骨髓间充质干细胞诱导为类许旺细胞的细胞外基质促进周围神经损伤后轴突再生

doi:10.12307/2022.006

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (1): 33-39.doi: 10.12307/2022.006

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骨髓间充质干细胞诱导为类许旺细胞的细胞外基质促进周围神经损伤后轴突再生

赵来赫1，夏冰2，马腾2，高楗勃3，李胜友2，高雪4，郑毅1，胡广文3，罗卓荆2，黄景辉2

1空军军医大学，陕西省西安市 710032；2空军军医大学第一附属医院，陕西省西安市 710032；3解放军32117部队卫生连，吉林省临江市 134600；4西北大学，陕西省西安市 710069

收稿日期:2020-10-20 修回日期:2020-10-23 接受日期:2020-12-25 出版日期:2022-01-08 发布日期:2021-10-23
通讯作者: 罗卓荆，博士，主任医师，教授，空军军医大学第一附属医院，陕西省西安市 710032 黄景辉，博士，副主任医师，副教授，空军军医大学第一附属医院，陕西省西安市 710032
作者简介:赵来赫，男，1994年生，辽宁省本溪市人，汉族，2018年空军军医大学毕业，医师，主要从事骨科及神经再生方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81730065)，项目负责人：罗卓荆；国家自然科学基金(81672148)，项目负责人：黄景辉；国家自然科学基金(81802143)，项目负责人：马腾

Extracellular matrix of Schwann-like cells induced by bone marrow mesenchymal stem cells promotes axonal regeneration after peripheral nerve injury

Zhao Laihe1, Xia Bing2, Ma Teng2, Gao Jianbo3, Li Shengyou2, Gao Xue4, Zheng Yi1, Hu Guangwen3, Luo Zhuojing2, Huang Jinghui2

1Air Force Medical University, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China; 2First Affiliated Hospital of Air Force Medical University, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China; 3Health Company of PLA 32117, Linjiang 134600, Jilin Province, China; 4Northwest University, Xi’an 710069, Shaanxi Province, China

Received:2020-10-20 Revised:2020-10-23 Accepted:2020-12-25 Online:2022-01-08 Published:2021-10-23
Contact: Luo Zhuojing, MD, Chief physician, Professor, First Affiliated Hospital of Air Force Medical University, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China Huang Jinghui, MD, Associate chief physician, Associate professor, First Affiliated Hospital of Air Force Medical University, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China
About author:Zhao Laihe, Physician, Air Force Medical University, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81730065 (to LZJ), No. 81672148 (to HJH), No. 81802143 (to MT)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

骨髓间充质干细胞诱导的许旺细胞：骨髓间充质干细胞经碱性成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子等诱导因子诱导分化为形态功能与许旺细胞类似的细胞。
细胞外基质：由细胞分泌到细胞外间质中的大分子物质，构成复杂的网架结构，支持并连接组织结构，调节组织的发生和细胞的生理活动。

背景：既往研究发现许旺细胞及骨髓间充质干细胞诱导的类许旺细胞可以促进外周神经损伤后轴突的再生及功能恢复，而由于许旺细胞来源有限而限制了其应用，而且类许旺细胞外基质用于周围神经损伤的治疗鲜有报道。
目的：探讨类许旺细胞外基质是否有助于周围神经损伤后的神经修复。
方法：提取SD大鼠许旺细胞和骨髓间充质干细胞，将骨髓间充质干细胞诱导分化为类许旺细胞，并进行细胞鉴定和制备细胞外基质，在体外环境下将背根神经节神经元和背根神经节组织块接种于细胞外基质上，观察神经轴突生长情况。制备SD大鼠坐骨神经缺损模型，分别用自体神经、类许旺细胞外基质复合聚ε-己内酯导管(诱导组)、许旺细胞外基质复合聚ε-己内酯导管(许旺组)桥接，观察坐骨神经轴突再生及腓肠肌恢复情况。

结果与结论：①与骨髓间充质干细胞比较，类许旺细胞p75NTR明显表达(P < 0.05)，许旺细胞纯度为(95.20±4.63)%；②类许旺细胞外基质和许旺细胞外基质能够在体外环境下促进背根神经节神经元与组织块神经轴突的生长；③体内实验中自体神经组再生神经纤维连贯且排列有序；诱导组和许旺组再生神经纤维贯通缺损区域，与自体神经组类似；④结果表明，类许旺细胞和许旺细胞的细胞外基质能够促进周围神经损伤后轴突再生及修复，为周围神经损伤提供了一种新的来源方便的无细胞疗法。

https://orcid.org/0000-0002-1574-2256(赵来赫)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓间充质干细胞, 诱导, 类许旺细胞, 许旺细胞, 细胞外基质, 外周神经损伤

Abstract: BACKGROUND: Previous studies have found that Schwann cells and bone marrow mesenchymal stem cells-derived Schwann cells can promote axonal regeneration and functional recovery after peripheral nerve injury. However, the shortage of Schwann cells limited its application. Schwann-like cells-derived extracellular matrix is rarely reported in the treatment of peripheral nerve injury.
OBJECTIVE: To investigate whether Schwann-like cells-derived extracellular matrix contributes to nerve repair after peripheral nerve injury.
METHODS: Schwann cells and bone marrow mesenchymal stem cells were extracted from SD rats and the latter were induced into Schwann-like cells, then both were identified to prepare extracellular matrix. In vitro, dorsal root ganglion neurons and dorsal root ganglion tissue blocks were seeded on extracellular matrix to observe the growth of dorsal root ganglion axons. The sciatic nerve defect models of SD rats were established. The sciatic nerve axon regeneration and gastrocnemius muscle recovery were observed by using autologous nerve, Schwann-like cells-derived extracellular matrix composite poly(ε-caprolactone) conduit (induction group) and Schwann cells-derived extracellular matrix composite poly(ε-caprolactone) conduit (Schwann group) respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The expression of p75NTR in Schwann-like cells was significantly higher than that in bone marrow mesenchymal stem cells (P < 0.05). The purity of Schwann cells was (95.20±4.63)%. (2) Schwann-like cells-derived extracellular matrix and Schwann cells-derived extracellular matrix could promote the growth of nerve axons in dorsal root ganglion tissue block in vitro. (3) In vivo experiment, regenerated nerve fibers in autologous nerve group were continuous and orderly arranged; regenerated nerve fibers in induction group and Schwann group penetrated through the defect area, similar to that in the autologous nerve group. (4) The results showed that Schwann-like cells-derived extracellular matrix and Schwann cells-derived extracellular matrix could promote axon regeneration and repair after peripheral nerve injury, which provided a new and convenient cell-free therapy for peripheral nerve injury.

Key words: stem cells, bone marrow mesenchymal stem cells, induction, Schwann-like cells, Schwann cells, extracellular matrix, peripheral nerve injury

中图分类号:

赵来赫, 夏冰, 马腾, 高楗勃, 李胜友, 高雪, 郑毅, 胡广文, 罗卓荆, 黄景辉. 骨髓间充质干细胞诱导为类许旺细胞的细胞外基质促进周围神经损伤后轴突再生[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 33-39.

Zhao Laihe, Xia Bing, Ma Teng, Gao Jianbo, Li Shengyou, Gao Xue, Zheng Yi, Hu Guangwen, Luo Zhuojing, Huang Jinghui. Extracellular matrix of Schwann-like cells induced by bone marrow mesenchymal stem cells promotes axonal regeneration after peripheral nerve injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(1): 33-39.

图/表（结果） 6

2.1 实验动物数量分析实验动物模型选用SD大鼠40只，分为4组，每组10只。所有大鼠均存活，可进入后续的实验分析。
2.2 类许旺细胞和许旺细胞的鉴定结果骨髓间充质干细胞诱导分化为类许旺细胞后进行p75NTR蛋白检测，见图1。与骨髓间充质干细胞比较，类许旺细胞p75NTR明显表达(2.587±0.370 vs. 1±0，P < 0.05)，骨髓间充质干细胞诱导成类许旺细胞后表达许旺细胞标志性蛋白，可进行下一步实验。许旺细胞经纯化培养后进行p75NTR和S100β双标免疫荧光染色及DAPI染色，见图2。S100β和p75NTR双染阳性的细胞鉴定为许旺细胞，实验中许旺细胞的纯度为(95.2 ± 4.63)%。

2.3 类许旺细胞外基质和许旺细胞外基质促进背根神经节神经元及背根神经节组织块神经轴突的生长与对照组(126.30±16.25) μm比较，诱导组[(239.60±13.36) μm，P < 0.01]和许旺组[(336.50±6.08) μm，P < 0.001]背根神经节神经元最长轴突长度显著增加，但是诱导组的背根神经节神经元生长效果不如许旺组(P < 0.01)，见图3。同时，与对照组(2.493±0.246)比较，许旺组(4.160±0.117，P < 0.01)和诱导组(3.750±0.164，P < 0.05)神经轴突总面积/组织块面积显著增加，许旺组组织块神经轴突总面积/组织块面积大于诱导组，但差异无显著性意义。许旺组[(2 732.0±217.1) μm，
P < 0.01]和诱导组[(2 438.0±277.5) μm，P < 0.01]5根最长轴突长度均值大于对照组(1 017.0±16.4) μm，许旺组5根最长轴突长度均值大于诱导组，但差异无显著性意义，见图4。以上数据表明，在体外条件下，类许旺细胞外基质和许旺细胞外基质均能够促进轴突生长，且促进程度相似。

2.4 聚ε-己内酯材料支持细胞生长及细胞外基质覆盖聚ε-己内酯材料纺丝纤维致密缠绕，细胞在聚ε-己内酯表面生长增殖，细胞外基质覆盖整个聚ε-己内酯表面，见图5。扫描电镜图像可见聚ε-己内酯材料能够为细胞提供黏附增殖的位点，在抗坏血酸的作用下细胞能够形成大量细胞外基质覆盖聚ε-己内酯表面。上述结果表明单纯聚ε-己内酯及复合细胞外基质的聚ε-己内酯具有良好的生物相容性。

2.5 类许旺细胞外基质和许旺细胞外基质促进大鼠坐骨神经的再生修复自体神经组再生的神经纤维连贯并且排列有序；诱导组和许旺组神经再生情况明显优于对照组，且再生神经纤维也贯通缺损区域，与自体神经组相类似，诱导组促神经再生作用与许旺组相似，见图6。自体神经组肌肉湿质量比(0.710±0.038)和平均肌纤维面积百分比[(92.33±1.76)%]均大于对照组[0.286±0.040，P < 0.01；(49.00±1.73)%，P < 0.001]；许旺组[0.623±0.023，P < 0.01；(76.33±3.84)%，P < 0.01]和诱导组[0.560±0.035，P < 0.01；(71.33±3.48)%，P < 0.01]也同样高于对照组，诱导组促恢复效果低于许旺组。以上结果表明，在体内条件下类许旺细胞外基质和许旺细胞外基质都能够促进坐骨神经的再生和腓肠肌的恢复，但是类许旺细胞外基质促腓肠肌功能恢复在一定程度上弱于许旺细胞外基质。

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引言

周围神经是一种脆弱且无保护的组织，可因各种物理损伤而受损，包括道路交通事故、建筑事故、自然灾害、战争损害、运动损伤、药物注射损伤和电损伤[1-3]。周围神经损伤会破坏中枢神经系统和靶器官之间的信息传递，从而导致运动、感觉或自主神经功能紊乱，进而失去正常的肢体功能，甚至导致永久性的残疾。在损伤后，周围神经会获得一定的自身修复能力，通常以1-3 mm/d的速度再生[4]。然而，周围神经损伤后的功能恢复有限，对于神经间隙较大的严重损伤，需借助手术修复[5-6]。目前，对于周围神经损伤后未丢失神经组织或者是短节段缺失的，常用的手术方法是端端缝合(神经联合缝合)[7]。长节段缺损则需要植入神经移植物或神经导管，以帮助建立再生通道[8-9]。植入从身体其他部位采集的神经移植物可获得优越的再生效果，是目前公认的金标准技术[10-13]。现代临床通常使用显微外科手术进行自体神经移植[14]，尽管取得了不错的进展，但会导致供体区域的神经功能缺失而限制了其应用。长节段的缺损仍需要生物方法来增强神经再生和改善损伤后的功能，因此，寻找外周神经修复的替代方案仍是研究的重点。影响神经再生修复的关键因素是损伤处轴突再生的速度和残存的许旺细胞数量及增殖分化能力[15]。
在周围神经损伤修复过程中，许旺细胞分泌神经营养因子而对轴突再生发挥作用[16]，也参与重建受损轴突微环境和引导再生轴突延伸等[17]。但由于许旺细胞来源有限、体外培养时间较长、增殖速度较慢、纯化难度大，用于细胞移植则较为困难[18]。骨髓间充质干细胞是从成年后的动物骨髓中分裂和分化而来，体外培养和纯化较容易，来源方便[19]，在适当条件下可分化为许旺细胞，且已有文献报道其经诱导后与许旺细胞具有类似的功能，可用于修复外周神经损伤[20-23]。许旺细胞外基质已被报道具有很好的促神经修复效果[24]，而对于骨髓间充质干细胞诱导分化而来的类许旺细胞外基质是否具有相同的修复功能，则尚未见报道。
在当今再生医学研究中，通常采用生物支架连接神经残端[25]，其可作为运送药物和生长因子的载体。目前的研究发现脱细胞处理后的细胞外基质不仅可以保留原组织结构，还存留大量的生长活性因子，尤其利于细胞的增殖分化，是比任何人工合成材料都理想的生物材料[26]。该研究旨在探讨骨髓间充质干细胞诱导分化的类许旺细胞与许旺细胞分泌的细胞外基质是否有助于周围神经损伤修复并比较二者修复效果。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。
1.2 时间及地点 2019年3月至2020年8月在空军军医大学西京医骨科实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物选取12 d 龄雄性SD大鼠用于提取骨髓间充质干细胞，1 d 龄SD大鼠用于提取背根神经节和许旺细胞；体内实验选用雄性SD大鼠40只，体质量(220±10) g，6-8周龄。所有大鼠均由空军军医大学实验动物中心提供，SPF级，饲养环境适宜，饮水和食物充足，昼夜节律受灯光调节。该实验经空军军医大学动物实验伦理委员会批准(KY20172005-1)，动物许可证号：SCXK(陕)2019-001。
1.3.2 实验主要试剂蛋白提取试剂盒(Solarbio)；胰蛋白酶(Solarbio)；左旋多聚赖氨酸(Sigma)；Triton X-100(Solarbio)；BCA蛋白定量试剂盒(Solarbio)；青霉素-链霉素(Solarbio)；磷酸盐缓冲盐水(Gibico)；聚ε-己内酯(Sigma)；多聚甲醛(Solarbio)；牛血清白蛋白(Solarbio)；β-巯基乙醇(Sigma)；福司可林(Calbiochem)；胎牛血清(Gibico)；全反式维甲酸
(Sigma)；碱性成纤维细胞生长因子(Peprotech)；血小板衍生生长因子(Peprotech)；重组人神经调节蛋白β1(Minneapolis)；
B27(Gibico)；神经生长因子(R & D systems)；谷氨酰胺(Gibico)；
4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(MCE)；内参Actin(Abcam)；NF160鼠单克隆抗体(Abcam)；兔抗大鼠S100β单克隆抗体(Abcam)；β-tubulin-Ⅲ鼠单克隆抗体(Abcam)；鼠抗大鼠p75NTR单克隆抗体(Abcam)；NeuN兔单克隆抗体(Abcam)；山羊抗兔二抗(Proteintech，Alex Fluor 488)；山羊抗兔二抗(Proteintech，Alex Fluor 594)；山羊抗鼠二抗(Proteintech，Alex Fluor 488)；山羊抗鼠二抗(Proteintech，Alex Fluor 594)；DMEM/F12(DMEM和Ham’s F12的1∶1混合物)培养基(HyClone)。
1.3.3 实验主要仪器培养瓶(Thermo)；台式离心机(湖南湘仪)；电泳仪(北京六一)；石蜡切片机(LEICA)；化学凝胶成像仪(Bio-Rad)；荧光显微镜(Zeiss)；转膜仪(北京六一)；共聚显微镜(Nikon)；扫描电子显微镜(Zeiss)。
1.4 实验方法
1.4.1 许旺细胞的提取培养和纯化及骨髓间充质干细胞诱导分化为类许旺细胞取1 d内的新生SD乳鼠，雌雄不限，从椎旁剪断坐骨神经近端及小腿后的神经远端，用0.25%胰酶加Ⅱ型胶原酶置于37 ℃孵箱消化30 min后终止消化，离心后加入含体积分数为10%胎牛血清，2 mmol/L福司可林、20 mg/L牛垂体提取物、青霉素-链霉素的DMEM/F12许旺细胞培养基于37 ℃孵箱培养，得到许旺细胞。
取12 d龄雄性SD大鼠，取出股骨和胫骨，剪去干骺端，用注射器吸取含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养基缓慢插入一端，从另一端冲出骨髓，将细胞悬液种于培养瓶，吸除血块，置于37 ℃细胞孵箱中培养，得到骨髓间充质干细胞，待细胞融合度达到90%传代，第3代时进行类许旺细胞诱导。诱导方法：加入含1 mmol/L β-巯基乙醇的无血清α-MEM培养基，培养1 d后用PBS(0.01 mol/L，pH 7.4)清洗，再加入含体积分数为10%胎牛血清、35 μg/L全反式维甲酸的α-MEM培养基，培养3 d后用PBS(0.01 mol/L，pH 7.4)清洗，再加入含5 μmol/L福司可林、10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、5 μg/L血小板衍生生长因子，200 μg/L重组人神经调节蛋白β1、体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养基培养7 d，得到类许旺细胞[27]。

1.4.2 类许旺细胞和许旺细胞的鉴定类许旺细胞经PBS
(0.01 mol/L，pH 7.4)清洗，用凯基全蛋白提取试剂盒提取蛋白，BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，确定上样量。根据被检测蛋白分子质量43-75 kD确定分离胶浓度为12%，浓缩胶浓度为5%，电泳后转聚偏二氟乙烯膜75 min，5%牛血清白蛋白室温封闭2 h，10 min×3的TBST摇床清洗，加入一抗p75NTR、actin(1∶500)4 ℃摇床过夜，回收一抗，10 min×3
的TBST摇床清洗，室温孵育配制好的二抗山羊抗鼠
(1∶2 000) 1 h，回收二抗，10 min×3的TBST摇床清洗，凝胶成像仪进行显影，用Image Lab 4.0进行灰度分析，计算p75NTR蛋白表达量，鉴定类许旺细胞。
纯化的原代许旺细胞培养7 d进行免疫荧光染色，用40 g/L多聚甲醛室温固定30 min，PBS(0.01 mol/L，pH 7.4)清洗3遍，0.3% TritonX-100室温破膜20 min，3%牛血清白蛋白室温封闭1.5 h，孵育混合一抗S100β(1∶250)，p75NTR (1∶200)4 ℃过夜，孵育混合二抗(1∶400，山羊抗兔Alex Fluor 594，山羊抗鼠Alex Fluor 488)1 h，PBS(0.01 mol/L，pH 7.4)清洗3遍，DAPI(5 mg/L)室温孵育8 min后封固，荧光显微镜拍照，计数S100β和p75NTR双阳性细胞数量及DAPI阳性细胞数量，并计算许旺细胞纯度。
1.4.3 细胞外基质的制备类许旺细胞形成后加入含50 mg/L
抗坏血酸的诱导培养基(含5 μmol/L福司可林、10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、5 μg/L血小板衍生生长因子，200 μg/L
重组人神经调节蛋白β1、体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养基)培养10-12 d，待培养板底部出现白色膜状物，加入含20 mmol/L NH4OH、1%Triton X-100的PBS进行脱细胞处理5-10 min，得到脱细胞的细胞外基质，保持湿润，放于4 ℃
冰箱保存备用。
许旺细胞达90%融合后传代，第3代时加入含50 mg/L
抗坏血酸、体积分数为15%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养10-12 d，待培养板底部出现白色膜状物，加入含
20 mmol/L NH4OH、1%Triton X-100的PBS(0.01 mol/L，pH 7.4)进行脱细胞处理5-10 min，得到脱细胞的细胞外基质[28]，保持湿润，放于4 ℃冰箱保存备用。
1.4.4 细胞外基质对背根神经节的作用取新生1 d的SD乳鼠，雌雄不限，在显微镜下用显微镊取出位于椎间孔中的背根神经节，提取的背根神经节用0.25%胰酶加Ⅳ型胶原酶置于37 ℃孵箱消化1 h后终止消化，然后放入离心机以
1 790 r/min转速离心5 min，弃上清，再次加入含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养基吹打后重复上述操作，然后加入背根神经节神经元培养基(含2% B27、50 μg/L神经生长因子、2 mmol/L谷氨酰胺、青霉素、链霉素的Neurobasal
培养基)吹打重悬。该实验分为3组：经左旋多聚赖氨酸包被的对照组，类许旺细胞外基质包被的诱导组，许旺细胞外基质包被的许旺组。将制备好的背根神经节神经元细胞悬液接种于预先包被的24孔板中，每孔1 000个细胞，24 h后观察贴壁情况，3 d后进行免疫荧光染色，40 g/L多聚甲醛室温固定30 min，PBS(0.01 mol/L，pH 7.4)清洗3遍，0.2% Triton室温破膜15 min，3%牛血清白蛋白室温封闭1 h，孵育一抗β-tubulin-Ⅲ(1∶200)、NeuN(1∶400)，4 ℃冰箱过夜，孵育二抗(1∶400，山羊抗鼠Alex Fluor 594，山羊抗兔Alex Fluor 488)1 h，PBS(0.01 mol/L，pH 7.4)清洗3遍，封固后进行荧光显微镜拍摄，并测量最长轴突长度。
提取新生1 d的SD乳鼠，在显微镜下用显微镊取出位于椎间孔中的背根神经节，用显微剪剪碎组织约1 min，胰酶和Ⅱ型胶原酶消化5 min，用显微镊夹取圆润规则的组织块放进预先包被好的48孔中，稍加背根神经节神经元培养基(含2% B27、50 μg/L神经生长因子、2 mmol/L谷氨酰胺、青霉素、链霉素的Neurobasal培养基)浸润组织块，24 h后再加相同培养液没过组织块，3 d后进行β-tubulin-Ⅲ(1∶200)免疫荧光染色，仔细观察背根神经节形态以及轴突生长状况，测定5条最长神经轴突长度并且计算均值，计算组织块的神经轴突总面积/组织块面积。
1.4.5 聚ε-己内酯导管制备配制甲醇、氯仿(1∶4)混合物，将30 g聚ε- 己内酯颗粒溶解其中，制备30%的聚ε-己内酯电纺丝溶液。在注射器中填充10 mL聚ε-己内酯电纺丝溶液，设置注射泵的流速为10 mL/h，静电纺丝系统设置施加电压为9.0 kV，注射器针头与集电器间距为15 cm，平行并垂直于针头放置一根不锈钢细棒(长10 mm，直径1.5 mm)作为收集器，保持细棒匀速旋转状态(1 000 r/min)，制备聚ε-己内酯导管。将第2代许旺细胞或诱导的类许旺细胞用胰酶消化后，离心，重悬，接种到6孔板中，每孔1×106个，将聚ε-己内酯导管沉浸入细胞悬液中，24 h后加入抗坏血酸
(50 mg/L)制备细胞外基质复合聚ε-己内酯导管，第12天用含20 mmol/L NH4OH，1%Triton X-100的PBS(0.01 mol/L，pH 7.4)脱细胞，制备成脱细胞外基质复合聚ε-己内酯导管[25]。
1.4.6 细胞外基质对坐骨神经损伤的修复作用选取SD大鼠40只，腹腔注射3%戊巴比妥钠溶液，麻醉后切开左后肢皮肤，钝性分离皮下组织，暴露左侧坐骨神经，用眼科剪取出一段后留下5 mm的神经缺损，制成大鼠坐骨神经缺损模型。将制备好的模型大鼠随机分为4组：对照组应用只填充生理盐水的聚ε-己内酯导管桥接；自体神经组将剪下的5 mm神经翻转后，用10-0尼龙缝合线缝合神经外膜；许旺组应用许旺细胞外基质复合聚ε-己内酯导管桥接；诱导组应用类许旺细胞外基质复合聚ε-己内酯导管桥接。饲养4周后取坐骨神经组织进行免疫荧光检测以及取腓肠肌进行Masson染色。
1.4.7 免疫荧光法观察大鼠坐骨神经轴突的生长情况取左侧坐骨神经用石蜡包埋后行纵向切成厚度为15 μm组织切片。组织切片在抗原修复后，PBS(0.01 mol/L，pH 7.4)清洗3次，每次 5 min，室温下在含有0.3%Triton X-100和3%牛血清白蛋白的封闭溶液中孵育60 min，在湿盒中滴加鼠抗NF160单克隆抗体(1∶200) 4 ℃孵育过夜，PBS(0.01 mol/L，pH 7.4)将切片清洗3次，每次5 min，滴加山羊抗鼠二抗(1∶400，Alex Fluor 488)室温孵育1 h，PBS(0.01 mol/L，pH 7.4)清洗3次，每次5 min，封固后通过共聚焦显微镜观察。
1.4.8 苏木精-伊红染色观察大鼠腓肠肌生长情况取术侧和健侧腓肠肌，称质量，计算各组大鼠术侧/健侧肌肉质量的比值，即为腓肠肌湿质量比值。将左侧腓肠肌用石蜡包埋后横向切成10 μm组织切片，然后进行Masson染色，每组在显微镜下随机取6个视野，用Image-Pro Plus 6.0 软件分析肌纤维横断面积。
1.5 主要观察指标 ①许旺细胞的鉴定结果与纯度，类许旺细胞的鉴定结果；②背根神经节神经元最长轴突长度；③背根神经节组织块的神经轴突总面积/组织块面积及5根最长轴突平均长度；④聚ε-己内酯材料上细胞生长情况及细胞外基质覆盖情况；⑤各组大鼠坐骨神经缺损区轴突再生情况；⑥各组大鼠坐骨神经损伤后腓肠肌的生长恢复情况。
1.6 统计学分析采用GraphPad Prism 8.0和SPSS 22.0进行统计学分析。所有数据均用x±s表示，使用t 检验和单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

外周神经损伤通常会导致损伤部位远端的神经纤维与神经轴突离断，随后远端神经发生退行性变，使周围的靶器官发生去神经，进而丧失功能[29]。与中枢神经相比，外周神经具有较好的再生能力[30]。这种差异的部分原因不仅是由于瓦勒氏变性过程中在远端残端发生的细胞和分子变化，也是由于切除轴突的外周神经元具有转换到再生状态的内在能
力[31]。然而这种再生能力有限，仍然需要尽快建立神经连接通道，否则可能导致肢体功能丧失。在长节段缺损发生时，需要将神经移植物或神经导管植入间隙区域，以帮助建立再生通道[8-9]。虽然自体神经移植是目前公认的金标准技术[10-13]，但术后去神经区的功能会减退，因此探索生物方法来增强神经再生和改善损伤后的功能以及再生修复机制仍是目前研究的重点。许旺细胞沿轴突排列形成Büngner带，如果再生的轴突在较短的时间内到达远端残端，神经功能就有可能恢
复[32]。否则，严重慢性许旺细胞变性可能会发生在远端残端，并阻碍再生[33]。许旺细胞移植疗法已被证明有效，但是由于体外培养许旺细胞再移植较困难[18]，目前的研究也在积极寻求可替代的方案。
骨髓间充质干细胞来源广泛[19]，在适当条件下可分化为许旺细胞。目前已有文献报道了类许旺细胞、许旺细胞分别联合支架修复大鼠坐骨神经缺损，发现均有很好的治疗效果[20-23]。细胞进入体内后的重要作用就是分泌细胞因子以及细胞外基质，进而促进患区组织增殖修复。细胞外基质是细胞分泌的蛋白、多糖等大分子组成的复杂网格状结构，包含层粘连蛋白、纤连蛋白、胶原蛋白等，能够促进细胞增殖、分化，支持细胞重要信号在周围神经系统中的传递[34]。在外周神经系统中，许旺细胞分泌细胞外基质并形成基底膜包裹在轴突周围，能抵抗分解并引导生长锥向远端延伸[35-36]。有文献报道许旺细胞的细胞外基质可调节神经轴突生长[37]。因此，作者大胆猜测类许旺细胞外基质对于神经损伤修复也具有重要的作用。目前对于类许旺细胞外基质的研究尚未见报道，因此课题组尝试制备了类许旺细胞和许旺细胞外基质并通过体外接种神经元和组织块的方法观察和比较两者的促神经生长作用，在体内则通过检测坐骨神经修复程度和腓肠肌恢复程度判断两种细胞外基质的作用。
该研究中细胞外基质的制备源于细胞膜片的制作，细胞通过物理手段刺激增殖和细胞外基质的分泌形成致密膜片结构，这种膜片由于组分与组织结构相似，形态也不受支架的限制，因此成为很好的组织工程材料，应用于包括骨、软骨、牙周韧带、视神经等在内的多个再生领域，以修复各种受损组织[38]，但是在修复过程中不可避免地应用大量细胞膜片，细胞的堆叠可导致细胞代谢废物排出困难以及营养物质供应难的问题[39]。膜片脱细胞后则可以只剩细胞外基质，避免了这些问题，同时保留了重要的蛋白，且由于没有细胞结构，所以又常表现为免疫耐受，一定厚度又赋予了它相应的弹性和较好的机械强度，同时能激活细胞内信号通路，因此脱细胞外基质成为了一种前景广阔的疗法[40]。聚ε-己内酯在内等一系列神经支架材料的出现为神经损伤修复提供了宽广的思路和应用前景，复合了细胞外基质或营养因子的支架材料更是展现了极佳的应用前景，有望替代自体神经移植[41-42]。
许旺细胞来源于轴突的髓鞘，功能强大但来源有限且增殖缓慢；类许旺细胞可来自于骨髓间充质干细胞，干细胞增殖迅速，来源广泛，易于培养，适合体外大规模扩增诱导，类许旺细胞又具有与许旺细胞相似的形态和功能，利用抗坏血酸制备细胞外基质后，比较了二者促神经再生的能力，与对照组相比，两种细胞外基质上背根神经节神经元的轴突长度明显增加，组织块轴突长度或轴突面积百分比都明显增大，诱导组在数值上低于许旺组，这表明诱导组也具有很好的促进背根神经节神经元生长的作用，尽管效果与许旺组有一定差距。另外，自体神经组再生神经纤维连贯且排列有序；诱导组和许旺组神经再生情况明显优于对照组，再生神经纤维贯通缺损区域，与自体神经组类似，这表明在体内条件下类许旺细胞外基质和许旺细胞外基质同样能够促进坐骨神经再生，且两者分别复合聚ε-己内酯材料具有相近的术后恢复效果，这为解决许旺细胞来源或自体神经移植带来的问题提供了一种替代的解决方案。值得注意的是，两种细胞外基质功能相近，表明两种细胞外基质中具有蛋白水平上的共性，诱导组与许旺组的差异揭示了其在蛋白水平上的差异，这也为其他探讨分子机制的研究打下基础。
骨髓间充质干细胞诱导分化来的类许旺细胞外基质体外具有很好的促进神经元生长的效果，且可以在体外大量扩增培养，这是许旺细胞无法比拟的巨大优势，两者对体内神经修复效果相似，可媲美自体神经修复效果，显示了类许旺细胞外基质在组织工程领域应用的潜力，为寻找具有许旺细胞功能且来源方便的新材料提供理论依据，也为未来组织工程学提供新的思路。

骨髓间充质干细胞诱导为类许旺细胞的细胞外基质促进周围神经损伤后轴突再生

Extracellular matrix of Schwann-like cells induced by bone marrow mesenchymal stem cells promotes axonal regeneration after peripheral nerve injury

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