骨质疏松症小鼠脂肪干细胞结合双相磷酸钙陶瓷修复骨质疏松症小鼠颅骨缺损

doi:10.12307/2022.015

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (1): 90-95.doi: 10.12307/2022.015

• 脂肪干细胞 adipose-derived stem cells • 上一篇下一篇

骨质疏松症小鼠脂肪干细胞结合双相磷酸钙陶瓷修复骨质疏松症小鼠颅骨缺损

敬劲1，赵珊笛1，陈龙1，彭双麟1，唐辉1，郭代金1，曾馨仪2，肖金刚1，3

西南医科大学，1口腔医学院，2临床医学院，四川省泸州市 646000；3西南医科大学附属口腔医院口颌面修复重建和再生实验室，四川省泸州市 646000

收稿日期:2020-07-21 修回日期:2020-07-22 接受日期:2020-09-15 出版日期:2022-01-08 发布日期:2021-10-25
通讯作者: 肖金刚，博士，教授，西南医科大学口腔医学院，四川省泸州市 646000；西南医科大学附属口腔医院口颌面修复重建和再生实验室，四川省泸州市 646000
作者简介:敬劲，男，1996年生，四川省射洪市人，汉族，重庆医科大学在读硕士，主要从事口腔基础与临床研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81870746，81371125)，项目负责人：肖金刚；四川省科技厅项目(2014JY0044)，项目负责人：肖金刚；国家级大学生创新训练项目(201810632052X)，项目负责人：敬劲；泸州市人民政府-西南医科大学科技战略合作项目[2015LZCYD-S05(2/12)]，项目负责人：肖金刚

Repair of calvarial defects in osteoporotic mice by adipose-derived stem cells combined with biphasic calcium phosphate ceramic scaffold

Jing Jin1, Zhao Shandi1, Chen Long1, Peng Shuanglin1, Tang Hui1, Guo Daijin1, Zeng Xinyi2, Xiao Jingang1, 3

1College of Stomatology, 2College of Clinical Medicine, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; 3Orofacial Reconstruction and Regeneration Laboratory of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China

Received:2020-07-21 Revised:2020-07-22 Accepted:2020-09-15 Online:2022-01-08 Published:2021-10-25
Contact: Xiao Jingang, MD, Professor, College of Stomatology, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; Orofacial Reconstruction and Regeneration Laboratory of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
About author:Jing Jin, Master candidate, College of Stomatology, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81870746, No. 81371125 (to XJG); the Program of Sichuan Science and Technology Bureau, No. 2014JY0044 (to XJG); the National Training Program of Innovation and Entrepreneurship for Undergraduates, No. 201810632052X (to JJ); the LuZhou Municipal People’s Government-the Science and Technology Strategic Cooperation Project of Southwest Medical University, No. 2015LZCYD-S05(2/12) (to XJG)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
骨极量缺损：是指动物自身无法修复的最小骨缺损，GUPTA等及SCHMIZ等研究确定小鼠及大鼠颅骨极量缺损范围分别为4 mm和8 mm。通过建立骨极量缺损动物模型，排除动物自身因素(如年龄、种系、骨缺损部位等)对骨缺损重建的干扰，从而更加准确地评估修复材料的骨缺损重建效果。
双相磷酸钙：是由一定比例的羟基磷灰石及β-磷酸三钙构成的生物活性材料，其化学组分与骨组织的无机成分相似，各项性能(如生物相容性、生物活性、骨传导性、骨诱导性、物理机械性能等)均较优异，故有望成为理想的骨替代材料。

背景：相关研究表明双相磷酸钙可有效重建骨质疏松症伴颅骨极量缺损动物模型的骨质缺损，另有研究展望了脂肪干细胞在骨质疏松性骨折及其继发骨缺损防治中的潜在应用前景，课题组前期研究结果表明，相较于正常脂肪干细胞，骨质疏松症小鼠脂肪干细胞(osteoporosis adipose-derived stem cells，OP-ASCs)的体外增殖能力及成骨分化潜能显著降低。
目的：探讨OP-ASCs结合双相磷酸钙对骨质疏松症小鼠颅骨极量缺损的重建效果。
方法：18只C57BL/6雌性小鼠随机均分为3组：空白组、双相磷酸钙组、OP-ASCs/双相磷酸钙组，建立骨质疏松症小鼠颅骨极量缺损模型，空白组不植入材料，另两组分别植入双相磷酸钙、OP-ASCs/双相磷酸钙复合体。各组于第8周及12周分别处死3只小鼠，采用Micro-CT、苏木精-伊红染色、Masson染色检测其颅骨缺损部位骨形成差异。
结果与结论：①术后第8周及第12周，空白组仅在颅骨缺损边缘可见少量新生骨组织，而另两组颅骨缺损部位可见明显新生骨组织，且OP-ASCs/双相磷酸钙组新生骨组织明显多于双相磷酸钙组(P < 0.05)；②第12周，双相磷酸钙组及OP-ASCs/双相磷酸钙组新生骨组织均明显多于第8周(P < 0.05)，且第12周OP-ASCs/双相磷酸钙组新生骨组织与双相磷酸钙组的差距较第8周更为明显(P < 0.05)；③结果表明，OP-ASCs/双相磷酸钙复合体对骨质疏松症小鼠颅骨极量缺损具有良好的重建效果，且重建效果较单纯双相磷酸钙更佳。
https://orcid.org/0000-0003-3758-1315(敬劲)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 脂肪干细胞, 骨质疏松症, 卵巢切除术, 组织块贴壁法, 双相磷酸钙, 颅骨, 极量缺损, 骨组织工程

Abstract: BACKGROUND: Researches have shown that biphasic calcium phosphate can be used as an effective bone substitute for the repair of critical-size defects in animal models with osteoporosis, and osteoporosis adipose-derived stem cells (OP-ASCs) is promising for medical applications in patients with osteoporotic fractures and its secondary bone defects. The previous research results of the research group showed that compared with normal adipose-derived stem cells, the in vitro proliferation and osteogenic differentiation potential of OP-ASCs from osteoporosis mice were obviously reduced.
OBJECTIVE: To investigate the effect of OP-ASCs combined with biphasic calcium phosphate on the repair of calvarial critical-size defects in osteoporotic mice.
METHODS: Eighteen C57BL/6 female mice were divided into three groups randomly: blank group, biphasic calcium phosphate group, and OP-ASCs/biphasic calcium phosphate group. The models of osteoporosis with calvarial critical-size defects were established in each group, and then the blank group was not implanted with materials. The biphasic calcium phosphate and OP-ASCs/biphasic calcium phosphate groups were implanted with biphasic calcium phosphate ceramic scaffolds only, and OP-ASCs/biphasic calcium phosphate admixtures separately. The mice were sacrificed at the 8 (n=3) and 12 (n=3) weeks. The differences in bone formation at the calvarial defects were detected by micro-CT, hematoxylin-eosin staining, and Masson Trichrome staining.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) There was a small amount of bone formation in the blank group both at 8 and 12 weeks after implantation, and the new bone tissue grown well in both the biphasic calcium phosphate group and the OP-ASCs/biphasic calcium phosphate group; the OP-ASCs/biphasic calcium phosphate group achieved more bone formation than that of the biphasic calcium phosphate group (P < 0.05). (2) Compared with that at 8 weeks, both the biphasic calcium phosphate group and the OP-ASCs/biphasic calcium phosphate group showed more bone formation at 12 weeks (P < 0.05), and the difference of bone formation between the OP-ASCs/biphasic calcium phosphate group and the biphasic calcium phosphate group was more obvious than that at 8 weeks (P < 0.05). (3) To conclude, OP-ASCs combined with biphasic calcium phosphate could repair the calvarial critical-size defects in osteoporosis mice effectively to some extent, and the effect is better than that of the biphasic calcium phosphate used alone.

Key words: adipose stem cells, osteoporosis, ovariectomy, explants culture method, biphasic calcium phosphate, skull, critical-size defect, bone tissue engineering

中图分类号:

敬劲, 赵珊笛, 陈龙, 彭双麟, 唐辉, 郭代金, 曾馨仪, 肖金刚. 骨质疏松症小鼠脂肪干细胞结合双相磷酸钙陶瓷修复骨质疏松症小鼠颅骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 90-95.

Jing Jin, Zhao Shandi, Chen Long, Peng Shuanglin, Tang Hui, Guo Daijin, Zeng Xinyi, Xiao Jingang. Repair of calvarial defects in osteoporotic mice by adipose-derived stem cells combined with biphasic calcium phosphate ceramic scaffold[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(1): 90-95.

图/表（结果） 3

参考文献

[1] 杨思敏,王新卫.自体骨移植修复骨缺损的临床研究进展[J].中国疗养医学,2019,28(9):945-948.
[2] REZAEI M, FARHADIAN M, RASHIDI AM, et al. Nano-Biphasic Calcium Phosphate Ceramic for the Repair of Bone Defects. J Craniofac Surg. 2018; 29(6):e543-e548.
[3] GARRIDO CA, LOBO SE, TURÍBIO FM, et al. Biphasic calcium phosphate bioceramics for orthopaedic reconstructions: clinical outcomes. Int J Biomater. 2011;2011:129727.
[4] MANGANO FG, ZECCA PA, VAN NOORT R, et al. Custom-Made Computer-Aided-Design/Computer-Aided-Manufacturing Biphasic Calcium-Phosphate Scaffold for Augmentation of an Atrophic Mandibular Anterior Ridge. Case Rep Dent. 2015;2015:941265.
[5] ZHANG Z, WANG P, LI X, et al. Reconstruction of mandibular bone defects using biphasic calcium phosphate bone substitutes with simultaneous implant placement in mini-swine: A pilot in vivo study. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2019;107(6):2071-2079.
[6] BACAKOVA L, ZARUBOVA J, TRAVNICKOVA M, et al. Stem cells: their source, potency and use in regenerative therapies with focus on adipose-derived stem cells - a review. Biotechnol Adv. 2018;36(4):1111-1126.
[7] AL-GHADBAN S, BUNNELL BA. Adipose Tissue-Derived Stem Cells: Immunomodulatory Effects and Therapeutic Potential. Physiology (Bethesda). 2020;35(2):125-133.
[8] WAGNER JM, REINKEMEIER F, WALLNER C, et al. Adipose-Derived Stromal Cells Are Capable of Restoring Bone Regeneration After Post-Traumatic Osteomyelitis and Modulate B-Cell Response. Stem Cells Transl Med. 2019; 8(10):1084-1091.
[9] MAO SH, CHEN CH, CHEN CT. Osteogenic potential of induced pluripotent stem cells from human adipose-derived stem cells. Stem Cell Res Ther. 2019;10(1):303.
[10] DUFRANE D, DOCQUIER PL, DELLOYE C, et al. Scaffold-free Three-dimensional Graft From Autologous Adipose-derived Stem Cells for Large Bone Defect Reconstruction: Clinical Proof of Concept. Medicine (Baltimore). 2015;94(50):e2220.
[11] PADUANO F, MARRELLI M, AMANTEA M, et al. Adipose Tissue as a Strategic Source of Mesenchymal Stem Cells in Bone Regeneration: A Topical Review on the Most Promising Craniomaxillofacial Applications. Int J Mol Sci. 2017; 18(10):2140.
[12] 彭双麟,姚志浩,罗道文,等.多孔双相磷酸钙陶瓷修复骨质疏松症大鼠颅骨极量缺损的实验研究[J].口腔医学研究,2019,35(4):377-381.
[13] SANTOS PS, CESTARI TM, PAULIN JB, et al. Osteoinductive porous biphasic calcium phosphate ceramic as an alternative to autogenous bone grafting in the treatment of mandibular bone critical-size defects. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2018;106(4):1546-1557.
[14] SHEU SY, HSU YK, CHUANG MH, et al. Enhanced Bone Formation in Osteoporotic Mice by a Novel Transplant Combined with Adipose-derived Stem Cells and Platelet-rich Fibrin Releasates. Cell Transplant. 2020;29: 963689720927398.
[15] 唐宇星,赵庆,杨中萌,等.聚乳酸共聚物复合脂肪干细胞对骨质疏松性骨折愈后生物力学的影响[J].中国组织工程研究,2017,21(10):1577-1582.
[16] WANG L, HUANG C, LI Q, et al. Osteogenic differentiation potential of adipose-derived stem cells from ovariectomized mice. Cell Prolif. 2017;50(2): e12328.
[17] 罗道文,黄馗,王雷,等.C57小鼠骨质疏松症伴颅骨极量缺损模型的建立[J].中国组织工程研究,2017,21(36):5793-5798.
[18] 黄成龙,黎庆,王雷,等.两种方法培养骨质疏松症小鼠脂肪干细胞的比较[J].中国组织工程研究,2017,21(29):4654-4659.
[19] WUBNEH A, TSEKOURA EK, AYRANCI C, et al. Current state of fabrication technologies and materials for bone tissue engineering. Acta Biomater. 2018;80:1-30.
[20] ATASOY-ZEYBEK A, KOSE GT. Gene Therapy Strategies in Bone Tissue Engineering and Current Clinical Applications. Adv Exp Med Biol. 2018; 1119:85-101.
[21] AHMED S, CHAUHAN VM, GHAEMMAGHAMI AM, et al. New generation of bioreactors that advance extracellular matrix modelling and tissue engineering. Biotechnol Lett. 2019;41(1):1-25.
[22] GRIMM D, EGLI M, KRÜGER M, et al. Tissue Engineering Under Microgravity Conditions-Use of Stem Cells and Specialized Cells. Stem Cells Dev. 2018; 27(12):787-804.
[23] CHANDRA P, ATALA A. Engineering blood vessels and vascularized tissues: technology trends and potential clinical applications. Clin Sci (Lond). 2019; 133(9):1115-1135.
[24] ZUK PA, ZHU M, MIZUNO H, et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 2001;7(2):211-228.
[25] VAN ESTERIK FA, ZANDIEH-DOULABI B, KLEVERLAAN CJ, et al. Enhanced Osteogenic and Vasculogenic Differentiation Potential of Human Adipose Stem Cells on Biphasic Calcium Phosphate Scaffolds in Fibrin Gels. Stem Cells Int. 2016;2016:1934270.
[26] LIM HC, ZHANG ML, LEE JS, et al. Effect of different hydroxyapatite:β-tricalcium phosphate ratios on the osteoconductivity of biphasic calcium phosphate in the rabbit sinus model. Int J Oral Maxillofac Implants. 2015; 30(1):65-72.
[27] PRIPATNANONT P, PRASERTTHAM P, SUTTAPREYASRI S, et al. Bone Regeneration Potential of Biphasic Nanocalcium Phosphate with High Hydroxyapatite/Tricalcium Phosphate Ratios in Rabbit Calvarial Defects. Int J Oral Maxillofac Implants. 2016;31(2):294-303.
[28] YANG C, UNURSAIKHAN O, LEE JS, et al. Osteoconductivity and biodegradation of synthetic bone substitutes with different tricalcium phosphate contents in rabbits. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2014;102(1):80-88.
[29] GU BK, CHOI DJ, PARK SJ, et al. 3D Bioprinting Technologies for Tissue Engineering Applications. Adv Exp Med Biol. 2018;1078:15-28.
[30] CANCIANI E, DELLAVIA C, FERREIRA LM, et al. Human Adipose-Derived Stem Cells on Rapid Prototyped Three-Dimensional Hydroxyapatite/Beta-Tricalcium Phosphate Scaffold. J Craniofac Surg. 2016;27(3):727-732.

引言

中国逐渐步入老龄化社会，骨质疏松症及骨质疏松性骨折发病率持续攀升。当骨质疏松性骨折患者制动时，其骨量迅速丢失，新骨生成速度减缓，从而导致骨折经久不愈，甚至发展为骨缺损。目前临床上可采用的骨缺损重建方法主要包括天然骨组织或人工骨移植替代材料进行骨缺损重建及牵张成骨。自体骨组织临床应用最为广泛，但供区骨量有限、供区潜在术后并发症等缺陷在某些程度上限制其临床应用[1]。
目前重建骨缺损较前沿也较热门的方式是由种子细胞、生物材料支架、生长因子等三大因素有机构成的组织工程技术。支架材料是组织工程骨的中心环节，现有支架材料种类繁多。双相磷酸钙由一定比例的羟基磷灰石及β-磷酸三钙构成，近年来凭借其良好的生物相容性及生物活性、适宜的降解/再沉积速率、优异的骨传导及骨诱导性等优势，双相磷酸钙在牙颌、颅面骨质缺损重建中的研究及应用愈加广泛[2-5]。
种子细胞研究及应用最为广泛的是成体干细胞，广泛存在于机体各组织中，具备高度增殖能力及多向分化潜能。脂肪干细胞凭借其来源丰富、易获取且供区术后创伤小(取自皮下脂肪组织)、体外扩增能力及免疫调节能力强(可合成分泌某些生长因子及免疫调节因子)等优势，成为近年来备受关注的干细胞，其成骨分化潜能亦成为近年来骨组织工程研究领域的热点[6-11]。
研究表明，双相磷酸钙可有效重建骨质疏松症伴骨极量缺损动物模型的骨质缺损[12-13]；另有研究展望了脂肪干细胞在骨质疏松性骨折及其继发骨缺损防治中的潜在应用前景[14-15]，课题组前期关于骨质疏松症小鼠脂肪干细胞
(osteoporosis adipose-derived stem cells，OP-ASCs)成骨能力的
研究结果表明，相较于正常脂肪干细胞，OP-ASCs的体外增殖能力及成骨分化潜能显著降低[16]。为此，开展了
OP-ASCs结合双相磷酸钙重建骨质疏松症小鼠颅骨极量缺损的实验研究，探究OP-ASCs结合双相磷酸钙对骨缺损的重建效果，为骨质疏松症患者自体脂肪干细胞结合双相磷酸钙构建工程化骨重建骨缺损提供新的理论依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。
1.2 时间及地点 2018年4月至2019年6月在西南医科大学口腔医学院口颌面修复重建与再生实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物选取清洁级C57BL/6雌性小鼠24只，8周龄，体质量18-20 g，由斯贝福(北京)实验动物科技有限公司提供，动物许可证号SCXK(京)2016-0002。
1.3.2 实验耗材及仪器多聚甲醛、PBS、戊巴比妥钠(国产市售分析纯)；EDTA(广东光华科技股份有限公司)；青-链霉素、胰蛋白酶-EDTA细胞消化液、地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠(美国 Sigma-Aldrich公司)；改良型α-MEM培养基(美国Hyclone公司)；胎牛血清(美国Gibco公司)；苏木精-伊红、Masson三色染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；双相磷酸钙(骨诱导人工骨，四川大学生物材料工程研究中心)；离心机(ST 16R)、超净工作台、二氧化碳培养箱(美国Thermo Fisher公司)；流式细胞仪(美国BD Biosciences公司)；电动外科环锯系统(韩国MTC公司)；倒置相差显微镜、光学显微镜(日本Olympus公司)；Micro-CT(美国GE
Healthcare公司)；超薄石蜡切片机(德国Leica公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 建立骨质疏松症小鼠模型对24只C57BL/6小鼠行1%戊巴比妥钠(20 mg/kg)腹腔注射麻醉后，取俯卧位固定于恒温工作台上，以双侧肋缘下10 mm，距背部中线5 mm处为圆心，10 mm为半径常规备皮，2%碘伏消毒，铺巾，于圆心处分别作一纵向切口，长约5 mm，打开腹腔，摘除双侧卵巢，关闭腹腔，见图1。术后常规饲养，室温维持在24-28 ℃，通风良好，环境安静，自由进食、饮水，添加饲料及换水由专人进行。

1.4.2 实验分组课题组前期研究结果表明，双侧卵巢切除术后6周C57BL/6小鼠骨质疏松症模型建立成功[17]。术后第6周，从24只小鼠中随机取6只作为细胞取材用，剩余18只随机均分为3组：空白组、双相磷酸钙组、OP-ASCs/双相磷酸钙组，每组6只。
1.4.3 提取、分离、培养及鉴定OP-ASCs 骨质疏松症小鼠模型建立成功后，将细胞取材用小鼠行颈椎脱臼法处死，常规脱毛备皮，置于体积分数为75%的乙醇中浸泡5 min后仰卧固定于超净工作台上。沿腹股沟行长约4 cm切口，分离皮下脂肪组织，清除组织中肉眼可见的小血管及筋膜后，依次置于盛有含10%、5%、不含青-链霉素3个梯度PBS的培养皿中漂洗3次，尽量剪碎，将组织块均匀铺展于T25培养瓶底，小心立起培养瓶，向瓶底加入5 mL配制培养基(成分：改良型α-MEM培养基+体积分数为10%无菌胎牛血清+ 1%青-链霉素)，直立静置于37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱中，待1.5-2.0 h组织块贴壁后小心倾斜培养瓶，使培养基逐渐浸没贴壁的组织块，然后平置于CO2培养箱行OP-ASCs原代培养，记为P0，见图2A。待组织块边缘外移出、贴壁生长的细胞铺满70%-80%瓶壁时进行首次传代，记为P1，见图2B；7 d后以相同操作行第2次传代，记为P2，见图2C[18]。

1.4.4 OP-ASCs结合双相磷酸钙共培养取第2代OP-ASCs加入1.0-2.0 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液进行消化、离心、计数，制成2×109 L-1的细胞悬液，与双相磷酸钙(4 mm×
2 mm)共同放入10 mm×50 mm试管(带胶塞)中，用注射器将试管内空气抽出形成负压后，细胞即可在压力作用下渗透入双相磷酸钙孔隙，置入CO2培养箱中常规培养4 h，然后将结合有OP-ASCs的双相磷酸钙置入60 mm加有成骨诱导液(成分：改良型 α-MEM培养基+体积分数为10%无菌胎牛血清+1%青-链霉素+100 nmol/L地塞米松+50 μmol/L维生素C+10 mmol/L β-甘油磷酸钠)的培养皿中，于CO2培养箱中复合培养7 d。
1.4.5 建立骨质疏松症小鼠颅骨极量缺损模型及植入支架材料 OP-ASCs/双相磷酸钙复合支架材料制备成功后，对3组小鼠行1%戊巴比妥钠(20 mg/kg)腹腔注射麻醉，取俯卧位固定于恒温工作台上，以其颅骨矢状缝及冠状缝交点为圆心，2 cm为半径常规备皮，2%碘伏消毒，铺巾。沿颅顶矢状缝纵向切开约15 mm，深达骨膜，血管钳钝性分离皮下组织，骨膜剥离器剥离骨膜，充分暴露顶骨，于颅顶正中线两侧用直径为4 mm(课题组前期研究结果表明，骨质疏松症C57小鼠的颅骨极量缺损为4 mm[17])的电动外科环锯造出2个直径为4 mm的小鼠颅骨极量缺损，左右对称不相连。将直径为4 mm的双相磷酸钙植入双相磷酸钙组小鼠颅骨缺损处，缝合创口，见图3；OP-ASCs/双相磷酸钙组小鼠植入OP-ASCs/双相磷酸钙复合体，空白组小鼠不植入材料。术后护理同双侧卵巢切除术后。

1.5 主要观察指标
1.5.1 颅骨缺损区骨组织再生情况 3组C57BL/6小鼠继续饲养，各组于第8周及第12周行颈椎脱臼法分别处死3只，取颅骨组织用10%多聚甲醛固定后，行Micro-CT扫描检测3组小鼠颅骨缺损区骨密度。扫描条件：电压55 kV，电流
109 μA，曝光时间200 ms，图像数量1 200张；三维重建方法：COBRA滤波反投影重建。
1.5.2 颅骨组织形态及结构小鼠颅骨组织经Micro-CT扫描后再置入4 ℃、10%EDTA(pH值为8.0)溶液中，脱钙至小鼠颅骨能被细针轻易穿透为止。将脱钙完成后的小鼠颅骨制成切片行苏木精-伊红染色、Masson染色，观察小鼠颅骨组织切片中新生骨组织形态及结构。
1.5.3 第2代OP-ASCs表面特异性抗原表达课题组前期用流式细胞仪检测第2代OP-ASCs表面特异性抗原CD34、CD146及Sca-1[18]，可鉴定所提取的细胞为脂肪干细胞。
1.6 统计学分析采用SPSS Statistics 23.0进行数据分析，数据以x±s表示。通过SNK-q检验分别对第8周及第12周数据进行组间两两比较，通过配对样本t检验进行第8周及第12周数据间差异的比较。α=0.05，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

中国逐渐步入老龄化社会，骨质疏松症发病率持续攀升，骨质疏松性骨折及其继发骨缺损的治疗问题日益突出。目前临床主要采用天然骨组织或人工骨移植替代材料进行骨缺损重建及牵张成骨。自体骨组织移植仍是骨缺损重建的“金标准”，但供区骨量有限、供区潜在术后并发症等缺陷在某些程度上限制其临床应用[1]。近年来，组织工程学领域的相关研究均取得了前所未有的进展[19-23]，构建组织工程骨重建骨缺损成为一种趋势。
成体干细胞是组织工程的首选种子细胞，存在于神经、骨骼肌、牙髓及骨髓等组织中，具备高度增殖能力及多向分化潜能，其中骨髓间充质干细胞应用最为广泛。2001年，ZUK等[24]研究证实人体脂肪组织中存在多能干细胞，随后相关研究进一步证实脂肪干细胞具备多向分化潜能，且相对于骨髓间充质干细胞而言，脂肪干细胞凭借其来源丰富、易获取且供区术后创伤小(取自皮下脂肪组织)、体外扩增能力强、免疫调节能力强(可合成分泌某些生长因子及免疫调节因子)等优势，成为近年来干细胞研究的热点，其成骨分化潜能亦成为近年来骨组织工程研究领域的热点[6-11]。课题组前期关于OP-ASCs成骨能力的研究结果表明[16]，相较于正常脂肪干细胞，OP-ASCs的体外增殖能力及成骨分化潜能显著降低。此次研究为实现骨质疏松症患者利用自体OP-ASCs移植重建骨缺损奠定实验基础，故采用OP-ASCs作为种子细胞。课题组前期探究研究结果表明[14]，组织块贴壁法更适合于体外获取OP-ASCs，故此次研究采取组织块贴壁法分离培养OP-ASCs。
双相磷酸钙由一定比例的羟基磷灰石及β-磷酸三钙构成，具备良好的生物学性能，此外尚可通过调整羟基磷灰石/
β-磷酸三钙的构成比控制其降解/再沉积速率，从而优化其部分生物学性能。羟基磷灰石的低降解速率及良好的生物力学性能有利于维持双相磷酸钙在降解过程中结构的稳定，为细胞的迁移、黏附、增殖及分化提供必要的空间。β-磷酸三钙的快速降解可为新骨生成提供较多的游离钙、磷离子，但过多的游离钙、磷离子可引起术后炎症反应，从而影响新骨生成，故羟基磷灰石低降解速率及β-磷酸三钙高降解速率间的平衡是影响新生骨量的关键因素，但关于双相磷酸钙中羟基磷灰石/β-磷酸三钙的最佳构成比，目前尚无定论[25-28]。此次研究应用的双相磷酸钙由传统方法制备，羟基磷灰石含量为5%-20%。采用传统方法制备双相磷酸钙，不能较好地控制双相磷酸钙的三维多孔结构的孔隙大小、孔隙率及孔隙互联性等结构特性，从而影响其生物学特性。20世纪80年代后期出现的快速成型技术近年来在组织工程学研究中应用愈加广泛，应用快速成型技术，如3D打印技术，可快速精确地制备出具备适宜孔隙结构的生物支架材料，有效克服传统方法存在的缺陷[29]。此次研究设计在双相磷酸钙的选取(制备方法、羟基磷灰石及β-磷酸三钙的比例设置)上应尽可能优化，以避免因支架材料性能不佳不利于成骨而干扰实验结果。
此次研究将OP-ASCs结合双相磷酸钙共培养，构建
OP-ASCs/双相磷酸钙组织工程骨植入骨质疏松症小鼠颅骨极量缺损处，同时设置不植入材料的空白组及植入单纯双相磷酸钙的双相磷酸钙组，于术后第8周及第12周进行影像学及组织学检查。Micro-CT扫描结果示，空白组仅在缺损边缘可见少量新生骨组织，而双相磷酸钙组及OP-ASCs/双相磷酸钙组颅骨缺损部位可见明显新生骨组织，且OP-ASCs/双相磷酸钙组新生骨组织明显多于双相磷酸钙组(P < 0.05)。与空白组相比，双相磷酸钙组整个颅骨缺损部位均有新生骨组织，证实双相磷酸钙材料具备骨传导性，为血管的长入及新骨的形成提供支架，在一定程度上重建骨缺损，这与彭双麟等[12]、SANTOS等[13]的研究发现一致。与双相磷酸钙组比较，OP-ASCs/双相磷酸钙组新生骨组织明显增多，说明OP-ASCs/双相磷酸钙组成骨速率高于双相磷酸钙组，证实双相磷酸钙材料具备骨诱导性，能够诱导干细胞发生成骨分化形成新骨，从而增强骨缺损的重建效果，同时证实了脂肪干细胞可对成骨过程产生积极影响，这与CANCIANI等[30]的研究发现一致。第12周OP-ASCs/双相磷酸钙组新生骨组织与双相磷酸钙组的差距较第8周的组间差距更为明显(P < 0.05)。该结果进一步说明OP-ASCs/双相磷酸钙组成骨速率更高，从而进一步证实上述结论。组织学检查结果示空白组仅在剩余颅骨周围可见少许新生骨组织；OP-ASCs/双相磷酸钙组颅骨组织切片中新生骨组织明显多于双相磷酸钙组；第12周颅骨组织切片中新生骨组织明显多于第8周，与Micro-CT扫描结果相一致。研究表明，OP-ASCs/双相磷酸钙复合体对骨质疏松症小鼠颅骨极量缺损具有良好的重建效果，且重建效果较单纯双相磷酸钙更佳。
此次研究利用OP-ASCs/双相磷酸钙复合体成功重建骨质疏松症小鼠颅骨极量缺损，但针对临床上的大面积骨缺损，还需要构建体积更大的组织工程骨。关于构建组织工程骨重建骨缺损的研究目前尚处于探索阶段，实现其临床化仍面临众多挑战，例如如何获取足量高质量高纯度的脂肪干细胞，如何提高组织工程骨的血管化程度及其物理机械性能，如何促进组织工程骨组织与宿主骨组织的有效整合。伴随相关学科及技术的不断发展，现有难题逐步被攻克，组织工程骨终将步入临床成为骨缺损重建治疗的常规手段。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

骨质疏松症小鼠脂肪干细胞结合双相磷酸钙陶瓷修复骨质疏松症小鼠颅骨缺损

Repair of calvarial defects in osteoporotic mice by adipose-derived stem cells combined with biphasic calcium phosphate ceramic scaffold

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 3

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	李微, 朱汉民, 王鑫, 高雪, 崔婧, 刘雨昕, 黄树明. 左归丸干预卵巢摘除骨质疏松模型小鼠骨形态发生蛋白2信号通路的变化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1229-1235.
[2]	肖豪, 刘静 , 周君. 脉冲电磁场治疗绝经后骨质疏松症的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1323-1329.
[3]	康坤龙, 王新涛. 生物支架材料促进骨髓间充质干细胞成骨分化的研究热点[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 597-603.
[4]	李辉, 陈良龙. 植骨材料在脊柱结核治疗中的应用与特征[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 626-630.
[5]	欧梁, 孔德忠, 徐道情, 倪景, 付兴前, 黄维琛. 比较聚甲基丙烯酸甲酯与自固化磷酸钙骨水泥在椎体成形中应用效果的 Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 649-656.
[6]	何云影, 李玲婕, 张舒淇, 李雨舟, 杨生, 季平. 聚丙烯酸/琼脂糖三维培养构建细胞球的方法[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 553-559.
[7]	范丹阳, 付润泽, 米佳静, 刘春艳. 骨改建过程中大麻素受体的表达及作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(2): 283-288.
[8]	杨腾云, 李彦林, 刘德健, 王国梁, 郑竹君. 转化生长因子β3诱导外周血源性间充质干细胞成软骨分化的量效关系[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 45-51.
[9]	肖方骏, 陈树东, 栾继耀, 侯宇, 何坤, 林定坤. 丹参干预骨质疏松症：网络药理学解释的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 772-778.
[10]	王玉姣, 刘丹, 孙嵩, 孙勇. 改良型富血小板纤维蛋白复合双相磷酸钙可促进兔骨髓间充质干细胞的活性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 504-509.
[11]	吴子健, 胡昭端, 谢有琼, 王峰, 李佳, 李柏村, 蔡国伟, 彭锐. 3D打印技术与骨组织工程研究文献计量及研究热点可视化分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 564-569.
[12]	李晓壮, 段浩, 王伟舟, 唐志宏, 王旸昊, 何飞. 骨组织工程材料治疗骨缺损疾病在体内实验中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 626-631.
[13]	张峰. 聚醚醚酮和钛网材料修补颅骨缺损远期效果及不良事件的差异：前瞻性、单中心、非随机对照、2年随访临床试验方案[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(34): 5501-5505.
[14]	邱伟, 连星烨. 唑来膦酸干预老年骨质疏松性股骨转子间骨折髋关节置换后患者骨密度、骨代谢标志物的2年随访[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(33): 5265-5272.
[15]	刘小刚, 李甜, 张舵. 软骨组织工程中种子细胞选择的研究热点[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(31): 5059-5064.