金森病小鼠亚急性与慢性模型的比较及评价[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1303-1308.
[5]	王景, 熊山, 曹金, 冯林伟, 王信. 白细胞介素3在骨代谢中的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1316-1322.
[6]	肖豪, 刘静 , 周君. 脉冲电磁场治疗绝经后骨质疏松症的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1323-1329.
[7]	朱婵, 韩栩珂, 姚承佼, 张强, 刘静, 邵明. 针刺治疗帕金森病：动物实验显示的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1330-1335.
[8]	安维政, 何萧, 任帅, 刘建宇. 肌源干细胞在周围神经再生中的潜力[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1183-1190.
[9]	范一鸣, 刘方煜, 张洪宇, 李帅, 王岩松. 脊髓损伤后室管膜区内源性神经干细胞反应的系列问题[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1191-1197.
[10]	梁学振, 杨曦, 李嘉程, 骆帝, 许波, 李刚. 补肾活血胶囊介导Hedgehog信号通路调控大鼠骨髓间充质干细胞成骨成脂分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1068-1074.
[11]	王继芳, 鲍祯, 乔亚红. miR-206调控小细胞肺癌干细胞EVI1基因表达及细胞生物学行为[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1075-1079.
[12]	刘峰, 彭宇环, 罗良平, 吴本清. 植物源性碱性成纤维细胞生长因子维持人胚胎干细胞的生长与分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1080-1085.
[13]	闻丹丹, 李强, 沈才齐, 纪哲, 金培生. 外用红色诺卡氏菌细胞壁骨架提高脂肪间充质干细胞活性修复糖尿病创面[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1086-1092.
[14]	朱兵兵, 邓江华, 陈晶晶, 慕晓玲. 白细胞介素8受体可提高脐带间充质干细胞迁移和向损伤内皮的黏附[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1093-1098.
[15]	罗小玲, 张丽, 杨茂桦, 徐洁, 徐晓梅. 柚皮素干预人牙周膜干细胞的成骨分化能力[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1099-1104.