2.1  实验动物数量分析  实验选用SD大鼠36只，分为3组，实验过程无脱失，全部进入结果分析。   

2.2  microCT测量大鼠骨密度  假手术组、骨质疏松组和伊班膦酸钠组骨密度值分别为(406.89±15.64)，(299.17± 15.30)，(352.17±17.50) g/L。与假手术组比较，骨质疏松组及伊班膦酸钠组骨密度值明显下降，而伊班膦酸钠组骨密度值较骨质疏松组明显上升(均P < 0.05)。

2.3  甲苯胺蓝染色观察髁突软骨形态学变化  假手术组大鼠髁突软骨组织细胞排列整齐，界限分明，肥大层细胞胞核大而深染。骨质疏松组软骨细胞层及肥大层厚度明显变薄，部分区域厚薄不一。伊班膦酸钠组各层细胞未出现明显的退行性变，但肥大层厚度明显增厚，见图1。

2.4  TUNEL染色观察细胞凋亡情况  各组大鼠凋亡细胞可见于增殖层、软骨细胞层及肥大层，在软骨下骨分布也较多；假设假手术组TUNEL阳性细胞数为1，骨质疏松组和伊班膦酸钠组大鼠髁突软骨及软骨下骨凋亡细胞数均高于假手术组，而伊班膦酸钠组凋亡细胞数明显低于骨质疏松组(P < 0.05)，见图2。

2.5  TRAP染色观察各组破骨细胞抑制效果  与假手术组比较，骨质疏松组TRAP阳性细胞数增多(P < 0.05)，而与假手术组或骨质疏松组比较，伊班膦酸钠组TRAP阳性细胞数明显下降(P < 0.05)，见图3。

2.6  免疫组织化学检测各组大鼠髁突软骨牙本质基质蛋白1表达  牙本质基质蛋白1主要表达于软骨细胞胞浆内。与假手术组比较，骨质疏松组牙本质基质蛋白1蛋白表达下降(P < 0.05)。经伊班膦酸钠治疗后，伊班膦酸钠组牙本质基质蛋白1蛋白表达较骨质疏松组上升，但仍低于假手术组(均P < 0.05)，见图4。

2.7  Western blot检测各组大鼠髁突软骨组织中Caspase3、Bcl-2、Bax的表达  与假手术组相比，骨质疏松组Caspase3、Bax表达明显上调，Bcl-2表达下降；与骨质疏松组相比，伊班膦酸钠组Caspase3、Bax表达水平下降，Bcl-2表达水平上调，而与假手术组相比，伊班膦酸钠组Caspase3、Bcl-2表达上调，Bax表达无明显差异，见图5。

髁突软骨是颞下颌关节的主要组成部分，也是重要生长中心，在颞下颌关节的生长、发育、改建和修复中起重要作用^[1]。髁突软骨的发育过程中，需要多种生长因子、转录因子及其他信号分子的协调作用。凋亡也可能在髁突软骨发育中发挥重要作用，MATSUDA等^[2]研究显示，出生后凋亡细胞主要集中在髁突肥大软骨细胞层、软骨细胞增殖层，认为颞下颌关节腔形成、软骨改建可能与软骨细胞凋亡有关。双膦酸盐类药物是一种新型骨吸收抑制剂，能有效抑制破骨细胞的活性和功能^[3]。伊班膦酸钠具有高效、低毒和使用方便等优点，可口服也可静脉给药，除了治疗恶性肿瘤骨转移外还可预防和治疗骨质疏松症，且副反应严重程度和发生率较前代药物都有不同程度降低。

目前双膦酸盐类药物是治疗骨质疏松的首选药物，但对髁突软骨作用研究甚少^[4]。因此实验通过建立骨质疏松大鼠模型，观察伊班膦酸钠干预后各组大鼠髁突软骨组织形态变化，检测半胱氨酸蛋白酶3(Caspase3)、Bcl-2、Bax和牙本质基质蛋白1蛋白表达，探究双膦酸盐类药物对髁突软骨的可能作用机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  随机对照动物实验。

1.2  时间及地点  实验于2018年3月至2019年4月在南华大学医学实验室完成。

1.3  材料

1.3.1  实验动物及分组  SPF级雌性SD大鼠36只，6月龄，体质量250-300 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，实验动物许可证号：SCXK(湘)2018-0016。实验前适应性饲养1周。大鼠随机分组为假手术组、骨质疏松组及伊班膦酸钠组，每组各12只。所有的实验过程均已告知动物伦理委员会并征得其同意。

1.3.2  试剂与仪器  伊班膦酸钠注射液(购于河北医科大学生物医学工程中心)；Caspase3抗体、牙本质基质蛋白1抗体、Bcl-2抗体、Bax抗体(均购于沈阳万类生物科技有限公司)；TRAP 试剂盒(Sigma,美国)；TUNEL试剂盒(德国Roche公司)；microCT(Locus SP，美国GE)；光学显微镜(DM2500，德国Leica)；Western blot蛋白电泳仪(DYCZ-24DN，北京六一)。

1.4  实验方法

1.4.1  建立骨质疏松大鼠模型并分组干预  采用1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠后，于腹卧位固定大鼠，背部常规消毒，在距背侧髂嵴顶部上方1 cm处，分别在腰椎骶嵴肌两侧各行约1 cm的纵行切口，打开腹腔，全程无菌操作。骨质疏松组和伊班膦酸钠组均切除双侧卵巢后逐层缝合肌肉皮肤；假手术组不切除卵巢，仅切除与双侧卵巢等质量的少许脂肪组织后缝合。术后1周，伊班膦酸钠组予以腹腔注射伊班膦酸钠10 μg/kg，每隔7 d注射1次，90 d后取材。骨质疏松组及假手术组予以腹腔注射等量的生理盐水。各组大鼠均自由摄取标准大鼠饲料，自由饮用蒸馏水，室温(22±2) ℃。

造模成功标准：将大鼠处死后，取其右侧股骨，测量骨密度值。

1.4.2  取材方法  将大鼠处死后，直接取双侧髁突软骨，左侧髁突软骨组织固定处理后用于TRAP染色、TUNEL染色、免疫组织化学检测，右侧髁突软骨组织将血迹洗净并沥干后，-80 ℃冰箱中保存，备用。

1.4.3  甲苯胺蓝染色观察各组髁突软骨组织变化  将取出的左侧髁突软骨组织经40 g/L多聚甲醛溶液固定12 h，乙二胺四乙酸脱钙3周后，常规脱水、石蜡包埋、连续切片脱蜡至水，厚度约5 μm，行甲苯胺蓝染色，中性树胶封固，显微镜下观察。

1.4.4  TUNEL法检测髁突软骨组织中的凋亡细胞  取石蜡切片，常规脱蜡、水化，滴加平衡缓冲液于样本上，室温平衡10 min，滴加胃蛋白酶K，盖上盖玻片以确保其分布均匀，于37 ℃消化20 min，去除盖玻片，滴加双氧水甲醇溶液，室温放置30 min；PBS浸泡5 min×3次，滴加50 μL TUNEL工作液，盖上盖玻片，于37 ℃、潮湿环境中孵育1 h。荧光显微镜下观察，用图像分析软件采集图像，并对TUNEL阳性细胞数结果进行统计。

1.4.5  TRAP染色观察组织形态变化  切片常规脱蜡，脱水，按照产品说明书行TRAP染色，各组切片于显微镜下采集图像。随机选取5个高倍(×400)视野，TRAP染色阳性可见细胞质染成紫红色，计算阳性细胞总数。

1.4.6  免疫组织化学检测髁突软骨组织中牙本质基质蛋白1的蛋白表达  取石蜡切片，常规脱蜡、水化，于体积分数3%过氧化氢甲醇溶液室温封闭15 min，水洗，PBS冲洗浸泡2 min，置于绵羊血清工作液封闭15 min，滴加稀释的牙本质基质蛋白1一抗，4 ℃孵育过夜，再滴加二抗室温孵育1 h，DAB显色，苏木精衬染，脱水透明，封固。用图像分析软件采集图像，以髁突软骨内阳性信号强度的IOD为参数，进行半定量分析。

1.4.7  Western blot检测髁突软骨组织中Caspase3、Bcl-2、Bax的蛋白表达  于液氮中取出约100 mg髁突软骨组织提取总蛋白，BCA蛋白浓度检测试剂盒行蛋白含量测定。SDS-PAGE 凝胶电泳分离、转膜后，采用含5%脱脂奶粉的TBST封闭液封闭1.5 h。加入封闭液稀释过的的Caspase3、Bcl-2、Bax一抗，4 ℃孵育过夜，洗片，加入二抗，室温孵育1.5 h，显影成像。

1.5  主要观察指标  ①microCT测量大鼠骨密度；②甲苯胺蓝染色观察大鼠髁突软骨形态学变化；③TUNEL染色观察大鼠细胞凋亡情况；④TRAP染色观察大鼠破骨细胞抑制效果；⑤免疫组织化学检测大鼠髁突软骨牙本质基质蛋白1表达；⑥Western blot检测大鼠髁突软骨组织中Caspase3、Bcl-2、Bax的表达。

1.6  统计学分析  采用SPSS 18.0软件进行统计学分析，计量数据以x(_)±s表示，采用单因素方差分析，组间比较用t检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

骨质疏松是一种以骨量减少、骨组织微结构破坏、骨骼脆性增加和易发生骨折为特征的全身性疾病^[6-7]。许多学者认为将大鼠去除卵巢能够模拟人类绝经后骨质疏松状态，因此实验中广泛采用雌性大鼠去除双侧卵巢制作骨质疏松模型^[5]。此次研究中，microCT测定大鼠骨密度结果显示，骨质疏松组和假手术组骨密度值有显著性差异(P < 0.05)，这说明实验骨质疏松造模成功。

髁突软骨是继发性软骨，由纤维软骨构成，与原发性软骨在其分区、细胞排列以及生长因子分布等方面均不相同^[8]。研究报道，在多种生长因子和信号分子的调控下髁突软骨增殖层细胞会向深层迁移，最终进入软骨分化阶段^[9]。此次研究甲苯胺蓝染色结果显示，伊班膦酸钠组髁突肥大层厚度较骨质疏松组明显增厚，提示伊班膦酸钠能够促进增殖软骨细胞向肥大层迁移，影响髁突软骨组织形态。

以往研究认为，破骨细胞调控骨质疏松过程中，与许多炎性因子相互作用，激活凋亡信号通路，从而引起细胞的凋亡^[10-11]。伊班膦酸钠作为第三代双膦酸盐类药物，已被证实能够提高骨密度、减少破骨细胞的活性以及减少骨细胞凋亡等效应，但对髁突软骨细胞凋亡研究较少^[12]。研究中TUNEL和TRAP染色结果显示，骨质疏松组和伊班膦酸钠组大鼠髁突软骨凋亡细胞数及TRAP阳性细胞数均高于假手术组，而伊班膦酸钠组凋亡细胞数及TRAP阳性细胞数较骨质疏松组明显下降，提示双侧卵巢切除后，雌激素水平降低从而增加了骨转化速率，使髁突软骨及软骨下骨凋亡细胞数及破骨细胞增加，而伊班膦酸钠的短期使用，能减少破骨细胞的活性，抑制凋亡信号通路，进而使髁突软骨细胞的凋亡下降；同时破骨细胞减少，还能减少钙化软骨吸收，这也部分解释伊班膦酸钠组肥大层增厚的原因。

细胞凋亡是机体维持自身稳定的一种基本生理机制，其过程受多种基因调控^[13]。Bcl-2和Bax分别起到抑凋亡和促凋亡作用，它们的相对表达量影响着细胞的存亡^[14]。研究表明，在接收死亡刺激后，Bcl-2蛋白失活，引起细胞器功能丧失，迫使其释放促凋亡因子，进而线粒体中细胞色素C释放到胞质后可激活Caspases，引发级联反应，导致细胞凋亡^[15]。Caspases是一类在细胞凋亡中起关键作用的蛋白酶家族，其中caspase3在凋亡的信息传递中居于核心地位^[16-18]。Western blot结果显示与假手术组相比，骨质疏松组Caspase3、Bax表达明显上调，Bcl-2表达下降；与骨质疏松组相比，伊班膦酸钠组Caspase3、Bax表达水平下降，Bcl-2表达水平上调，而与假手术组相比，伊班膦酸钠组Caspase3、Bcl-2表达上调，Bax表达无明显差异。这提示双膦酸盐药物可能通过Caspase3、Bcl-2、Bax的信号途径参与了骨质疏松状态下髁突软骨的细胞凋亡；牙本质基质蛋白1是牙骨质、骨和软骨组织等矿化中一种酸性非胶原性基质蛋白，研究证实它不仅是调节因子，也是生物矿化的信号分子，广泛分布于多种组织中，对硬组织的矿化具有重要意义^[19-20]。免疫组织化学结果显示，骨质疏松组牙本质基质蛋白1蛋白表达下降，而经伊班膦酸钠治疗后牙本质基质蛋白1蛋白表达上升，这提示由于骨质疏松的大鼠骨细胞凋亡增加，可能使分泌的牙本质基质蛋白1蛋白下降，而经治疗后破骨细胞及凋亡细胞减少，从而使分泌的牙本质基质蛋白1蛋白上升。

综上所述，伊班膦酸钠能影响大鼠破骨过程，使髁突软骨组织形态学发生改变；另一方面，研究也证明伊班膦酸钠可以有效提高骨质疏松大鼠骨密度，是治疗骨质疏松的有效药物。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：

伊班膦酸钠：是最新一代即第3代双膦酸盐药物，具有高效、低毒和使用方便等优点，同时有口服和静脉两种剂型，是不可多得的双膦酸盐药物。近年来国外的研究取得了突破性进展，除了治疗恶性肿瘤骨转移外，还能预防骨转移和乳腺癌骨转移后骨骼事件的发生，并可预防和治疗骨质疏松症。

Caspases：是一类在细胞凋亡中起关键作用的蛋白酶家族，其中caspase-3在凋亡的信息传递中居于核心地位。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

骨质疏松是一种以骨量降低、 骨微结构破坏、 骨脆性增加、骨强度下降、骨折风险性增大为特征的全身性 、代谢性骨骼系统疾病 , 可分为原发性骨质疏松症和继发性骨质疏松症 。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程