血管内皮生长因子联合突变型低氧诱导因子1α的促血管生成作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1024

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (3): 378-383.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1024

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血管内皮生长因子联合突变型低氧诱导因子1α的促血管生成作用

胡亮1，王军海1，王志烈1，谢金元1，陈登1，丁凡2

(荆门市第一人民医院，1关节外科，2创伤手足外科，湖北省荆门市 448000)

收稿日期:2018-03-31 出版日期:2019-01-28 发布日期:2019-01-28
通讯作者: 王军海，硕士，主任医师，荆门市第一人民医院关节外科，湖北省荆门市 448000 第二通讯作者：丁凡，博士，副主任医师，荆门市第一人民医院创伤手足外科，湖北省荆门市 448000
作者简介:胡亮，男，1982年生，2010年辽宁医学院毕业，硕士，主治医师，主要从事人工关节置换的研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目资助(81401827)，项目负责人：丁凡

Vascular endothelial growth factor combined with mutant hypoxia-inducible factor 1alpha promotes angiogenesis

Hu Liang1, Wang Junhai1, Wang Zhilie1, Xie Jinyuan1, Chen Deng1, Ding Fan2

(1Department of Joint Surgery, 2Department of Traumatic Hand and Foot Surgery, Jingmen No.1 People’s Hospital, Jingmen 448000, Hubei Province, China)

Received:2018-03-31 Online:2019-01-28 Published:2019-01-28
Contact: Wang Junhai, Master, Chief physician, Department of Joint Surgery, Jingmen No.1 People’s Hospital, Jingmen 448000, Hubei Province, China Corresponding author: Ding Fan, MD, Associate chief physician, Department of Traumatic Hand and Foot Surgery, Jingmen No.1 People’s Hospital, Jingmen 448000, Hubei Province, China
About author:Hu Liang, Master, Attending physician, Department of Joint Surgery, Jingmen No.1 People’s Hospital, Jingmen 448000, Hubei Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81401827 (to DF)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)：是血管内皮细胞的前体细胞，亦称为成血管细胞(angioblast)，在生理或病理因素刺激下，可从骨髓动员到外周血参与损伤血管的修复。1997年，Asahara等首次证明循环外周血中存在能分化为血管内皮细胞的前体细胞，并将其命名为血管内皮祖细胞。
微血管密度：是指生物组织如皮肤、肌肉、器官等组织中单位密度的微血管数量，在微循环研究中常把单位面积(1 mm2或某一长度范围内)所看到的血管数称为血管密度。在组织标本中可以在显微镜下计数单位面积的毛细血管数或单位体积的毛细血管数，微血管包括细动脉、细静脉、毛细血管。

摘要
背景：研究表明，血管内皮生长因子的转录翻译过程在许多缺血、缺氧的条件下都会增加，有效改善机体血管形成与侧支微循环。突变低氧诱导因子1α的表达也需要严格的缺氧条件，很大程度上限制了其实际应用。
目的：观察腺病毒介导的血管内皮生长因子联合突变型低氧诱导因子1α(Ad-VEGF-IRES-HIF-1αmu)转染内皮祖细胞在激素性股骨头缺血性坏死修复中促血管生成的作用。
方法：①转染Ad-VEGF-IRES-HIF-1αmu到内皮祖细胞，观察细胞活性、形态及细胞病变效应；②将转染Ad-VEGF-IRES-HIF-1αmu成功的内皮祖细胞植入激素性股骨头缺血性坏死动物模型的股骨坏死部位(实验组：转染Ad-VEGF-IRES-HIF-1αmu，对照组：内皮祖细胞细胞悬液，空白组：细胞培养液)；③移植10周后，检测血管内皮生长因子、低氧诱导因子1α蛋白表达及CD34表达和微血管密度计数；④墨汁灌注透明切片血管形态学观察。
结果与结论：①实验组血管内皮生长因子和低氧诱导因子1α蛋白表达高于对照组与空白组(P < 0.05)；②实验组的CD34表达阳性的微血管数量较多，且相互之间有连接。③实验组动物股骨头血管墨汁染色显示有新的血管生成，部分血管管径良好，有再通现象，血管间有清晰的连通脉络，有效的血管脉络均匀分布在缺损区域；实验组新生血管面积显著高于对照组和空白组(P < 0.05)；④结果提示，血管内皮生长因子联合突变型低氧诱导因子1α在激素性股骨头缺血性坏死修复中可以增强血管生成作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0003-4580-4953(胡亮)

关键词: 血管内皮生长因子, 突变型低氧诱导因子1α, 激素性股骨头缺血性坏死, 血管生成

Abstract:

BACKGROUND: Transcription and translation of vascular endothelial growth factor has been shown to be increased under ischemic and hypoxic conditions, which effectively improves angiogenesis and collateral microcirculation in vivo. Expression of mutant hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1αmu) requires hypoxic condition, so its application is limited.
OBJECTIVE: To study the effect of transfection of adenovirus-mediated- vascular endothelial growth factor combined with HIF-1αmu (Ad-VEGF-IRES-HIF-1αmu) into endothelial progenitor cells on the angiogenesis in the treatment of steroid-induced avascular necrosis of the femoral head.
METHODS: Ad-VEGF-IRES-HIF-1αmu was transfected into endothelial progenitor cells, and the cell viability, morphology and cytopathic effect were observed. Endothelial progenitor cells transfected with Ad-VEGF-IRES-HIF-1αmu were implanted into the necrotic site of the animal model of steroid-induced avascular necrosis of the femoral head (experimental group: transfected with Ad-VEGF-IRES-HIF-1αmu; control group: suspension of endothelial progenitor cells; blank group: cell culture medium). After 10 weeks of transfection, expression of vascular endothelial growth factor, hypoxia-inducible factor1α and CD34 as well as microvessel density were detected. The vascular morphology was observed by ink perfusion.
RESULTS AND CONCLUSION: The expression levels of vascular endothelial growth factor and hypoxia-inducible factor1α in the experimental group were higher than those in the control and blank groups (P < 0.05). The number of microvessels positive for CD34 was the argest in the experimental group. In the experimental group, the ink perfusion of femoral head showed new angiogenesis, the phenomenon of recanalization occurred in some vessels, blood vessels had a clear connectivity, and effective vascular veins evenly distributed into the defect area. The area of neovascularization in the experimental group was significantly larger than that in the control and blank groups (P < 0.05). Vascular endothelial growth factor combined with mutant hypoxia-inducible factor1α can enhance angiogenesis in the repair of steroid-induced avascular necrosis of the femoral head.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Vascular Endothelial Growth Factors, Hypoxia-Inducible Factor 1, Femur Head Necrosis, Tissue Engineering

中图分类号:

R446

胡亮，王军海，王志烈，谢金元，陈登，丁凡. 血管内皮生长因子联合突变型低氧诱导因子1α的促血管生成作用[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(3): 378-383.

Hu Liang1, Wang Junhai1, Wang Zhilie1, Xie Jinyuan1, Chen Deng1, Ding Fan2. Vascular endothelial growth factor combined with mutant hypoxia-inducible factor 1alpha promotes angiogenesis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(3): 378-383.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析选用大白兔36只，分为3组，实验过程中实验组死亡动物1只，及时补充，进入结果分析数量最终为36只。

2.2 荧光显微镜观察Ad-VEGF-IRES-HIF-1α^mu转染内皮祖细胞结果用倒置荧光显微镜观察细胞形态，发现转染后的细胞48 h后荧光蛋白表达率约为90.4%，转染后的细胞活性及形态正常，未观察到明显病变，表明Ad-VEGF-IRES-HIF-1α^mu转染到内皮祖细胞后细胞活性较好，转染已经成功。见图1。

2.3 X射线扫描结果健康大白兔股骨头的骨皮质较厚，骨小梁清晰；造模大白兔股骨头处的扫描图像出现低密度影像变化，股骨关节处间隙变窄，骨皮质明显比健康大白兔的薄，骨密度明显降低，表明激素性股骨头缺血性坏死动物模型造模已经成功。见图2。

2.4 Westenblot法检测VEGF和HIF-1α^mu蛋白表达分析表1可知，在实验设计的3组动物模型股骨组织中VEGF蛋白表达量差异显著(P=0.001)，实验组VEGF蛋白表达相对表达值为0.63±0.011，显著高于对照组与空白组(P=0.025，P=0.001)。分析表2可知，移植Ad-VEGF-IRES-HIF-1α^mu转染内皮祖细胞的实验组动物股骨头坏死部位组织中HIF-1α^mu蛋白表达比对照组和空白组分别提高12倍、18倍(P=0.014、P=0.015)，3组实验数据比较差异有显著性意义(P=0.003)；由此可知，移植Ad-VEGF-IRES-HIF-1α^mu转染的内皮祖细胞的相对于移植单纯内皮祖细胞及空白组，动物模型股骨组织中的VEGF蛋白、HIF-1α^mu蛋白表达量提高，见图3，4。

2.5 CD34免疫组织化学染色检测 CD34免疫组织化学染色检测多用于检测早期的新血管生成，分析图5中的3组图片可知：实验组视野内可观察到CD34阳性的微血管数量较多，且相互之间有连接；对照组视野内观察到CD34阳性的微血管数量较少，且都独立存在，无联系；空白组视野内可以观察到CD34阳性的微血管数量极少，无血管效用表达。分析表3可知，3组数据间差异有显著性意义(P=0.000)，两两比较可以发现，实验组显著高于对照组与空白组(P=0.001，P=0.000)，对照组与空白组间差异也有显著性(P=0.003)，说明内皮祖细胞能够促进坏死股骨头中早期微血管的形成。实验表明VEGF联合HIF-1α^mu作用在动物模型受损股骨组织中新血管的数量高于对照组与空白组。
2.6 墨汁灌注透明切片血管实验结果分析图6可知，实验组动物股骨头坏死部位血管墨汁染色结果显示有新的血管生成，墨汁没有大面积渗漏，部分血管的管径畅通无漏点，坏死血管的有修复再生现象，血管间有清晰的连通脉络，有效的血管脉络均匀分布在缺损区域；对照组股骨头血管墨汁染色显示血管也有新的生成，但血管数量较实验组少，血管间没有连通脉络，没有形成明显血管连通网络；空白组动物的股骨头血管墨汁染色可见墨汁大面积渗出，血管管径闭塞、脉络不清晰，无新血管生成，股骨头表面的血管几乎处于坏死状态。

分析表4可知，实验组新生血管面积显著高于对照组(P=0.023)，对照组显著高于空白组，说明内皮祖细胞在坏死股骨头中起到血管再生作用。表明VEGF联合HIF-1α^mu作用在动物模受损股骨组织中的新生血管能力高于对照组与空白组，且受损血管有再通现象，血管间有效的网状脉络均匀分布在缺损区域。这与CD34免疫组织化学染色检测观察到的结果相符。

参考文献

[1] Ichiseki T,Ueda S,Ueda Y,et al.Involvement of necroptosis, a newly recognized cell death type, in steroid-induced osteonecrosis in a rabbit model.Int J Med Sci.2017;14(2): 110-114.

[2] Nabi S,Rao B,Gulati R,et al.Abstracts from the 38th Annual Meeting of the Society of General Internal Medicine. J Gen Intern Med. 2015;30 Suppl 2:45-551.

[3] Bai R,Liu W,Zhao A,et al.Nitric oxide content and apoptosis rate in steroid-induced avascular necrosis of the femoral head. Exp Ther Med. 2015;10(2):591-597.

[4] Riemenschneider SB,Mattia DJ,Wendel JS,et al.Inosculation and perfusion of pre-vascularized tissue patches containing aligned human microvessels after myocardial infarction. Biomaterials.2016;97: 51-61.

[5] Asahara T,Murohara T,Sullivan A,et al.Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis.Science.1997; 275(5230): 964-967.

[6] Wang S,Chen Z,Tang X,et al.Transplantation of vascular endothelial growth factor 165-transfected endothelial progenitor cells for the treatment of limb ischemia. Mol Med Rep.2015;12(4): 4967-4974.

[7] Herzog B,Pelletmany C,Britton G,et al.VEGF binding to NRP1 is essential for VEGF stimulation of endothelial cell migration, complex formation between NRP1 and VEGFR2, and signaling via FAK Tyr407 phosphorylation.Mol Biol Cell.2011;22(15): 2766-2776.

[8] Müller CE,Schiedel AC,Zimmermann H.PURINES 2014: nucleotides, nucleosides and nucleobases - international conference on signalling, drugs and targets.Purinergic Signal.2014;10(4): 651-656.

[9] 王皓,李谌,郜玉忠. 突变型低氧诱导因子1α加速骨缺损部位新血管生成的实验观察[J].西安交通大学学报(医学版), 2015, 36(4): 455-461.

[10] Tang W,Yang F,Li Y,et al.Transcriptional Regulation of Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) by Osteoblast-specific Transcription Factor Osterix (Osx) in Osteoblasts*.J Biol Chem. 2012;287(3):1671-1678.

[11] 戚超,效军,效强,等.多壁碳纳米管改善激素性股骨头坏死模型兔的股骨头形态[J]. 中国组织工程研究,2014,18(16): 2493-2498.

[12] Zwetsloot KA, Westerkamp LM, Holmes BF,et al.AMPK regulates basal skeletal muscle capillarization and VEGF expression but is not necessary for the angiogenic response to exercise. J Physiol. 2008;586(24):6021-6035.

[13] Fulkerson J, Lowe R, Anderson T, et al.Effects of Intraosseous Tibial vs. Intravenous Vasopressin in a Hypovolemic Cardiac Arrest Model. West J Emerg Med. 2016;17(2):222-228.

[14] Neves N,Linhares D,Costa G,et al.In vivoand clinical application of strontium-enriched biomaterials for bone regeneration:A systematic review. Bone Joint Res. 2017 ; 6(6):366-375.

[15] Billaud M,Lohman AW,Johnstone SR,et al.Regulation of Cellular Communication by Signaling Microdomains in the Blood Vessel Wall.Pharmacol Rev.2014;66(2): 513-569.

[16] Michan S,Juan AM,Hurst CG,et al.Sirtuin1 over-expression does not impact retinal vascular and neuronal degeneration in a mouse model of oxygen-induced retinopathy.Plos One. 2014; 9(1): e85031.

[17] Zhu G, Tang Y, Geng N, et al.HIF-α/MIF and NF-κB/IL-6 Axes Contribute to the Recruitment of CD11b+Gr-1+ Myeloid Cells in Hypoxic Microenvironment of HNSCC 1, 2. Neoplasia.2014; 16(2):168-179.

[18] Biscetti F,Flex A,Pecorini G,et al.The role of High-mobility group box protein 1 in collagen antibody-induced arthritis is dependent on Vascular endothelial growth factor. Clin Exp Immunol. 2016;184(1):62-72.

[19] 王维军,李嗣生,牛东生,等. 股骨头缺血性坏死骨质含量与VEGF、bFGF、BMP-2 mRNA表达的相关性研究[J]. 中国修复重建外科杂志,2011,25(8): 984-991.

[20] Chang KH,Smith SE,Sullivan T,et al.Long-Term Engraftment and Fetal Globin Induction uponBCL11AGene Editing in Bone-Marrow-Derived CD34+Hematopoietic Stem and Progenitor Cells. Mol Ther Methods Clin Dev. 2017;4: 137-148.

[21] He MQ,He MQ,Wang JF,et al.Vascular Endothelial Growth Factor and Cluster of Differentiation 34 for Assessment of Perioperative Bleeding Risk in Gastric Cancer Patients.Chin Med J (Engl). 2016;129(16):1950-1954.

[22] Balaji S,Lesaint M,Bhattacharya SS,et al.Adenoviral Mediated Gene Transfer of IGF-1 Enhances Wound Healing and Induces Angiogenesis. J Surg Res.2014;190(1):367-377.

[23] Hatanpaa KJ,Burma S,Zhao D,et al.Epidermal Growth Factor Receptor in Glioma: Signal Transduction, Neuropathology, Imaging, and Radioresistance. Neoplasia.2010;12(9): 675-684.

引言

股骨头缺血性坏死是临床多发病和常见病，致残率高，酗酒、创伤、大量使用激素是其3大主要诱因。近年来，随着现代医学的迅速发展，激素在临床中的使用愈加广泛，激素性股骨头缺血性坏死的患病率不断上升，其坏死概率占非创伤性股骨头51%。2003年，在治疗非典型性肺炎的过程中，患者大量使用激素治疗，对治愈后患者进行了严格回访调查，发现股骨头坏死的发病率高达53.5%^[1]。最新的统计显示目前因滥用激素所导致的股骨头坏死的患病人数已远远超出创伤所致的股骨头坏死^[2]，因其病症严重、患病后的致残率较高引起了众多医学专家的重视和广泛研究^[3-4]。目前，股骨头坏死的治疗方法可分为手术治疗和非手术疗法，可使病情得到一定程度的缓解，但无法治愈股骨头坏死，让患者能像正常人一样的生活。

所以从基因水平上研究治疗股骨头坏死的方法途径，成为当今学者研究的热门方向。1997年由Asahara等^[5]学者分离得到具有促进血管新生能力的细胞，是原始的内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)。大量研究结果表明，血管内皮祖细胞在治愈缺血性疾病中有着重要作用，股骨头缺血性坏死的治疗采用血管内皮祖细胞可使在重生血管干细胞方面建立重大技术优势^[6]。在血管生成作用的研究中，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)应用于肢体缺血性研究的报道居多^[7]。研究表明，VEGF的转录翻译过程在许多缺血、缺氧的条件下都会增加，有效的改善机体血管形成与侧支微循环。突变低氧诱导因子(hypoxia inducible factor 1，HIF-1α)的表达也需要严格的缺氧条件，很大程度上限制了其实际应用。所以有学者应用PCR技术寻找HIF-1α基因的氨基酸突变点(HIF-1α基因的第402、564和803位)，突变后的氨基酸有效改变了HIF-1α的表达条件，HIF-1α^um可以在正常氧状态下转录，并翻译成蛋白质，发挥HIF-1α蛋白重要的生理作用^[8-9]。在受伤的组织中HIF-1α基因表达量增多，从而调节靶基因VEGF的表达增多。HIF-1α具有调节基因表达的转录激活因子，受其调控的下游基因目前已知有60多种，其中最主要的下游基因就是VEGF^[10]。

该实验通过将单载体双基因Ad-VEGF-IRES-HIF- 1α^mu转染内皮祖细胞后移植到激素性股骨头缺血性坏死部位，通过改善坏死股骨头的血管再生作用，改变股骨头坏死部位的恶性循环，旨在探讨VEGF联合突变型HIF-1α在激素性股骨头缺血性坏死修复中对血管生成的作用，为临床治疗股骨头坏死提供有利的科学依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学实验观察，随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2016年10月至2017年10月在锦州医科大学附属第一医院辽宁省医学组织工程重点实验室完成。

1.3 材料

实验动物：清洁级24周龄纯种新西兰大白兔为锦州医科大学动物实验中心提供，体质量2.5-3.0 kg，许可证号：SCXK(辽)2003-0007。

病毒、细胞及试剂：腺病毒载体Ad-VEGF-IRES-HIF- 1α^mu和兔骨髓来源内皮祖细胞由锦州医科大学中心实验室提供；无血清M199培养基、体积分数10%FBS的培养基：美国Sigma公司；CD31抗体：美国Santa Cruz公司；SP试剂盒：北京中山生物技术有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 转染Ad-VEGF-IRES-HIF-1α^mu到内皮祖细胞用内皮祖细胞为转染的种子细胞，在6孔细胞培养板中进行转染，转染的MOI值为200，向每孔中加入2 mL无血清M199培养基，放入恒温培养箱，孵育条件设置为37 ℃、体积分数5%CO₂。3 h后每孔再补入2 mL含体积分数10%FBS的培养基，再次放入培养箱。两三小时后在倒置荧光显微镜下观察转染后细胞形态，以不引起明显细胞病变为转染成功。

1.4.2 激素性股骨头缺血性坏死动物模型的建立 40只健康大耳白兔于实验室适应性喂养，7 d后对每只白兔进行马血清注射，注射位置：经耳缘，注射方法：静脉注射，注射剂量：每只10 mL/kg，依照此种方法14 d后再次注射。而后继续饲养14 d后在实验白兔的双侧臀肌上进行醋酸泼尼松龙注射，注射剂量：每只8 mg/kg，此后每天进行1次注射，共6次，继续喂养10周后X射线检测造模是否成功^[11]。

1.4.3 将转染Ad-VEGF-IRES-HIF-1α^mu的内皮祖细胞向动物模型股骨坏死局部移植

(1)分组处理：随机选取36只造模成功的大耳白兔，雌雄比例为1∶1，进行随机分组，每组6只雌兔6只雄兔。实验分3组进行，实验组注入移植Ad-VEGF-IRES-HIF-1α^mu转染的内皮祖细胞的细胞悬液；对照组注入内皮祖细胞的细胞悬液；空白组只注入细胞培养液。

(2)细胞悬液的制备：将Ad-VEGF-IRES-HIF-1α^mu转染的内皮祖细胞和单纯内皮祖细胞的细胞悬液用计数板计数，各分出12组，每组计数为2×10⁴细胞，再将分好的细胞悬液用细胞培养液定量为2 mL，待移植使用。

(3)移植到造模成功的动物模型：沿C型臂，从大转子下方开始钻入注射通道，采用2.5 mm钻头，从股骨头表面侧方钻入约4 mm的通道，使股骨头表面到软骨表面下方形成通路，共需完成3-5条通道。通道完成后，用1 mL注射器将制备好的2 mL细胞悬液均匀的通过不同通道注射到股骨头软骨下面，防止悬液流出。

1.5 主要观察指标

1.5.1 Westenblot法检测VEGF和HIF-1α^mu表达移植后10周，采用文献[12]的方法。取动物模型股骨头坏死局部组织50 mg，低温环境下剪碎，加入裂解液5 mL(Tris-HCl pH 7.5 20 mmol/L，蔗糖330 mmol/L，EGTA 0.5 mmol/L，EDTA 2 mmol/L，PMSF 1 mmol/L)，低温匀浆，然后将匀浆液冷冻1 000×g离心10 min，取上清40 000×g，离心1 h，弃上清，将沉淀溶于裂解液中(与上述裂解液成分类似，但是不加蔗糖，加入1%体积的Triton X-100)，超声裂解，然后继续40 000×g，离心1 h，上清即为包含膜蛋白的溶液。SDS-PAGE电泳，选用10%的分离胶和4%的浓缩胶进行电泳分离目的蛋白，并分别进行蛋白定量。将NC膜和胶放入转移缓冲液中浸泡15-30 min 后进行转膜。将转膜后的NC膜用5%的脱脂乳封闭过夜，滤纸吸干残液后加入一抗孵育 2 h(抗VEGF和及抗HIF-1α单克隆抗体)，TBST洗涤后二抗(辣根过氧化物酶标记的驴抗羊)孵育2 h，洗涤后备用。显影，定影。将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图像处理系统分析目的条带和内参条带的净光密度值及其比值。以β-actin作为参照，公式：VEGF或HIF-1α蛋白表达量=目的条带灰度值/ β-actin条带灰度值。

1.5.2 CD34免疫组织化学染色检测取移植后的动物模型股骨头坏死局部组织，进行石蜡包埋，制作切片。运用免疫组织化学(SP法)法进行CD34蛋白表达检测。微血管密度(MVD)计数：调节显微镜视野至低倍(×100)下，观察视野内新生骨缺损区域，计数CD34表达阳性的微小血管，随机选择5个不同的视野进行逐一计数，取平均值即为微血管密度值。

1.5.3 墨汁灌注透明切片血管形态学观察麻醉移植后10周的实验动物模型，用3%戊巴比妥钠，解剖使其露出腹主动脉与下腔静脉。然后沿着腹主动脉插管，将导管与动脉用缝合线固定。再将下腔静脉剪断，腹主动脉的近心端用止血钳阻断。冲洗血管床残余血液，向导管内大量灌注肝素生理盐水(生理盐水∶肝素为1∶25)，边注射边轻轻揉实验兔子肢体，观察下腔静脉剪断位置流出清亮无色液体后，改为灌注墨汁，至下腔静脉断端流出液变深黑色。

取墨汁灌注后动物股骨头部位，低温保存后用于观察分析血管生成情况。首先制作切片：用体积分数体积分数4%的甲醛浸泡固定，然后用5%的硝酸浸泡冲洗脱钙，制片。再脱水：用乙醇逐级处理。用二甲苯处理将切片透明化。在中心部位分别做纵、横切片，用显微镜观察切片内的血管分布情况。应用MIAS-2000显微图像剖析仪对图像中血管面积进行测量，最后对数据进行统计学分析。

1.6 统计学分析所得数据应用SPSS 16.0软件进行单因素方差分析以及χ²检验两两比较分析，实验结果用x(_)±s表示，3组检验后再两两比较，以P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

该文通过Ad-VEGF-IRES-HIF-1α^mu转染到内皮祖细胞，再移植到激素性股骨头缺血性坏死动物模型股骨坏死部位，对移植后股骨头坏死部位组织进行VEGF、HIF-1α蛋白及CD34蛋白表达检测的定性分析以及墨汁灌注透明切片血管形态学观察分析，得出内皮祖细胞在模型中股骨坏死部位修复过程中有一定的血管生成作用，转染单载体双基因Ad-VEGF-IRES-HIF-1α^mu的内皮祖细胞的血管生成作用明显更强，提示VEGF联合突变型HIF-1α在激素性股骨头缺血性坏死修复中可以增强血管生成作用。

激素性股骨头坏死发病很重要的原因是骨内压升高，临床研究表明引起骨内压升高的原因有两种，一种是血液中脂肪含量增多导致血管栓塞引起骨内压升高，另一种观点是因为血管发炎导致组织肿胀引起骨内压升高^[13]。因此治疗激素性股骨头坏死要针对病变部位抗炎减压，同时，在病变部位修复中要加强刺激新血管生成^[14]，促进坏死部位血液流通，改善血管栓塞情况，加强血液循环，促进坏死股骨头的修复。血管的再生还需要一系列生长因子相互协调及补充^[15]。大量研究表明，在促进血管再生方面，低氧诱导因子因其特殊作用成为临床中研究的热点基因。

HIF-1α是一种调节细胞内基因表达的诱导因子，它的调控能力受细胞内氧含量控制，是骨骼组织中氧稳态调节的核心因子，目前其可调控的基因已达60多种，是与激素性股骨头缺血性坏死修复中促血管生成最为密切的基因， VEGF基因就是HIF1α的最主要的下游基因^[16]。

Semenza在1992年发现HIF-1α的存在，它是一种DNA结合蛋白，在VEGF内源性表达上起到促进作用，能使VEGF表达量增加，可促进毛细血管生成。研究表明，HIF-1α在诱导血管生成中效果较好，新生血管结构正常，无组织水肿、血管平直舒缓少曲折，囊性血管形成率几乎为零^[17-18]。王维军等^[19]对比研究激素性与创伤性股骨头标本发现，激素性股骨头VEGF阳性表达的强度及面积均明显低于对照组，并认为激素性股骨头局部VEGF的表达降低，极有可能是导致其自身修复能力不足的重要原因，增加股骨头局部VEGF的表达可能有助于受损部位的修复。该文检测在激素性股骨头缺血性坏死修复中VEGF和HIF-1α蛋白的表达量，得出移植Ad-VEGF-IRES-HIF-1α^mu转染的内皮祖细胞表达的VEGF和HIF-1α蛋白量显著提高，说明Ad-VEGF-IRES-HIF-1α^mu转染的内皮祖细胞移植到激素性股骨头缺血性坏死部位后，可诱导该组织中的VEGF和HIF-1α蛋白表达量提高，促进坏死部位血管生成。

CD34基因的碱基中含有8个外显子，转录翻译的CD34抗原能够特异性的在造血干细胞或血管内皮祖细胞及其他造血组织中表达。在造血细胞分裂、分化与增殖过程中，CD34蛋白利用自身的黏附性可以对血管前内皮细胞聚集过程产生促进作用，使之快速生成新血管。通过CD34染色，能够测量出局部缺血组织微血管的密度和面积，以此衡量新生微血管的形成状况^[20]。大量的研究证实了VEGF参与了大多数实体组织的生长，且与坏死组织的预后密切相关。微血管密度是反映坏死部位新生微血管数的一个重要参数，VEGF与微血管密度是坏死组织预测因子及判断预后的独立指标^[21]。在各组动物模型股骨头坏死局部组织切片中都可以观察到CD34蛋白表达阳性血管，实验组中的血管数量较多，微小血管更为密集而且着色较深，对照组中的CD34蛋白表达阳性的微血管数量极为稀疏，且没有微小血管形成血管网，空白组中几乎不可见CD34蛋白表达阳性微血管。说明Ad-VEGF-IRES-HIF- 1α^mu转染到内皮祖细胞移植到激素性股骨头缺血性坏死部位后，可诱导CD34蛋白表达及促进坏死部位的血管生成，这对于股骨头缺血性坏死的修复有着非常重要的作用。

有学者研究HIF-1α基因对血管新生的影响得出，在复杂的生理环境中，对HIF-1α基因进行3点突变后，即使在复杂的动物体内仍然能高效聚集并表达蛋白，骨缺损区域形成新的完整血管管径，进而形成血管网络。有学者在研究VEGF功能时将其直接对实验动物进行肌肉注射，研究结果显示动物下肢肌肉或心肌内有新血管生成，注射局部组织血液循环得到有效改善，减缓组织坏死速度。该文采用墨汁灌注透明切片法观察实验动物受损股骨坏死部位的新生血管形态，发现移植Ad-VEGF-IRES-HIF-1α^mu转染内皮祖细胞的实验组动物受损股骨组织中有新血管生成，且受损血管有再通现象，血管间有效的网状脉络均匀分布在缺损区域。实验结果证明HIF-1α^mu联合VEGF能有效促进坏死股骨内新生血管形成及其生长成熟，能在坏死局部建立新的微循环，促进坏死组织的吸收和新骨形成。

有研究发现，VEGF的受体基因VEGFR-2表达能够促进微血管新生和生成^[22-23]，影响影响受损部位血管的生成。对HIF-1α联合VEGF对基因VEGFR-2表达影响，作者日后将深入研究调控血管生成机制。此外，在促血管新生信号转导途径中，该文并没有阐明HIF-1α联合VEGF基因对其通路的影响机制，这需要在日后进一步分析。

HIF-1α在治疗骨损伤疾病方面应用较广泛，它控制着下游基因VEGF的表达，VEGF联合突变型HIF1α在损伤部位修复过程及血管生成过程中起着至关重要的作用。此次实验可以说明，内皮祖细胞在股骨头坏死组织修复过程中起到一定的血管再生作用，但是VEGF联合突变型HIF1α的促血管生成作用更强。利用VEGF联合突变型HIF1α的促血管生成作用，这是基因治疗骨创伤、骨坏死等疾病的新途径，为临床治疗股骨头坏死提供新的方法和策略。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

血管内皮生长因子联合突变型低氧诱导因子1α的促血管生成作用

Vascular endothelial growth factor combined with mutant hypoxia-inducible factor 1alpha promotes angiogenesis

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[1]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[2]	刘聪, 刘肃. miR-17-5p调控低氧诱导因子1α介导脂肪细胞分化及血管生成的分子机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1069-1074.
[3]	陈思奇, 先德彬, 徐荣胜, 覃中杰, 张磊, 夏德林. 羟基磷灰石-磷酸三钙支架复合骨髓间充质干细胞和人脐静脉内皮细胞对大鼠颅骨缺损修复早期成血管的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3458-3465.
[4]	代敏, 王帅, 张霓霓, 黄桂林, 余丽梅, 胡小华, 易杰, 姚礼, 张立刚. 低氧预处理人羊膜间充质干细胞的生物学特征[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(19): 3004-3008.
[5]	陶贵录, 楚同彬, 张雷. 骨髓间充质干细胞条件培养基加入罗格列酮后促进内皮祖细胞的增殖与迁移[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(1): 56-60.
[6]	李树源, 周琦石, 李悦, 周宏亮, 杨佳宝, 胡柽. 不同组织部位诱导膜血管化及成骨因子表达的比较[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(5): 667-672.
[7]	曹国龙, 田发明, 刘家寅. 洛伐他汀联合胰岛素干预双侧卵巢切除2型糖尿病SD模型大鼠骨折的愈合[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(5): 673-681.
[8]	李文波, 石杰, 时培晟, 薛云, 黄强, 李闯兵, 高秋明. L-精氨酸通过L-Arg-NO途径促进大鼠背部跨区皮瓣的成活[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(29): 4632-4637.
[9]	刘国铭, 王钦奋, 林克凤, 周仕国, 陈祖星, 林世水. 全身应用神经生长因子对大鼠胫骨干骨折早期愈合作用及骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子表达的影响[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(29): 4680-4685.
[10]	耿康, 丁晓斌, 田新立, 王雪, 杨雨婷, 颜洪. 电刺激糖尿病模型大鼠创面的愈合及血管生成[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(26): 4152-4156.
[11]	项海东, 程东梅, 郭晗, 高琪. 前列腺素E1联合碱性成纤维细胞生长因子干预人牙髓干细胞增殖和血管生成能力的变化[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(25): 4006-4011.
[12]	曹百川, 曾高峰, 高云兵, 邓贵营, 岑忠喜, 张传阳, 郭彦德, 宗少晖. 热休克内皮细胞诱导骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(19): 3023-3028.
[13]	钱洲曜, 王勇平. 血管内皮生长因子有望成为加速骨折愈合的全新治疗手段[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(17): 2759-2769.
[14]	曹阳, 胡萍, 田敏, 韦芳, 顾青, 吕红彬. 6-磷酸果糖激酶-2/果糖-2，6-二磷酸酶3对人脐静脉内皮细胞管腔形成的影响[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(14): 2217-2222.
[15]	陈婷, 李心竹, 徐稳安. 外泌体和细胞因子促进牙髓血管生成的作用与调控机制[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(14): 2263-2270.