“腰三针”干预腰多裂肌损伤大鼠多种氧化应激因子的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2863

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (32): 5145-5150.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2863

• 肌肉肌腱韧带组织构建 tissue construction of the muscle, tendon and ligament • 上一篇下一篇

“腰三针”干预腰多裂肌损伤大鼠多种氧化应激因子的表达

白振军1，刘通2，王自润1，张慧宇1，徐鹏1

¹山西大同大学中医药健康服务学院，山西省大同市 037009；²广东省第二中医院针灸康复科，广东省广州市 510095

收稿日期:2019-10-08 修回日期:2019-10-14 接受日期:2019-11-29 出版日期:2020-11-18 发布日期:2020-09-25
通讯作者: 刘通，博士，副主任中医师，广东省第二中医院针灸康复科，广东省广州市 510095
作者简介:白振军，男，1982年生，山西省朔州市人，汉族，2008年江西中医学院毕业，硕士，讲师，主要从事针灸临床作用机制的研究。
基金资助:
国家自然科学基金青年基金(81704179)；广东省中医药管理局面上项目(20191018)

Effect of “Lumbar Three Needles” on expression of oxidative stress factors in rats with multifidus muscles injury

Bai Zhenjun1, Liu Tong2, Wang Zirun1, Zhang Huiyu1, Xu Peng1

¹Chinese Medicine Health Service College, Shanxi Datong University, Datong 037009, Shanxi Province, China; ²Department of Acupuncture and Moxibustion, Guangdong Second Traditional Chinese Medicine Hospital, Guangzhou 510095, Guangdong Province, China

Received:2019-10-08 Revised:2019-10-14 Accepted:2019-11-29 Online:2020-11-18 Published:2020-09-25
Contact: Liu Tong, MD, Associate chief physician, Department of Acupuncture and Moxibustion, Guangdong Second Traditional Chinese Medicine Hospital, Guangzhou 510095, Guangdong Province, China
About author:Bai Zhenjun, Master, Lecturer, Chinese Medicine Health Service College, Shanxi Datong University, Datong 037009, Shanxi Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation for Young Scientists of China, No. 81704179; General Project of Guangdong Administration of Traditional Chinese Medicine, No. 20191018

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

多裂肌：是椎旁肌群中的重要肌肉之一，对脊柱稳定性的维持有重要作用。在腰椎后路手术过程中，多裂肌也是最容易被损伤的肌肉之一。

腰三针：由肾俞穴、大肠俞穴和委中穴组成，是临床治疗腰椎间盘突出症、椎管狭窄、腰肌劳损等腰部相关疾病的重要穴位。

氧化应激：是指机体氧化与抗氧化失衡，活性氧自由基生成与堆积过多，伴或不伴抗氧化能力下降引起的细胞化学损害及功能障碍。氧化应激和炎症反应可相互作用发生，氧化应激可诱发炎症，炎症亦可加重氧化应激。

背景：腰椎后路手术是目前临床进行诸多手术如椎间盘切除、椎管减压等的主要手术入路，但有10%-40%的腰椎后路手术患者在术后不久可再次出现腰背部疼痛及相关功能障碍，这与手术过程中对椎旁肌如多裂肌的过度牵拉或钝性损伤有关。

目的：观察腰三针对大鼠腰多裂肌损伤后氧化应激因子丙二醛、活性氧、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶及磷酸化蛋白激酶B表达的影响。

方法：将24只雄性SD大鼠随机分为3组，每组8只。模型组、腰三针组分别采用0.5%布比卡因盐酸盐肌内注射复制大鼠腰多裂肌损伤模型；对照组予生理盐水肌内注射。对照组与模型组造模后不进行针刺干预，腰三针组造模后给予针刺靳三针之“腰三针”，即大肠俞、肾俞、委中，针刺后连接电针，波形选用疏密波，电针频率采用2 Hz/10 Hz，电流强度选择1 mA，持续干预20 min，每天干预1次，共干预7 d。电针干预7 d后，通过苏木精-伊红染色观察损伤部位多裂肌形态学变化，采用试剂盒检测各组大鼠多裂肌中丙二醛、活性氧、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶的表达；采用Western-blot法检测多裂肌中磷酸化蛋白激酶B蛋白的表达。实验经广东省第二中医院实验动物伦理委员会批准，伦理批准号：048617。

结果与结论：①苏木精-伊红染色显示，干预7 d后，模型组可见肌纤维损伤明显，但已出现部分修复，但炎性细胞数量仍较多；腰三针组可出现较多新生的肌纤维，炎性细胞明显减少；②腰三针组肌纤维横截面积明显优于模型组(P < 0.01)；③干预后，模型组丙二醛、活性氧表达量明显高于对照组(P < 0.01)；腰三针组丙二醛、活性氧表达明显低于模型组(P < 0.01)，超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶表达高于模型组(P < 0.01或P < 0.05)；腰三针组磷酸化蛋白激酶B蛋白表达明显高于模型组(P < 0.01)；④结果说明，腰三针干预可显著降低多裂肌损伤后氧化应激水平，可能与提高磷酸化蛋白激酶B的表达有关。

ORCID: 0000-0003-3561-0602(白振军)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 实验, 鼠, 腰三针, 多裂肌, 氧化应激, 超氧化物歧化酶, 谷胱甘肽过氧化物酶, 氧化应激因子

Abstract:

BACKGROUND: Posterior lumbar spine surgery is currently the main surgical approach for many surgical operations such as discectomy and spinal canal decompression. However, 10%-40% of patients with posterior lumbar spine surgery can have low back pain and related dysfunctions soon after surgery, which is related to excessive stretching or blunt injury to the paraspinal muscles such as the multifidus muscle during the operation.

OBJECTIVE: To explore the effect of “Lumbar Three Needles” on the expression of oxidative stress factors, including malondialdehyde, reactive oxygen species, superoxide dismutase, glutathione peroxidase and phosphorylated protein kinase B, in rats with multifidus muscles injury.

METHODS: Twenty-four male Sprague-Dawley rats were randomly divided into control group, model group and “Lumbar Three Needles” group, with 8 rats in each group. An animal model of multifidus muscles injury was made by intramuscular injection of 0.5% bupivacaine hydrochloride in the model and treatment groups in control and “Lumbar Three Needles” group, while normal saline was injected in the control group. No acupuncture intervention was given in the control group and model group, while Dachangshu, Shenshu and Weizhong acupoints were electroacupunctured in the “Lumbar Three Needles” group. Needles were then stimulated electrically using a Han's Acupoint Nerve Stimulator with density wave, frequency of 2 Hz/10 Hz and continuous current of 1 mA for 20 minutes, once daily for 7 days in total. The multifidus muscle was stained with hematoxylin-eosin staining to observe morphological changes, and kits were used to observe the expression of malondialdehyde, reactive oxygen species, superoxide dismutase, and glutathione peroxidase, while western blot was applied to observe the expression of phosphorylated protein kinase B. The study protocol was approved by the Animal Ethic Committee of Guangdong Second Traditional Chinese Medicine Hospital with an approval No. 048617.

RESULTS AND CONCLUSION: Hematoxylin-eosin staining results indicated that the muscle fibers were partially fixed in the model group and there were still a lot of macrophages after 7 days of intervention. Compared with the model group, more newborn muscle fibers and fewer macrophages could be seen in the “Lumbar Three Needles” group. After intervention, the cross-sectional area of the multifidus muscles in the “Lumbar Three Needles” group was significantly bigger than that in the model group (P < 0.01). The expression levels of malondialdehyde and reactive oxygen species in the model group were significantly increased compared with the control group (P < 0.01) and “Lumbar Three Needles” group (P < 0.01). The expression of superoxide dismutase, glutathione peroxidase and phosphorylated protein kinase B in the “Lumbar Three Needles” group was significantly higher than that in the model group (P < 0.01 or P < 0.05). Therefore, “Lumbar Three Needles” can significantly decrease the oxidative stress level after multifidus muscle injury, which may be related to the improvement of phosphorylated protein kinase B.

Key words: experiment, rat, Lumbar Three Needles, multifidus muscle, oxidative stress, malondialdehyde, reactive oxygen species, superoxide dismutase, oxidative stress factors

中图分类号:

白振军, 刘通, 王自润, 张慧宇, 徐鹏. “腰三针”干预腰多裂肌损伤大鼠多种氧化应激因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(32): 5145-5150.

Bai Zhenjun, Liu Tong, Wang Zirun, Zhang Huiyu, Xu Peng. Effect of “Lumbar Three Needles” on expression of oxidative stress factors in rats with multifidus muscles injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(32): 5145-5150.

图/表（结果） 4

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2018年9月至2019年5月在大同大学基础医学实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物清洁级成年雄性SD大鼠24只，体质量(130±10) g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,许可证编号：SCXK(京)2012-0001。动物饲养于大同大学动物实验室，自由饮水、摄食，24 ℃、40%-50%湿度环境下适应性饲养7 d，自然照明，明暗周期12 h。7 d后，采用随机数字表将所有大鼠随机分为对照组、模型组、腰三针组，每组各8只。

动物的使用及处置按照国家科学技术部2006年《关于善待实验动物的指导性意见》中相关伦理标准规定实施。实验经广东省第二中医院实验动物伦理委员会批准，伦理批准号：048617。

1.3.2 实验用主要试剂布比卡因盐酸盐(Sigma)；40 g/L多聚甲醛溶液(北京博扬宏达生物科技有限公司)；体积分数10%水合氯醛(北京博扬宏达生物科技有限公司)；丙二醛试剂盒、活性氧试剂盒、超氧化物歧化酶试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶试剂盒(南京建成生物工程研究所)，β-actin抗体(Bioss)，磷酸化蛋白激酶B抗体(Abcam)，ECL发光液(Thermo Pierce)；蛋白Marker(Biorad)；PVDF膜(美国MILLIPORE公司)。

1.3.3 实验仪器韩氏穴位神经刺激仪(HANS-200A，北京冀诺泰科技发展有限公司)；高速台式冷冻离心机(TGL-16，长沙湘仪离心机有限公司)；凝胶成像系统(Fluor Chem FC2，美国Alpha Innotech公司)；蛋白质电泳及转膜系统(美国Bio-Rad公司)；正置智能型显微镜及采集系统(BX53，奥林巴斯，中国有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠腰多裂肌损伤模型制备将模型组、腰三针组大鼠分别固定，以体积分数10%水合氯醛(350 mg/kg)进行腹腔注射麻醉，将大鼠双侧髂棘最高点与腰椎连线，根据其连线与脊柱的交点棘突定位L₆椎体，后选择双侧脊柱L₄-L₅水平两旁的4个点，定位消毒后，选择1 mL注射器，一次性抽取0.5%布比卡因盐酸盐溶液600 μL，紧贴棘突垂直刺破皮肤后，直刺进针，待针尖碰到关节突和乳突骨面后，回抽无血，慢慢向多裂肌注射布比卡因盐酸盐溶液 (150 μL×4)，以保证药物的充分吸收。对照组采用同样方法注射等量生理盐水溶液^[6]。

1.4.2 各组干预方法 ①对照组不做任何处理，模型组仅仅给予造模。2组大鼠均与腰三针组大鼠同步抓取、固定，不针刺。②腰三针组：参照《实验针灸学》^[8]，选择双侧“委中”穴、“肾俞穴”和“大肠俞穴”，委中穴定位：膝关节背面正中；肾俞穴定位；第2腰椎旁开7 mm；大肠俞穴定位：第4腰椎旁开7 mm，直刺进针后，将同侧的肾俞穴及大肠俞穴连接电针仪；双侧委中穴分别连接电针仪(分别在双侧委中穴外开0.5 cm处浅刺一针作为辅助电极)，波形选用疏密波，频率选择2 Hz/10 Hz，电流强度1 mA；持续20 min，每天干预1次，连续干预7 d。

1.4.3 取材方法干预7 d后，以体积分数10%水合氯醛 (350 mg/kg)进行腹腔注射麻醉，用剪刀将背部取材区域的皮毛剪除干净，随后剪开背部皮肤，慢慢用镊子剥离最长肌和髂肋肌，显示多裂肌，随后将双侧L₄和L₅水平多裂肌剪下，左侧多裂肌置40 g/L多聚甲醛溶液固定以备苏木精-伊红染色，右侧多裂肌置于液氮中，冷却后存入-80 ℃冰箱以备Western-blot检测。

1.4.4 苏木精-伊红染色观察各组多裂肌的形态学变化 40 g/L多聚甲醛溶液固定48 h后，常规乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋、切片，切片厚度5 μm，二甲苯脱蜡后水化，苏木精-伊红染色，脱水，透明，封固。400倍光镜下分别观察肌肉横截面及纵截面切片，横截面切片以每个样本左下象限视野为观察区域，釆用Image J软件统计分析干预前后肌纤维横截面积的变化，纵截面切片观察肌肉的损伤修复情况。

1.4.5 各组多裂肌组织中丙二醛、活性氧、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶的表达采用TBA法检测大鼠多裂肌中丙二醛的表达，化学荧光法检测活性氧表达，采用WST-1法检测超氧化物歧化酶表达，采用比色法测定谷胱甘肽过氧化物酶表达。均严格按照试剂盒说明进行操作。每个样本重复3次，取均值进行统计。

1.4.6 Western-blot法检测各组多裂肌组织中磷酸化蛋白激酶B蛋白的表达取冻存多裂肌组织，剪碎后，加入适量RIPA裂解液和蛋白酶抑制剂，匀浆后离心配平，离心提取细胞总蛋白并进行定量。加入适量Loading buffer，95 ℃沸水煮5 min进行蛋白变性，采用Birad电泳及转膜系统将蛋白转移到PVDF膜上，转膜完毕后，用含5%脱脂奶粉的TBST封闭1 h，后用磷酸化蛋白激酶B一抗(1∶1 000)4 ℃摇床孵育过夜，TBST洗膜后加入5%脱脂奶粉稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗，室温下摇床孵育 1 h，TBST洗膜后加入ECL显色，反应3 min。β-actin为内参对照。凝胶成像系统采集图像，Image J软件进行定量分析，取磷酸化蛋白激酶B与β-actin吸光度比值作为目标蛋白的相对表达量进行统计分析。

1.5 主要观察指标 ①各组大鼠多裂肌的形态学变化；②各组大鼠肌肉横截面积的差异；③各组大鼠多裂肌组织中丙二醛、活性氧、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶的表达；④各组大鼠多裂肌组织中磷酸化蛋白激酶B蛋白的表达。

1.6 统计学分析应用SPSS 21.0软件进行统计学处理。各组数据结果均用x(_)±s表示。对于服从正态分布的数据，组间比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD-t 检验；对于不服从正态分布的数据，组间比较采用非参数检验。以P < 0.05表示差异有显著性意义，P < 0.01表示差异有非常显著性意义。

讨论

腰椎后路手术是目前临床上常用的腰椎手术方法，尽管手术可较好地解决患者局部神经压迫及功能障碍症状，但是手术后有大量患者会再次出现疼痛及腰部功能障碍^[9-10]。针对这一问题，尽管有大量学者提出了较多新式的腰椎手术方法，如微创手术、腰椎前路手术等，但新的手术方法在对脊旁肌的保护方面并未显示出明显的临床优势^[11]。因此，如何促进手术后脊旁肌损伤后修复仍是目前学术界亟待解决的临床问题，这对保证患者的手术效果，改善手术后的腰椎功能障碍有重要意义。

多裂肌是椎旁肌群中的重要肌肉之一，对脊柱稳定性的维持有重要作用。而在腰椎后路手术过程中，多裂肌也是最容易被损伤的肌肉之一，目前对其机制主要有三大学说：手术中多裂肌的失神经支配^[12-13]；手术中长时间牵拉引起多裂肌挤压性缺血^[14]；术中对多裂肌附着点的破坏导致肌肉出现炎性损伤^[15]。失神经支配、缺血、炎症反应均是导致氧化应激的重要原因，因此氧化应激在腰椎后路术后多裂肌损伤中可能扮演重要角色。此外，研究发现，肌肉损伤后7 d时肌肉开始出现自然修复^[16]，因而此时的氧化应激可能为巅峰时期，其后氧化应激将逐步减弱，故而此次实验选取7 d作为观察时间点。

腰三针是临床治疗腰椎间盘突出症、椎管狭窄、腰肌劳损等腰部相关疾病的重要穴位^[17-19]，究其原因，委中穴位于腘窝正中，五腧穴属性为足太阳膀胱经合穴，足太阳膀胱经脉循行路线“从腰中，下夹脊，贯臀，入腘中”，因此，刺激委中对疏调腰背之气有明显作用，四总穴歌中常言“腰背委中求”，也足以显示委中穴对腰背部经气的靶向疏导作用。肾俞穴与大肠俞同位于膀胱经循行路线之上，且“腰为肾之府”，肾俞穴和大肠俞对腰背部经气主要起局部疏导作用。三穴配伍，可相得益彰，增强疗效。

氧化应激是指机体氧化与抗氧化失衡，活性氧自由基生成与堆积过多，伴或不伴抗氧化能力下降引起的细胞化学损害及功能障碍。氧化应激和炎症反应可相互作用发生，氧化应激可诱发炎症，炎症亦可加重氧化应激。腰椎手术过程中，自动拉钩的常规应用可导致多裂肌肌内压力的增加，引起肌肉血流量降低，肌肉发生缺血缺氧性损伤，术后牵拉放松后，血液供应虽然恢复，氧供增加，但此时炎症细胞大量浸润，中性粒细胞在吞噬活动时消耗大量的氧，所摄取的大部分氧经细胞内NADPH氧化酶和NADH氧化酶的催化，产生大量的氧自由基。细胞内产生过多的氧自由基是骨骼肌缺血再灌注损伤的主要原因。一般来说，体内的氧自由基主要包括超氧阴离子、羟自由基和过氧化氢等，此外，体内还存在有两类抗氧化系统，分别为酶抗氧化系统，包括超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶等。生理情况下，两类系统处于动态平衡，相互制约，当氧自由基异常增多时，抗氧化物大量消耗，氧化作用强过抗氧化作用，则产生氧化应激。氧化应激对细胞的损伤主要是破坏细胞膜的结构和功能，破坏线粒体从而截断细胞的能量来源，破坏溶酶体，产生细胞自容、凋亡^[20]。LU等^[21]的研究证实，牵拉损伤后，氧化指标和炎性介质的升高，是造成牵拉后多裂肌严重损伤的重要原因^[22]。胡志军^[23]的研究也发现，术后3 h，多裂肌组织过氧化指标丙二醛明显升高，而抗氧化指标超氧化物歧化酶和还原型谷胱甘肽过氧化物酶含量却明显降低，组织处于氧化应激状态。

此次研究发现，造模后多裂肌中丙二醛、活性氧表达明显升高，超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶表达降低，腰三针电针干预可有效逆转局部损伤多裂肌中丙二醛、活性氧、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶表达。同时，苏木精-伊红染色中的肌纤维损伤程度及炎性反应也与氧化应激程度显性相关，以上表明腰三针在改善多裂肌损伤后局部的氧化应激损伤及局部炎症反应方面均有显著作用。此外，研究还发现腰三针组磷酸化蛋白激酶B的表达要显著高于模型组和对照组，这可能是因为腰三针组在治疗7 d时并未恢复到正常水平，仍处于修复阶段，故而磷酸化蛋白激酶B表达可能会高于正常组，而正常组因为没有损伤，故而磷酸化蛋白激酶B表达仅仅处于基础水平。该结果提示腰三针降低氧化应激可能是通过提高磷酸化蛋白激酶B(Akt)的表达实现的。Akt可作为多个信号通路的上下游分子被激活，从而参与机体生理病理活动，如PI3K/Akt通路、Akt/NF-κB通路、Akt/mTOR通路等。PI3K/Akt通路是机体抵抗氧化应激的重要途径之一。有研究发现，PI3K/Akt通路在机体出现氧化应激时可调节细胞的坏死与凋亡，抑制Akt活性则导致机体对活性氧更加敏感，进一步加重氧化损伤^[24-25]。同样，Akt/NF-κB通路及Akt/mTOR通路均与氧化应激之间存在密切联系^[26-27]，但腰三针到底通过哪条通路调控了多裂肌损伤后的氧化应激仍需以后进一步验证。

综上，此次研究发现腰三针电针干预可降低损伤局部多裂肌的氧化应激反应，该作用可能与提高磷酸化蛋白激酶B的表达有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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