脂肪间充质干细胞移植减轻大鼠肾缺血再灌注损伤的机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1550

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (5): 749-755.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1550

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脂肪间充质干细胞移植减轻大鼠肾缺血再灌注损伤的机制

雷雨^1，2，刘蓉安²，曾帆²

¹西南医科大学，四川省泸州市 646000；²四川省人民医院重症医学科，四川省成都市 610072

修回日期:2018-11-05 出版日期:2019-02-18 发布日期:2019-02-18
通讯作者: 曾帆，博士，主治医师，四川省人民医院重症医学科，四川省成都市 610072
作者简介:雷雨，女，1985年生，2009年成都医学院毕业，四川省成都市人，汉族，主治医师。
基金资助:
四川省干保部课题(2015-204)，项目负责人：曾帆

Underlying mechanism by which adipose-derived mesenchymal stem cell transplantation alleviates renal ischemia-reperfusion injury in rats

Lei Yu^{1, 2}, Liu Rongan², Zeng Fan²

¹Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; ²Department of ICU, Sichuan Provincial People’s Hospital, Chengdu 610072, Sichuan Province, China

Revised:2018-11-05 Online:2019-02-18 Published:2019-02-18
Contact: Zeng Fan, MD, Attending physician, Department of ICU, Sichuan Provincial People’s Hospital, Chengdu 610072, Sichuan Province, China
About author:Lei Yu, Attending physician, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
Supported by:
the Cadre Health Care Project of Sichuan Province, No. 2015-204 (to ZF)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
脂肪间充质干细胞移植：脂肪间充质干细胞来源于脂肪组织，被认为是组织工程与再生的潜在种子细胞资源。因其来源丰富、获取简便、不易造成较大创伤等优点逐渐被应用于损伤组织器官的修复，也可实现自体即刻移植。已有研究证实，脂肪间充质干细胞对缺血再灌注肾损伤具有保护作用，但相关机制尚不明确。
肾缺血再灌注损伤：是由手术、休克、器官移植等原因引起的肾脏血流暂时中断至血流恢复的复杂病理生理过程，其主要机制是炎症反应和氧化应激，引起肾组织线粒体损伤和炎症因子活化，最终导致异常增多的氧自由基损伤肾小管上皮细胞，坏死的肾小管增多则引发肾功能衰竭。因此，降低氧化应激水平、抑制炎症反应、减少肾小管上皮细胞死亡、促进肾小管再生修复则是治疗缺血再灌注肾损伤的关键。研究证实，骨髓间充质干细胞可通过免疫调节和促进再生修复减轻缺血再灌注肾损伤。

摘要
背景：缺血再灌注引起的急性肾损伤是有较高死亡率的临床常见问题，尚缺乏有效治疗方法。目前，已有一些间充质干细胞移植应用于改善此病情的研究，但可能机制仍不明确。
目的：观察脂肪间充质干细胞移植对大鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用及其可能机制。
方法：实验所用SD大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，分离培养SD大鼠腹股沟部位脂肪组织，获得脂肪间充质干细胞并鉴定；将30只大鼠夹闭左肾动脉，45 min后去除动脉夹恢复血流建立肾缺血再灌注大鼠模型，随机分为移植对照组和干细胞移植组，每组15只，另取15只大鼠作为假手术组，其中，移植对照组尾静脉注射生理盐水，干细胞移植组尾静脉注射脂肪间充质干细胞。在移植后5，15 和30 d进行下列检测：荧光显微镜观察大鼠肾组织冰冻切片中脂肪间充质干细胞定植情况；ELISA法检测血清肌酐与尿素氮水平；生化法检测肾组织中丙二醛含量；石蜡切片苏木精-伊红染色观察肾组织病理学结构并进行肾小管损伤评分；Western blot法检测肾组织中谷胱甘肽过氧化物酶4的表达。
结果与结论：①分离培养的SD大鼠脂肪间充质干细胞表达CD90和CD44，具有多向分化能力，移植对照组肾组织无绿色荧光，干细胞移植组在移植后5 d可见绿色荧光；②与移植对照组比较，干细胞移植组血清肌酐与尿素氮水平、肾组织丙二醛含量及肾小管损伤评分降低(P < 0.05)，肾组织谷胱甘肽过氧化物酶4表达升高(P < 0.05)，肾组织形态结构有明显改善；③以上结果说明，脂肪间充质干细胞移植可减轻大鼠肾缺血再灌注损伤，可能通过促进肾组织中谷胱甘肽过氧化物酶4的表达发挥抗脂质过氧化作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID:0000-0001-8578-0955(雷雨)

关键词: 脂肪间充质干细胞, 肾缺血再灌注损伤, 干细胞移植, 谷胱甘肽过氧化物酶4, 肾小管损伤, 急性肾损伤

Abstract:

BACKGROUND: Acute renal injury induced by ischemia and reperfusion is a common clinical problem with high mortality, and there is no effective treatment. Mesenchymal stem cell transplantation has been used to improve the condition of the disease, but the possible mechanism is still unclear.
OBJECTIVE: To investigate the protective effect of adipose-derived mesenchymal stem cell transplantation on renal ischemia-reperfusion injury in rats and its possible mechanism.
METHODS: Adipose-derived mesenchymal stem cells were isolated from the inguinal adipose tissue of Sprague-Dawley rats (provided by Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. in China), cultured and identified. Thirty rat models of renal ischemia-reperfusion were established by 45 minutes of clipping the left renal artery and randomly divided into transplantation control group and stem cell transplantation group, 15 rats in each group. Another 15 rats were selected as sham operation group. Adipose-derived mesenchymal stem cells were injected into the tail vein of the stem cell transplantation group and the normal saline was injected into the tail vein of the control group. The following tests were performed 5, 15 and 30 days after transplantation: frozen sections of rat kidney tissue were observed by fluorescence microscope for the colonization of adipose-derived mesenchymal stem cells; serum creatinine and urea nitrogen levels were detected by ELISA; malondialdehyde content in the renal tissue was detected by biochemical method; renal pathological structure was observed by hematoxylin-eosin staining in paraffin slices and renal tubule damage was scored; glutathione peroxidase 4 expression in renal tissue was detected by western blot.
RESULTS AND CONCLUSION: Adipose-derived mesenchymal stem cells from Sprague-Dawley rats expressed CD90 and CD44, and showed multidirectional differentiation. There was no green fluorescence in the renal tissue of transplantation control group, but green fluorescence was observed in the stem cell transplantation group at 5 days after transplantation. Compared with the transplantation control group, the serum creatinine and urea nitrogen levels, malondialdehyde content in renal tissue and renal tubular injury score were significantly lower in the stem cell transplantation group (P < 0.05), while the expression of glutathione peroxidase 4 was significantly increased (P < 0.05). The renal tissue morphology of the stem cell transplantation group improved significantly compared to the transplantation control group. These results suggest that adipose-derived mesenchymal stem cell transplantation can alleviate renal ischemia-reperfusion injury in rats, and may play an anti-lipid peroxidation role by promoting the expression of glutathione peroxidase 4 in the renal tissue.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Tissue Engineering, Stem Cells, Mesenchymal Stem Cells

中图分类号:

R456
R364

雷雨，刘蓉安，曾帆. 脂肪间充质干细胞移植减轻大鼠肾缺血再灌注损伤的机制[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(5): 749-755.

Lei Yu, Liu Rongan, Zeng Fan . Underlying mechanism by which adipose-derived mesenchymal stem cell transplantation alleviates renal ischemia-reperfusion injury in rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(5): 749-755.

图/表（结果） 3

2.1 实验大鼠数量分析 实验的50只SD大鼠中体外实验5只。体内实验45只，其中15只用于假手术组，其中1只术后死亡，30只用于造模，1只移植术后死亡，3只造模不成功；最后，假手术组14只大鼠、移植对照组13只大鼠、干细胞移植组13只大鼠。最终共40只大鼠的实验数据计入结果分析。

2.2 大鼠脂肪间充质干细胞的鉴定 如图1A所示，流式细胞术检测间充质干细胞表面标志物的结果显示，所收集的大鼠脂肪间充质干细胞中黏附分子CD44和CD90的阳性率分别为97.9%和99.5%；成骨诱导21 d后，茜素红S染色后，光学显微镜下可见散在分布的深红色钙结节，见图1B，提示成骨分化阳性；成软骨诱导28 d后，阿利新蓝染色后，光镜下可见致密的块状组织被染成灰蓝色，说明组织内含有酸性黏多糖，见图1C，提示成软骨分化阳性；成脂诱导10 d后，油红O染色后，光学显微镜下可见胞质内有大小不一的黄色脂滴，见图1D，提示成脂分化阳性。

以上结果证实，分离培养的是纯度较好的脂肪间充质干细胞。
2.3 脂肪间充质干细胞在大鼠肾脏中定植的观察 如图2A，B所示，实验将用于标记干细胞的荧光染料注射至对照组大鼠体内，注射5 d后，荧光显微镜下肾脏血管球内可见绿色荧光，注射15 d后血管内绿色荧光消失；如图2C所示，注射5 d后，干细胞移植组大鼠肾组织中有沿肾小管上皮腔面分布的绿色荧光，提示大鼠肾脏内有脂肪间充质干细胞定植在肾小管；移植15和30 d，干细胞移植组大鼠的肾组织中未见绿色荧光，见图2D，E，说明随着移植时间的延长，脂肪间充质干细胞可能发生分化减弱了荧光强度。

2.4 脂肪间充质干细胞对大鼠肾功能的影响 实验取移植后5，15和30 d检测大鼠肌酐和尿素氮水平。如图3所示，与假手术组比较，移植后5，15和30 d，移植对照组和干细胞移植组大鼠肌酐和尿素氮水平升高(P < 0.01)；与移植对照组比较，移植后5，15和30 d干细胞移植组大鼠肌酐和尿素氮水平降低(P < 0.01)；与移植后5 d比较，干细胞移植组移植15和30 d后大鼠肌酐和尿素氮水平降低(P < 0.01)。说明移植脂肪间充质干细胞能改善肾功能。

2.5 脂肪间充质干细胞对大鼠肾组织脂质过氧化水平的影响 实验检测了移植后5，15和30 d大鼠肾组织中丙二醛含量，如图4所示，与假手术组比较，移植后5，15和30 d，移植对照组和干细胞移植组大鼠肾组织丙二醛含量升高 (P < 0.01)；与移植对照组比较，移植后5，15和30 d干细胞移植组大鼠肾组织丙二醛含量降低(P < 0.01)；与移植后5 d比较，干细胞移植组移植15和30 d后大鼠肾组织丙二醛含量降低(P < 0.01)。说明移植脂肪间充质干细胞能降低肾组织细胞的脂质过氧化水平。

2.6 脂肪间充质干细胞对大鼠肾组织病理学变化的影响 光学显微镜下观察肾组织苏木精-伊红染色切片，如图5A-G所示，与假手术组比较，移植对照组和干细胞移植组大鼠肾组织存在不同程度的病理变化，主要表现为肾皮质内的肾小管上皮细胞水肿、变性及坏死，肾小管管腔扩张，肾间质水肿和炎细胞浸润；与移植对照组比较，干细胞移植组随着移植时间的延长，肾组织损伤程度减轻明显。为了进一步评价肾小管的损伤程度，实验进行了肾小管损伤评分，如图5H所示，与假手术组比较，移植对照组和干细胞移植组在移植后5，15和30 d肾小管损伤评分均升高(P < 0.05)；与移植对照组比较，干细胞移植组在移植后5，15和30 d肾小管评分降低(P < 0.05)；与移植后5 d比较，干细胞移植组在移植后15和30 d肾小管评分降低(P < 0.05)；与移植后15 d比较，干细胞移植组在移植后30 d肾小管评分降低(P < 0.05)提示移植脂肪间充质干细胞能减轻肾小管损伤。

2.7 脂肪间充质干细胞对大鼠肾组织谷胱甘肽过氧化酶4表达的影响 为了进一步探讨脂肪间充质干细胞抗脂质过氧化作用的机制，实验应用Western blot检测3组大鼠肾组织中谷胱甘肽过氧化酶4蛋白的表达情况，如图6所示，与假手术组比较，移植后5和15 d，移植对照组和干细胞移植组大鼠肾组织谷胱甘肽过氧化酶4表达降低(P < 0.05)；与移植对照组比较，移植后5和15 d干细胞移植组大鼠肾组织谷胱甘肽过氧化酶4表达升高(P < 0.05)；与移植后5 d比较，干细胞移植组在移植后15 d大鼠肾组织谷胱甘肽过氧化酶4表达升高(P < 0.05)；与移植后15 d比较，干细胞移植组在移植后30 d大鼠肾组织谷胱甘肽过氧化酶4表达降低(P < 0.05)。提示移植脂肪间充质干细胞能促进谷胱甘肽过氧化酶4的表达，但随着时间延长作用减弱。

参考文献

[1] Yu SQ, Ma S, Wang DH. Activation of TRPV1 prevents salt-induced kidney damage and hypertension after renal ischemia-reperfusion injury in rats. Blood Press Res. 2018;43(4):1285-1296.

[2] Barakat M, Gabr MM, Zhran F, et al. Upregulation of heme oxygenase 1 (HO-1) attenuates kidney damage, oxidative stress and inflammatory reaction during renal ischemia/ reperfusion injury. Gen Physiol Biophys. 2018.37(2):193-204.

[3] Wang W, Wang A, Luo G, et al. S1P1 receptor inhibits kidney epithelial mesenchymal transition triggered by ischemia/reperfusion injury via the PI3K/Akt pathway. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 2018; 50(7): 651-657.

[4] Cruces P, Lillo P, Salas C, et al. Renal decapsulation prevents intrinsic renal compartment syndrome in ischemia-reperfusion-induced acute kidney injury: a physiologic approach. Crit Care Med. 2018;46(2): 216-222.

[5] He Z, Tang H, You X, et al. BAPTA-AM Nanoparticle for the curing of acute kidney injury induced by ischemia/reperfusion. J Biomed Nanotechnol. 2018;14(5):868-883.

[6] Ohtake T, Kobayashi S, Slavin S, et al. Human peripheral blood mononuclear cells incubated in vasculogenic conditioning medium dramatically improve ischemia/reperfusion acute kidney injury in mice. Cell Transplant. 2018;27(3):520-530.

[7] Kim JS, Jang HJ, Jeong EK, et al. Crepidiastrum denticulatum extract ameliorates kidney ischemia-reperfusion injury in mice. Transplant Proc. 2018;50(4):1160-1166.

[8] Choi YJ, Zhou D, Barbosa ACS, et al. Activation of constitutive androstane receptor ameliorates renal ischemia-reperfusion-induced kidney and liver injury. Mol Pharmacol. 2018;93(3):239-250.

[9] Sheashaa H, Lotfy A, Elhusseini F, et al. Protective effect of adipose-derived mesenchymal stem cells against acute kidney injury induced by ischemia-reperfusion in Sprague-Dawley rats. Exp Ther Med. 2016;11(5):1573-1580.

[10] Li B, Cohen A, Hudson TE, et al. Mobilized human hematopoietic stem/progenitor cells promote kidney repair after ischemia/reperfusion injury. Circulation. 2010;121(20):2211-2220.

[11] Lin KC, Yip HK, Shao PL, et al. Combination of adipose-derived mesenchymal stem cells (ADMSC) and ADMSC-derived exosomes for protecting kidney from acute ischemia-reperfusion injury. Int J Cardiol. 2016;23(216):173-185.

[12] Xing L, Cui R, Peng L, et al. Mesenchymal stem cells, not conditioned medium, contribute to kidney repair after ischemia-reperfusion injury. Stem Cell Res Ther. 2014;5(4):1-12.

[13] Wise AF, Williams TM, Kiewiet MB, et al. Human mesenchymal stem cells alter macrophage phenotype and promote regeneration via homing to the kidney following ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Renal Physiol. 2014;306(10):F1222-1235.

[14] Ayatollahi M, Hesami Z, Jamshidzadeh A, et al. Antioxidant effects of bone marrow mesenchymal stem cell against carbon tetrachloride- induced oxidative damage in rat livers. Int J Organ Transplant Med. 2014;5(4):166-173.

[15] Kim Y, Jo SH, Kim WH, et al. Antioxidant and anti-inflammatory effects of intravenously injected adipose derived mesenchymal stem cells in dogs with acute spinal cord injury. Stem Cell Res Ther. 2015;6(1):229.

[16] Zhang JB, Wang XQ, Lu GL, et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells therapy for acute kidney injury induced by ischemia-reperfusion in a rat model. Clin Exp Pharmacol Physiol. 2017;44(12):1232-1240.

[17] 侯晓琳,郁卫东,崔梅花,等.小鼠脂肪间充质干细胞的分离培养及肠道归巢[J].中国组织工程研究,2015,19(6):854-860.

[18] 周丽娜,王玉新,方林,等.内皮祖细胞修复缺血再灌注大鼠肾损伤[J].中国组织工程研究,2014,18(32):5146-5151.

[19] Sung PH, Chiang HJ, Wallace CG, et al. Exendin-4-assisted adipose derived mesenchymal stem cell therapy protects renal function against co-existing acute kidney ischemia-reperfusion injury and severe sepsis syndrome in rat. Am J Transl Res. 2017;9(7):3167-3183.

[20] 胡红林,王共先,邹丛,等.骨髓间充质干细胞治疗肾缺血再灌注损伤的旁分泌机制[J].中国组织工程研究与临床康复,2011,15(32):5995-5998.

[21] Zou X, Jiang K, Puranik AS, et al. Targeting murine mesenchymal stem cells to kidney injury molecule-1 improves their therapeutic efficacy in chronic ischemic kidney injury. Stem Cells Transl Med. 2018;7(5): 394-403.

[22] Guo Q, Wang J. Effect of combination of vitamin E and umbilical cord-derived mesenchymal stem cells on inflammation in mice with acute kidney injury. Immunopharmacol Immunotoxicol. 2018;40(2):168-172.

[23] Lee SJ, Ryu MO, Seo MS, et al. Mesenchymal stem cells contribute to improvement of renal function in a canine kidney injury model. In Vivo. 2017;31(6):1115-1124.

[24] Tian SF, Jiang ZZ, Liu YM, et al. Human urine-derived stem cells contribute to the repair of ischemic acute kidney injury in rats. Mol Med Rep. 2017;16(4):5541-5548.

[25] Jiang Y, Jahagirdar BN, Reinhardt RL, et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 2002;418(6893):41-49.

[26] Pavyde E, Usas A, Maciulaitis R. Regenerative pharmacology for the treatment of acute kidney injury: skeletal muscle stem/progenitor cells for renal regeneration? Pharmacol Res. 2016;113(Pt B):802-807.

[27] Fateme Zhaleh, Fatemeh Amiri, Mohammad Mohammadzadeh-Vardin, et al. Nuclear factor erythroid-2 related factor 2 overexpressed mesenchymal stem cells transplantation, improves renal function, decreases injuries markers and increases repair markers in glycerol-induced Acute kidney injury rats. 2016;19(3):323-329.

[28] Kuppe C, Kramann R. Role of mesenchymal stem cells in kidney injury and fibrosis. Curr Opin Nephrol Hypertens. 2016;25(4):372-377.

[29] Cóndor JM, Rodrigues CE, Sousa Moreira Rd, et al. Treatment with human wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells attenuates sepsis-induced kidney injury, liver injury, and endothelial dysfunction. Stem Cells Transl Med. 2016;5(8):1048-1057.

[30] Elhusseini FM, Saad MA, Anber N, et al. Long term study of protective mechanisms of human adipose derived mesenchymal stem cells on cisplatin induced kidney injury in sprague-dawley rats. Regen Med. 2016;12(1):36-48.

[31] Murata S, Sugiyama N, Maemura K, et al. Quantified kidney echogenicity in mice with renal ischemia reperfusion injury: evaluation as a noninvasive biomarker of acute kidney injury. Med Mol Morphol. 2017; 50(3):161-169.

[32] Si XY, Li JJ, Yao T, et al. Transforming growth factor-β1 in the microenvironment of ischemia reperfusion-injured kidney enhances the chemotaxis of mesenchymal stem cells to stromal cell-derived factor-1 through upregulation of surface chemokine (C-X-C motif) receptor 4. Mol Med Rep. 2014;9(5):1794-1798.

[33] Semedo P, Wang PM, Andreucci TH, et al. Mesenchymal stem cells ameliorate tissue damages triggered by renal ischemia and reperfusion injury. Transplant Proc. 2007;39(2):421-423.

[34] Monteiro MB, Patente TA, Mohammedi K, et al. Sex-specific associations of variants in regulatory regions of NADPH oxidase-2 (CYBB) and glutathione peroxidase 4 (GPX4) genes with kidney disease in type 1 diabetes. Free Radic Res. 2013;47(10):804-810.

引言

肾缺血/再灌注损伤是急性肾损伤的最常见原因，主要表现为肾功能的急剧下降^[1-2]。肾缺血/再灌注损伤是一个复杂的病理生理过程，肾损伤的严重程度取决于缺血的持续时间、程度及随后的再灌注所引起的组织细胞内部的失衡^[3-4]。活性氧是缺血再灌注过程中对肾脏产生毒性作用的重要介质^[5]。肾脏血流中断和随后的再灌注激活急性氧化应激反应，被认为是导致活性氧产生和蓄积的主要原因^[6]。研究还发现，活性氧可诱发血管的持续收缩，不仅导致参与原尿形成的血流量减少，还降低了肾小球滤过率，促进肾小管上皮细胞的凋亡与坏死^[2^，^7]。因此，促进活性氧失活可能是对抗肾缺血/再灌注损伤的有效策略。而且，损伤肾的功能恢复的关键是促进肾小管基膜的修复和肾小管上皮细胞的增殖与分化^[8]。越来越多的研究表明，干细胞移植疗法可能对肾缺血/再灌注损伤有积极作用^[9]。

目前，不同类型的干细胞已被应用于细胞移植治疗，包括胚胎干细胞和成体干细胞^[10-11]。其中，属于成体干细胞的间充质干细胞具有自我更新、免疫调节和组织再生特性，在临床上具有广阔的应用前景^[12]。近来，间充质干细胞移植被认为是改善肾功能、恢复急性肾损伤的有效方法，但关于作用机制的研究则较少^[13]。Ayatollahi等^[14]在进行机制研究时发现，移植骨髓间充质干细胞通过抗氧化反应发挥减轻肝损伤的作用。Kim等^[15]研究表明在急性脊髓损伤后早期静脉注射脂肪间充质干细胞可能通过抗氧化与抗炎防止脊髓进一步的损伤，但相关信号通路尚未阐明。

荟萃分析显示，国内外学者对脂肪间充质干细胞在肾缺血/再灌注损伤中的作用及机制研究较少^[16]。脂肪间充质干细胞已被认为是组织工程的理想种子细胞来源，具有自体来源丰富、取材创伤小、分离培养简便、无免疫排斥及伦理问题等优点^[17]。因此，实验将自体脂肪组织来源的间充质干细胞作为治疗细胞，通过尾静脉注射给肾缺血/再灌注损伤大鼠模型，观察脂肪间充质干细胞对肾损伤的保护作用，探讨可能机制，为临床应用提供实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 动物模型体内细胞移植实验。

1.2 时间及地点 于2017年3月到2018年3月在西南医科大学实验室完成。

1.3 材料 纳入50只8-10周龄雄性SD大鼠，SPF级，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号：SCXK(京)2016-0011号。所有实验均经西南医科大学实验动物管理伦理委员会批准(伦理批准号：2017031)。

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠脂肪间充质干细胞的分离与培养 体积分数1%戊巴比妥钠麻醉大鼠，在无菌条件下取SD大鼠腹股沟皮下脂肪组织^[17]，去除被血液污染的脂肪称取1 g，PBS漂洗2次，用200 U/mL浓度的Ⅱ型胶原酶(Sigma公司)溶液室温孵育60 min，DMEM完全培养基(Gibgo公司)终止消化，用200目一次性细胞筛过滤，取滤液1 000 r/min离心10 min，用SD大鼠脂肪间充质干细胞完全培养基(Hyclone公司)重悬细胞并接种于培养瓶中，37 ℃、体积分数5% CO₂培养箱中培养，24 h后取出培养瓶，将尚未贴壁的悬浮细胞连同培养液一并弃去，添加新完全培养基继续培养，每隔3 d换液1次，待细胞浓度融合铺满培养瓶底85%后进行传代。

1.4.2 SD大鼠脂肪间充质干细胞免疫表型的鉴定 收集第3代脂肪间充质干细胞，PBS冲洗3次，每次5 min，制成2×10⁸ L^-1细胞悬液，每个流式细胞仪专用管内加入100 μL细胞悬液，再向每管内分别加入10 μL异硫氰酸荧光素(FITC)标记的兔抗大鼠CD44和CD90单克隆抗体及同型对照(BD公司)，4 ℃避光孵育45 min，1000 r/min离心5 min，PBS洗涤并重悬细胞，流式细胞仪上检测细胞的CD44和CD90阳性表达率。

1.4.3 SD大鼠脂肪间充质干细胞多向分化能力的鉴定

诱导成骨分化及鉴定：收集第3代脂肪间充质干细胞制成细胞悬液，接种于6孔培养板的各孔内，用脂肪间充质干细胞成骨诱导分化培养基(苏州赛业生物科技有限公司)常规培养，每隔3 d换液1次，培养21 d，移除培养基，加入40 g/L多聚甲醛固定2 h，PBS洗涤3次，用茜素红S染液室温染色90 min，晾干后封固，光学显微镜下观察并拍照。
诱导成软骨分化鉴定：收集第3代脂肪间充质干细胞制成细胞悬液，接种于6孔培养板的各孔内，用脂肪间充质干细胞成软骨诱导分化培养基(苏州赛业生物科技有限公司)常规培养，每隔2 d换液1次，培养28 d，取出软骨球，用40 g/L多聚甲醛固定2 h，常规石蜡包埋、连续切片，脱蜡、脱水、阿利新蓝染液染色30 min、流水冲洗5 min、封固、光学显微镜下观察并拍照。

诱导成脂分化鉴定：收集第3代脂肪间充质干细胞制成细胞悬液，接种于铺有无菌盖玻片的6孔培养板的各孔内，用脂肪间充质干细胞成脂诱导分化培养基(苏州赛业生物科技有限公司)常规培养，每隔3 d换液1次，培养10 d，取出铺满细胞的盖玻片，用40 g/L多聚甲醛将细胞固定15 min、PBS洗涤、油红O染液染色60 min、脱色、晾干封固、光学显微镜下观察并拍照。

1.4.4 分组及大鼠肾缺血再灌注损伤模型的建立 将45只大鼠中随机挑出15只作为假手术组，其他30只用于肾缺血再灌注损伤模型的建立，造模后将30只模型大鼠随机分为移植对照组和干细胞移植组，每组15只。体积分数1%戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，将大鼠仰卧固定于保温手术台上，无菌条件下，腹部备皮，消毒后沿腹白线做正中切口进入腹腔，摘除右侧肾脏，暴露左侧肾蒂，用无创动脉夹将左肾动脉夹闭，45 min后去除动脉夹恢复血流，待肾脏颜色由紫红恢复正常后，逐层缝合关腹，建立大鼠肾缺血再灌注模型^[18]。假手术组只开腹摘除右肾，暴露左侧肾蒂，不夹闭左肾动脉。

1.4.5 脂肪间充质干细胞移植 造模后6 h进行移植，移植对照组的大鼠尾静脉注射1 mL注射用生理盐水；干细胞移植组的大鼠尾静脉注射1 mL含5×10⁵个脂肪间充质干细胞的注射用生理盐水，在移植前用荧光染料CFSE在37 ℃将脂肪间充质干细胞孵育30 min进行标记。

1.4.6 脂肪间充质干细胞在肾脏中定植的检测 移植后5，15和30 d，每组按随机数字表法随机选取3只大鼠麻醉处死，摘取肾脏用于各项检测。从取出的肾脏上切取约1.5 cm³大小组织块，用冰冻切片机制成4 μm超薄切片，荧光显微镜下观察定植的脂肪间充质干细胞。

1.4.7 大鼠肾功能检测 于移植后5，15和30 d割尾取血，严格按照试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书步骤操作，苦味酸速率法检测血清肌酐水平，酶偶联速率法检测血清尿素氮水平。

1.4.8 大鼠肾组织脂质过氧化水平检测 移植后5，15和30 d，切取1 g肾组织冰上充分裂解，按照说明书步骤，在532 nm波长下检测样品吸光度值，计算肾组织内丙二醛的含量。

1.4.9 大鼠肾组织病理学观察 取移植后5，15和30 d切取的大鼠肝组织，用10 g/L多聚甲醛固定24 h，制成石蜡切片，切片机连续切片，常规苏木精-伊红染色，显微镜下观察。对肾小管损伤程度进行评价，由病理科医师采用Paller评分法进行^[16]，光学显微镜下随机选取3个400倍视野，每个视野中选取3个有病变的完整肾小管观察，每只大鼠按9个肾小管计分，评分结果取平均值，分值越高，损伤越重。肾小管损伤评分标准：肾小管上皮细胞由立方形变为扁平，管腔明显增大计1分；肾小管上皮细胞游离面刷状缘杂乱计1分，缺损计2分；肾小管内有脱落的坏死细胞碎片未形成管型计1分，出现管型计2分。

1.4.10 大鼠肾组织中谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的检测 应用Western blot法检测肾组织中谷胱甘肽过氧化酶4水平，移植后5，15和30 d，切取适量肾组织加入组织裂解液冰上裂解20 min，12 000 r/min离心10 min，吸取上清液测定蛋白浓度，沸水浴使蛋白样品变性，用10%的SDS-PAGE胶电泳分离、转膜、体积分数2.5%脱脂奶粉室温封闭30 min、加入兔抗鼠谷胱甘肽过氧化酶4单克隆抗体(Santa Cruz公司；1∶200)和兔抗鼠β-actin多克隆抗体(Santa Cruz公司；1∶2 000)，4 ℃过夜，吸去一抗孵育液加入山羊抗鼠IgG(1∶500)孵育30 min，应用ECL化学发光试剂盒避光孵育，放入凝胶成像系统(Bio-Rad公司)中显影，以β-actin为内参分析蛋白条带灰度值。

1.5 主要观察指标 ①血清肌酐与尿素氮水平；②肾组织丙二醛含量；③肾小管损伤评分；④肾组织谷胱甘肽过氧化物酶4的表达。

1.6 统计学分析 采用SPSS 23.0软件对数据进行分析，计量数据采用x(_)±s表示，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较用SNK-q检验，两组间比较用t 检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

实验证实以尾静脉注射的方式移植脂肪间充质干细胞能减轻急性肾损伤，且可能通过促进氧化还原平衡发挥改善作用。由于肾缺血/再灌注损伤引起的急性肾损伤以近端小管上皮细胞的结构与功能改变为主，实验主要从肾小管的组织病理结构变化和功能改善进行观察与评价。临床研究显示，急性肾损伤后的恢复是降低患者死亡率的关键^[19]。近年来，虽然对急性肾损伤的治疗效果有了明显改善，但临床上尚无促进肾脏修复的针对性疗法。国内外学者已经对脂肪组织或其他组织来源的间充质干细胞的治疗效果进行了广泛研究，但研究主要集中在包括脂肪间充质干细胞在内的成体干细胞向肾小管上皮细胞分化的能力，侧重于间充质干细胞再生替代受损或丢失细胞潜力的挖掘，而近来更多的研究发现，间充质干细胞在器官损伤细胞治疗中发挥的旁分泌作用要大于分化为组织细胞进行修复的作用，这种通过旁分泌细胞因子发挥的作用在缺血或毒物诱导的器官损伤的治疗中尤为明显^[19-23]。实验也采用单次移植治疗的方法，结果显示，肾功能的改善和氧化应激水平的降低主要发生在移植后的前15 d，随着时间的延长，减轻损伤的作用逐渐减弱，提示单次移植的脂肪间充质干细胞可能通过旁分泌发挥的短期作用大于分化为肾小管上皮细胞发挥的作用。有研究已证实，脂肪间充质干细胞的条件培养液确实在顺铂诱导的肾损伤模型中发挥治疗作用^[24]。由于大鼠腹股沟部位的脂肪切取方便，与腹部皮下脂肪组织相比基本没有血管和筋膜，易于分离脂肪间充质干细胞，实验选取腹股沟处脂肪进行实验。

实验在观察肾组织氧化应激水平时发现移植脂肪间充质干细胞确实可以降低急性期损伤肾组织中的脂质过氧化水平。此结果与在间充质干细胞治疗的动物模型上证实了干细胞的抗氧化作用的研究结果一致^[25-26]，提示脂肪间充质干细胞具有平衡组织内氧化还原平衡的潜力，通过降低氧化应激水平促进受损肾组织的早期再生。然而，也有学者在对小鼠肾缺血/再灌注损伤模型进行研究后发现，造血干细胞或骨髓间充质干细胞细胞系的移植并没有改善肾脏修复的过程，还提出了与干细胞治疗相关的可能风险以及关于治疗效果的确切机制存在的争议^[27-29]。实验在观察脂肪间充质干细胞在肾缺血/再灌注损伤引起的急性损伤中的作用的同时也探讨了其抗氧化方面的可能机制。实验的肾功能结果与组织病理学结果说明实验所使用的缺血再灌注诱导的肾损伤大鼠模型有效的模拟了临床上急性肾损伤的病理生理过程^[30]。实验建立肾缺血/再灌注损伤模型6 h后，采用静脉注射的方式将荧光染色标记的脂肪间充质干细胞移植到大鼠体内，由于干细胞在体内的定植需要一定时间，但随着时间的延长干细胞进行分裂，所标记的荧光会逐渐减弱至无法观察，故选取移植后5 d作为第一个观察时间点，又根据治疗后组织结构改变需要一定时间的实际情况，将移植后15和30 d作为细胞治疗的中长期观察时间点。实验结果显示，脂肪间充质干细胞移植后的15 d内，不仅有效降低肌酐和尿素氮水平，还降低了肾组织中丙二醛含量，并随着时间的延长呈现降低趋势，但移植后30 d，干细胞移植组肾组织中的丙二醛含量、肌酐和尿素氮水平虽然低于移植15 d，但两组没有明显差异，而两组肾小管损伤评分仍有显著差异，干细胞移植组肾小管损伤评分明显低于移植对照组，提示脂肪间充质干细胞可能具有早期抗急性损伤和晚期再生修复作用，肾功能及脂质过氧化水平与肾组织病理特征不一致的可能原因除了组织形态恢复晚于功能恢复外，单次注射脂肪间充质干细胞只能发挥短期治疗作用。以上实验结果与其他学者的研究结果一致^[31]。

实验在进一步探讨脂肪间充质干细胞的抗氧化作用时发现，与组织细胞氧化还原水平相关的酶的表达在移植过程中发生了变化。实验通过肌酐和尿素氮水平的降低以及肾组织形态学结果及组织病理学评分证实脂肪间充质干细胞移植能够改善损伤的肾功能和降低肾组织脂质过氧化水平后，检测了与脂质过氧化和肾缺血/再灌注损伤密切相关的谷胱甘肽过氧化酶4在肾组织中的表达，结果显示，模型大鼠肾组织谷胱甘肽过氧化酶4的表达是降低的，而干细胞移植组在移植后5和15 d大鼠肾组织谷胱甘肽过氧化酶4表达明显升高，提示移植脂肪间充质干细胞能促进肾组织中谷胱甘肽过氧化酶4的表达；移植30 d后肾组织中谷胱甘肽过氧化酶4表达降低的可能原因是干细胞的治疗作用随着时间的延长而减弱。谷胱甘肽过氧化酶4是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶，使有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物，从而保护细胞中膜类结构及功能不受过氧化物的损害^[32]。此结果证实脂肪间充质干细胞通过抑制氧化应激和炎症反应来减轻肾缺血/再灌注损伤小鼠模型的肾小管坏死程度的研究结果一致^[33-34]。实验的谷胱甘肽过氧化酶4表达变化结果与实验中肾组织丙二醛水平研究结果一致，说明脂肪间充质干细胞可能通过促进谷胱甘肽过氧化酶4的表达抑制细胞脂质过氧化，但随着时间延长作用减弱，其可能原因是其旁分泌作用随着移植体内的脂肪间充质干细胞的分化而减弱至消失。

综上所述，实验成功分离大鼠脂肪间充质干细胞，并建立大鼠肾缺血/再灌注损伤模型，研究结果显示脂肪间充质干细胞移植可改善肾缺血/再灌注损伤大鼠肾脏损伤和功能障碍，初步证实可能机制是通过促进谷胱甘肽过氧化酶4表达降低脂质过氧化对组织细胞的损害，但实验没有获得脂肪间充质干细胞在移植后进行旁分泌的直接证据，故在后续研究中将从细胞水平继续探讨脂肪间充质干细胞促进谷胱甘肽过氧化酶4表达的可能机制并检测因子分泌的变化，为脂肪间充质干细胞移植改善肾缺血/再灌注损伤提供实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

脂肪间充质干细胞移植减轻大鼠肾缺血再灌注损伤的机制

Underlying mechanism by which adipose-derived mesenchymal stem cell transplantation alleviates renal ischemia-reperfusion injury in rats

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[1]	樊全宝, 罗惠娜, 王丙云, 陈胜锋, 崔连旭, 江文康, 赵明明, 王静静, 罗冬章, 陈志胜, 白银山, 刘璨颖, 张晖. 低氧培养犬脂肪间充质干细胞的生物学特性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1002-1007.
[2]	陈扬, 黄邓高, 高元慧, 王顺兰, 曹卉, 郑琳麟, 何浩伟, 罗思琴, 肖敬川, 张应爱, 张淑芳. 低强度脉冲场超声促进人脂肪间充质干细胞的增殖和黏附[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3949-3955.
[3]	孙维兴, 赵永超, 赵然尊 . 间充质干细胞移植治疗心肌梗死：问题、症结及新突破[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(19): 3103-3109.
[4]	陈晓, 郭智, 陈丽娜, 刘玄勇, 张弋慧智, 李旭绵, 王月乔, 韦丽娅, 谢晶, 蔺莉. 自体外周血造血干细胞动员采集的影响因素[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(19): 2958-2962.
[5]	张剑慧, 马贺然, 谭毅, 王芝辉. 人脂肪间充质干细胞无支架三维凝胶修复猪膝关节损伤[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(19): 2969-2975.
[6]	高元慧, 向杨, 曹卉, 王顺兰, 郑琳麟, 何浩伟, 张应爱, 张淑芳, 黄邓高. 两种月龄近交系五指山小型猪脂肪间充质干细胞生物学特性的比较[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(19): 2988-2993.
[7]	张传辉, 李建军, 杨军. 动态压力对负载胰岛素样生长因子1基因兔脂肪间充质干细胞增殖能力和机械性能的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(13): 1982-1987.
[8]	曹琳琳, 丁凯阳, 宋浩, 吴国林, 胡茂贵, 范丹丹, 周晨阳, 王翠翠, 封媛媛. 自体造血干细胞移植治疗恶性淋巴瘤的疗效及影响因素[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(13): 1993-1998.
[9]	张文坚, 马灵甫, 王志敏, 莫文健, 周睿卿. 异基因造血干细胞移植患者的四肢肌肉量及影响因素调查[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(13): 1999-2004.
[10]	张晶莹, 孙晓林, 耿立霞. 脂肪间充质干细胞治疗系统性硬化症模型小鼠的机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(13): 2011-2017.
[11]	华红, 解童玲, 郝贵亮. 人脂肪间充质干细胞对异种小鼠间皮肤移植的免疫调节作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(1): 73-77.
[12]	刘浩, 刘军, 芮永军, 汤峰林, 陆淼, 丁涛. 成骨诱导因子Nell-1及Noggin短发卡RNA联合转染脂肪间充质干细胞的促成骨分化能力[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(31): 4966-4970.
[13]	张素平, 孙玲, 万鼎铭, 曹伟杰, 李丽, 刘长凤, 刘玉峰, 王叨, 郭荣, 姜中兴, 谢新生. 非血缘外周血造血干细胞移植治疗重型再生障碍性贫血的有效性[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(31): 4994-5001.
[14]	杨振, 李浩, 高仓健, 付力伟, 田广招, 查康康, 孙志强, 李旭, 郭维民, 眭翔, 黄靖香, 刘舒云, 卢世璧, 郭全义. 转化生长因子β3/聚乳酸-羟基乙酸微球对干细胞的调控[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(28): 4540-4546.
[15]	林嘉颖, 陈淑仪, 陈胜锋, 王丙云, 陈志胜, 刘璨颖, 白银山, 计慧琴, 谢仕廷. 犬脂肪间充质干细胞及其外泌体修复庆大霉素致犬肾小管上皮细胞损伤[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(25): 3959-3965.