miR-146a调控脂肪间充质干细胞成骨分化的机制

doi:10.12307/2022.012

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (1): 70-75.doi: 10.12307/2022.012

• 脂肪干细胞 adipose-derived stem cells • 上一篇下一篇

miR-146a调控脂肪间充质干细胞成骨分化的机制

黄涛1，程志坚2，贾志强3，赵晓光1，王磊1，翟文静2，周永新1

1西安医学院第一附属医院，陕西省西安市 710077；2西安交通大学第二附属医院，陕西省西安市 710061；3河南科技大学第二附属医院，河南省洛阳市 471000

收稿日期:2020-08-20 修回日期:2020-08-22 接受日期:2020-10-30 出版日期:2022-01-08 发布日期:2021-10-25
通讯作者: 周永新，硕士，主治医师，西安医学院第一附属医院，陕西省西安市 710077
作者简介:黄涛，男，1979年生，安徽省合肥市人，硕士，主治医师，主要从事脊柱脊髓损伤方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81801237)，项目负责人：程志坚

Mechanism by which miR-146a regulates osteogenic differentiation of adipose derived mesenchymal stem cells

Huang Tao1, Cheng Zhijian2, Jia Zhiqiang3, Zhao Xiaoguang1, Wang Lei1, Zhai Wenjing2, Zhou Yongxin1

1First Affiliated Hospital of Xi’an Medical University, Xi’an 710077, Shaanxi Province, China; 2Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, Shaanxi Province, China; 3Second Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology, Luoyang 471000, Henan Province, China

Received:2020-08-20 Revised:2020-08-22 Accepted:2020-10-30 Online:2022-01-08 Published:2021-10-25
Contact: Zhou Yongxin, Master, Attending physician, First Affiliated Hospital of Xi’an Medical University, Xi’an 710077, Shaanxi Province, China
About author:Huang Tao, Master, Attending physician, First Affiliated Hospital of Xi’an Medical University, Xi’an 710077, Shaanxi Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81801237 (to CZJ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

脂肪间充质干细胞：是一类从脂肪组织中分离出来的具有多项分化能力的干细胞，因为其形态与间充质干细胞相似，因此称为脂肪间充质干细胞。
微小RNA(miRNA)：是一类长度为22 nt左右的内源性非编码RNA，可通过靶向结合目的基因的3'UT区域，使其降解或抑制其翻译。近年来的研究发现，miRNAs在间充质干细胞向成骨细胞分化过程中起调控作用。

背景：既往研究表明，miR-146a能影响骨髓间充质干细胞成骨分化，但其在脂肪间充质干细胞成骨分化中的调节功能尚未阐明。
目的：探究miR-146a对小鼠脂肪间充质干细胞成骨分化的调控作用。
方法：获取雄性C57BL/6小鼠脂肪间充质干细胞，采用倒置显微镜观察细胞形态，流式细胞学方法检测第3代细胞CD29、CD44、CD45的表达，然后用miR-NC、miR-146a mimics和miR-146a inhibitor转染脂肪间充质干细胞并进行成骨诱导分化，成骨诱导第6天，采用碱性磷酸酶染色观察钙化程度，RT-PCR和Western blot检测成骨表型标志物的表达；成骨诱导第12天，采用茜素红染色鉴定细胞表面矿化基质的产生。

结果与结论：①培养的细胞为长梭形，呈成纤维样生长，第3代细胞CD29、CD44高表达，CD45低表达；②随着成骨诱导时间的延长，小鼠脂肪间充质干细胞miR-146a的表达逐渐降低(P < 0.05)；③与miR-NC组相比，碱性磷酸酶显色及其活性在miR-146a mimic组显著减弱，而在miR-146a inhibitor组显著增强(P < 0.05)；④与miR-NC组相比，ALP、Runx2、Akt、PI3K的mRNA和蛋白表达及p-Akt与p-PI3K的蛋白表达在miR-146a mimic组显著降低，而在miR-146a inhibitor组显著升高(P < 0.05)；⑤与miR-NC组相比，茜素红染色发现miR-146a mimic组细胞的钙化程度显著降低(P < 0.05)，而miR-146a inhibitor组的钙化程度显著升高(P < 0.05)；⑥上述结果表明，miR-146a能够通过PI3K/AKT信号通路负向调控脂肪间充质干细胞向成骨细胞分化。

https://orcid.org/0000-0002-2828-3271(周永新)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 脂肪间充质干细胞, 成骨细胞, miR-146a, 成骨分化, 信号通路

Abstract: BACKGROUND: Previous studies have shown that miR-146a can affect the osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells, but its regulatory function in adipose derived mesenchymal stem cells has not been elucidated.
OBJECTIVE: To investigate the regulatory role of miR-146a in the osteogenic differentiation of mouse adipose derived mesenchymal stem cells.
METHODS: Adipose derived mesenchymal stem cells were obtained from male C57BL/6 mice. The cell morphology was observed by inverted microscope, and the expression of CD29, CD44 and CD45 of passage 3 cells was detected by flow cytometry. miR-NC, miR-146a mimics and miR-146a inhibitor were transfected into adipose derived mesenchymal stem cells for osteogenic differentiation. On day 6 of osteogenic induction, alkaline phosphatase staining was used to observe the degree of calcification. RT-PCR and western blot assay were used to detect the expression of osteogenic phenotype markers. On day 12 of osteogenic induction, alizarin red staining was used to identify the formation of mineralized matrix on the cell surface.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The cultured cells were spindle shaped and fibroblast like. The expression of CD29 and CD44 was high and that of CD45 was low. (2) The expression of miR-146a in mouse adipose derived mesenchymal stem cells decreased with the prolongation of osteogenic induction time (P < 0.05). (3) Compared with miR-NC group, the amount and activity of alkaline phosphatase precipitates in miR-146a mimic group were significantly lower than those in miR-146a inhibitor group (P < 0.05). (4) Compared with miR-NC group, the mRNA and protein expressions of ALP, Runx2, Akt, p-Akt, PI3K and p-PI3K were significantly decreased in miR-146a mimic group, but significantly increased in miR-146a inhibitor group (P < 0.05). (5) Compared with miR-NC group, alizarin red staining showed that the degree of calcification in miR-146a mimic group was significantly lower (P < 0.05), while that in miR-146a inhibitor group was significantly higher (P < 0.05). (6) These results suggest that miR-146a can negatively regulate the differentiation of adipose derived mesenchymal stem cells into osteoblasts through PI3K/AKT signaling pathway.

Key words: stem cells, adipose derived mesenchymal stem cells, osteoblasts, miR-146a, osteogenic differentiation, signaling pathway

中图分类号:

黄涛, 程志坚, 贾志强, 赵晓光, 王磊, 翟文静, 周永新. miR-146a调控脂肪间充质干细胞成骨分化的机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 70-75.

Huang Tao, Cheng Zhijian, Jia Zhiqiang, Zhao Xiaoguang, Wang Lei, Zhai Wenjing, Zhou Yongxin. Mechanism by which miR-146a regulates osteogenic differentiation of adipose derived mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(1): 70-75.

图/表（结果） 6

2.1 脂肪间充质干细胞的形态及鉴定结果原代分离培养的小鼠脂肪间充质干细胞初为小圆形，细胞大小不均匀。培养24 h后可见细胞基本已经完全贴壁，贴壁细胞呈成纤维细胞形态；48 h后换液去除非贴壁细胞，此时细胞已生长出触角，呈梭形或三角形，见图1A；五六天后细胞基本达到70%-80%融合，细胞呈成纤维样生长，形态一致。传代后细胞呈典型成纤维细胞样生长，具有一定的方向性。当传至第3代时，贴壁细胞形态均一，大部分呈梭形，细胞排列呈漩涡状且增殖速度快，见图1B。

细胞传代纯化后取第3代小鼠脂肪间充质干细胞进行流式检测CD29、CD44、CD45等标志物的表达，结果显示：CD29(98.9%)、CD44(97.0%)高表达，CD45(2.96%)低表达，具有间充质干细胞特性，见图2。

2.2 miR-146a在脂肪间充质干细胞向成骨分化过程中的表达量变化采用RT-PCR方法检测脂肪间充质干细胞成骨诱导第0，3，7，14，21天时miR-146a的mRNA表达。与第0天相比，在第3天时miR-146a表达下降约37%，之后继续下降，并在第14天时达到最低，虽然之后miR-146a的表达有所回升，但其表达量仍低于诱导之前(P < 0.05)，见图3。

2.3 miR-146a对脂肪间充质干细胞成骨分化的影响成骨诱导第6天，采用RT-PCR方法检测转染miR-NC、miR-146a mimic和miR-146a inhibitor之后各组细胞miR-146a mRNA表达变化，结果发现与miR-NC组相比，miR-146a mimic组细胞miR-146a的mRNA表达显著升高，miR-146a inhibitor组细胞miR-146a的mRNA表达显著减低(P < 0.05)，见图4A。采用碱性磷酸酶染色比较各组细胞成骨分化程度，结果发现miR-146a mimic组显色较miR-NC组和miR-146a inhibitor组明显减弱，而miR-146a inhibitor组与miR-NC组相比则显色增强，见图4B。碱性磷酸酶活性检测结果显示，与miR-NC组相比，miR-146a mimic组碱性磷酸酶表达活性显著降低，miR-146a inhibitor组碱性磷酸酶活性显著上升(P < 0.05)，见图4C。在成骨诱导后的第12天，采用茜素红染色鉴定细胞表面矿化基质的产生，与miR-NC组相比，miR-146a mimic组细胞的钙化程度显著降低，而miR-146a inhibitor组细胞的钙化程度显著升高(P < 0.05)，见图4D。

2.4 RT-PCR检测各组小鼠脂肪间充质干细胞成骨诱导后miR-146a、Runx2、ALP、AKT、PI3K的mRNA相对表达量与miR-NC组相比，miR-146a mimic组细胞miR-146a的mRNA表达水平显著升高，miR-146a inhibitor组显著降低(P < 0.05)，见图5A。与miR-NC组相比，miR-146a mimic组细胞Runx2、ALP、AKT和PI3K的mRNA表达水平显著降低，miR-146a inhibitor组显著升高(P < 0.05)，见图5B-E。

2.5 Western blot检测各组小鼠脂肪间充质干细胞成骨诱导后Runx2、ALP、Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K的蛋白表达与miR-NC组相比，Runx2、ALP、Akt、p-Akt、PI3K和p-PI3K的蛋白表达水平在miR-146a mimic组显著降低，而在miR-146a inhibitor组显著升高(P < 0.05)，见图6。

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引言

骨缺损多由创伤、外科手术及先天畸形引起，对患者的器官功能、外观及心理健康造成影响。近年来研究表明，组织工程技术成为修复骨缺损最有潜力的治疗方法之一[1-3]。间充质干细胞存在于人体的多种组织内，是一种具有高度自我更新及多方向分化能力的多能干细胞[4]。脂肪间充质干细胞在一定条件下，可被诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞及内皮细胞等多种类型的细胞[5-7]。
已有大量研究证实，miRNAs能够参与包括细胞增殖、分化、凋亡、衰老、组织器官发育及肿瘤发生等多种分子生物学过程[8-9]。近来，有文献报道miR-22、miR-100、
miR-106a、miR-138参与调控间充质干细胞的成骨分化[10-13]。miR-146a位于5号染色体LOC285628基因，有报道称其主要在先天免疫应答过程中起负调控作用[14]。匡威等[15]研究发现miR-146a能负向调控骨髓间充质干细胞成骨分化。PI3K/AKT是一种广泛存在于真核动物细胞中的信号通路，可参与包括细胞增殖、分化、凋亡在内的多种分子生物学过程[16-18]。
支立强等[19]发现SIRT1可通过PI3K/AKT信号通路调控大鼠成骨细胞分化。王雪鹏等[20]证明PI3K/AKT信号通路参与骨髓间充质干细胞增殖和分化过程。因此，研究PI3K/AKT信号通路在脂肪间充质干细胞成骨分化中的作用，可能会发现潜在的调控靶点。课题组前期利用生物学方法及在线数据库TargetSan (http:www.targetscan.org/)对可能的靶基因进行预测，结果发现PI3K/AKT信号通路中的结合位点可与
miRNA-146a互补结合，提示可能是其靶基因。
综上，miR-146a、PI3K/AKT可能参与调控脂肪间充质干细胞成骨分化，但目前尚无研究证明三者之间的作用机制。因此，该实验在脂肪间充质干细胞成骨分化过程中过表达和敲减miR-146a，探究miR-146a在脂肪间充质干细胞向成骨细胞分化中的作用及调控机制。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞生物学体外观察实验。
1.2 时间及地点实验于2018年9月至2019年10月在西安医学院第一附属医院形态学实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物雄性C57BL/6小鼠15只，4周龄，体质量为(180±20) g，购买于西安医学院实验动物中心，小鼠的腹股沟脂肪垫获取方法参照文献[21]。
1.3.2 实验主要仪器与试剂 DMEM/F12、胎牛血清、干细胞培养液(上海赛默飞世尔科技公司)；成骨诱导培养基(苏州赛业生物科技公司)；RT-PCR试剂(北京天根生化科技公司)；Trizol试剂、Lipofectamine 2000转染试剂(美国
Invitrogen公司)；碱性磷酸酶染色试剂盒(北京雷根生物技术公司)；RIPA裂解缓冲液(碧云天生物技术公司)；
miR-146a mimic、miR-146a inhibitor、miR-NC (上海吉玛制药技术有限公司)；羊抗人Runx2抗体、兔抗人Akt抗体、兔抗人p-Akt抗体、兔抗人PI3K抗体、兔抗人p-PI3K抗体(美国Sigma公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 小鼠脂肪间充质干细胞分离和培养向无菌条件下取出的小鼠腹股沟脂肪垫中加入含有1%盘尼西林的PBS，用PBS冲洗3次后，将组织剪碎并加入等体积0.2%Ⅰ型胶原酶进行消化(37 ℃振荡消化50 min)，1 000 r/min离心8 min，
将沉淀物用PBS清洗后加入3 mL含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬，离心，然后将其以2×106 L-1的细胞浓度接种于培养皿，并于37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱内孵育，每2 d更换1次培养基，细胞生长至70%-80%融合时，按1∶3进行传代。
1.4.2 流式细胞仪检测细胞表面分子标志选取第3代脂肪间充质干细胞，当细胞生长至70%-80%融合时加入0.25%Ⅰ型胶原酶进行消化，1 000 r/min离心5 min，收集细胞沉淀，PBS冲洗2次后计数，用100 μL PBS重悬，按说明书分别加入相应抗体及同型对照，混合均匀后于室温下避光反应
30 min，用流式细胞仪检测细胞表面分子表达。

1.4.3 miRNA转染由吉凯生物技术公司合成miR-146a
mimic、miR-146a inhibitor和阴性对照(miR-NC)。当传至第3代的脂肪间充质干细胞长至70%-80%融合时，用终浓度为
2 000 nmol/L的Lipofectamine 2000转染试剂分别将miR-146a mimic、miR-146a inhibitor和miR-NC转染到小鼠脂肪间充质干细胞中。在转染过程中，用Opti-MEM分别稀释待转染的miRNAs和Lipofectamine 2000，轻轻混匀后将其置于室温环境中静置5 min，之后将Lipofectamine 2000稀释液缓慢加入到待转染的miRNAs稀释液中，并将其置于室温环境中孵育20 min。将待转染细胞从培养箱中取出后弃去培养液，PBS漂洗3遍，弃去洗液后向每孔中加入1.5 mL Opti-MEM，并将miRNAs-Lipofectamine 2000混合液加入到待转染细胞中，混合均匀后继续培养，24 h后弃去转染工作液，PBS漂洗3遍。
1.4.4 体外成骨诱导分化取转染后的小鼠脂肪间充质干细胞以2×104个/cm2的密度接种于6孔板中，贴壁过夜，当细胞生长至70%-80%融合时，用成骨诱导培养液进一步诱导分化，每3 d换1次成骨诱导培养液。
1.4.5 碱性磷酸酶染色成骨诱导第6天，采用碱性磷酸酶染色检测钙化程度，倒掉细胞培养液，PBS冲洗细胞3次，将200 μL碱性磷酸酶底物加入到5 μL细胞裂解液中，于37 ℃
条件下孵育细胞45 min，加入50 μL 3 mol/L NaOH终止反应，并在405 nm处用酶标分析仪测定吸光度值，计算碱性磷酸酶活性。
1.4.6 茜素红染色成骨诱导第12天，采用茜素红染色鉴定细胞表面矿化基质的产生，倒掉细胞培养液，PBS冲洗细胞3次，在体积分数为70%乙醇中固定60 min，ddH2O冲洗3次，加入茜素红溶液染色10 min，ddH2O冲洗3次，显微镜下观察。
1.4.7 RT-PCR分析采用RT-PCR检测成骨诱导第0，3，7，14，21天时miR-146a的mRNA表达，成骨诱导第6天时成骨表型标志物的mRNA表达。根据Trizol说明书，提取各组细胞的总RNA，然后取1 μg总RNA，通过Revert
Aid First Strand cDNA synthesis 试剂盒进行反转录，合成cDNA，10 μL反应体系为：cDNA样本0.1 μL、SYBR Premix Ex Taq 5 μL、ROX Reference Dye II 0.2 μL、引物终浓度为0.2 μmol/L，
加ddH2O至10 μL。PCR扩增反应条件为：95 ℃预变性
15 min；95 ℃变性10 s，40个循环；60 ℃退火35 s，用2-ΔΔCt法计算基因表达的相对倍数。基因引物序列见表1。

1.4.8 Western blot检测成骨诱导第6天，采用Western blot检测成骨表型标志物的蛋白表达。在冰上提取各组细胞的总蛋白，通过BCA法测定蛋白的浓度，经电泳将蛋白转入硝酸纤维膜上，然后将膜在5%牛奶中封闭1 h，之后加入一抗(1∶5 000稀释的Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K单抗；1∶400稀释的ALP单抗；1∶200稀释的Runx2单抗)， 4 ℃孵育过夜，TBS洗膜3次，加入1∶3 000稀释的二抗，室温条件下孵育2 h，再次用TBS洗膜3次，ECL显色。
1.5 主要观察指标 ①碱性磷酸酶染色检测钙化程度；②茜素红染色鉴定细胞表面矿化基质的产生；③RT-PCR检测
miR-146a、Runx2、ALP、Akt、PI3K的mRNA表达；④ Western
blot检测Runx2、ALP、Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K的蛋白表达。
1.6 统计学分析通过SPSS 20.0软件对数据进行统计分析，所得数据用x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

LANGER等[22]于1993年提出的组织工程概念，随着该技术的迅速发展，骨组织工程技术为骨缺损修复的研究奠定了基础。脂肪间充质干细胞是目前组织工程学中最有研究潜力的间充质干细胞之一，有研究表明其具有多向分化潜能，且其来源广、数量足、获取简单、易培养、稳定性强、产量高[23-25]。因此，脂肪间充质干细胞在骨组织修复领域备受瞩目，如何提高脂肪间充质干细胞的成骨分化能力及成骨活性是当前研究的重点。
miRNA是一类小分子的非编码RNA，其在干细胞的转录调控网络中发挥重要作用。已有研究证明，很多miRNAs参与了间充质干细胞的成骨分化[26-27]。miR-196a可通过抑制HOXC的表达抑制脂肪间充质干细胞的成骨分化[28]；miR-26
可通过抑制Smad 1的表达抑制脂肪间充质干细胞的成骨分化[29]，这些miRNAs可能是骨缺损修复的关键因素。miR-146a已被证实在一些肿瘤组织中异常表达，可通过不同的靶基因调节肿瘤的生长[30-32]。该研究通过碱性磷酸酶染色、活性分析及茜素红染色观察发现miR-146a上调后能抑制脂肪间充质干细胞的成骨分化，而miR-146a下调则能促进脂肪间充质干细胞的成骨分化。
Runx2是一种重要的成骨细胞决定性转录因子，已有研究证明，成骨细胞的分化与Runx2活性增加有关，且Runx2是间充质细胞成骨分化过程中miRNA过表达的靶基因[33-35]。该研究通过Western blot技术检测了miR-146a上调及下调对成骨分化转录因子Runx2和成骨早期标志物ALP的表达，结果发现miR-146a能负向调控脂肪间充质干细胞的成骨分化。
PI3K/Akt可参与包括肿瘤发生、发展及转归在内的多项生物学过程的调控[16]。PI3K是一种脂类激酶，可通过被生长因子刺激而激活。Akt是一种丝氨酸激酶，可被激活的PIP3募集到细胞质膜上，从而被磷酸化[36-37]。已有研究证实，当PI3K/Akt信号被激活时，其下游的效应蛋白能促进成骨细胞分化[17]，但也有研究发现，PI3K/Akt信号能抑制成骨细胞分化[38]。因此，关于该信号对多能干细胞分化的调控机制还需要更多的研究。尽管先前的研究证明，miR-146a及PI3K/Akt均能参与调控脂肪间充质干细胞的成骨分化，但目前对于miR-146a如何调控磷酸化Akt表达，从而影响脂肪间充质干细胞成骨分化的机制仍不清楚。该研究证明了过表达
miR-146a会抑制p-Akt及p-PI3K表达，从而抑制小鼠脂肪间充质干细胞成骨分化；反之，敲减miR-146a会促进p-Akt及p-PI3K表达，从而促进小鼠脂肪间充质干细胞成骨分化。
综上所述，miR-146a可通过调控PI3K/Akt信号，负向调控脂肪间充质干细胞成骨相关基因Runx2和ALP的表达，进而影响脂肪间充质干细胞的成骨分化进程。miR-146a和PI3K/Akt可作为未来骨损伤修复的潜在治疗靶点，但其具体的作用机制还需进一步验证。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

miR-146a调控脂肪间充质干细胞成骨分化的机制

Mechanism by which miR-146a regulates osteogenic differentiation of adipose derived mesenchymal stem cells

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