牙胚细胞体外培养过程中成牙基因的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.02.006

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (2): 193-198.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.02.006

• 组织构建细胞学实验 cytology experiments in tissue construction • 上一篇下一篇

牙胚细胞体外培养过程中成牙基因的表达

巴娇娇¹，何惠宇¹，胡杨¹，马嵋²，韩祥祯¹

新疆医科大学第一附属医院，1口腔修复科，2新疆医学动物模型实验室，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054

收稿日期:2013-11-29 出版日期:2014-01-08 发布日期:2014-01-08
通讯作者: 何惠宇，博士，主任医师，博士生导师，新疆医科大学第一附属医院口腔修复科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054
作者简介:巴娇娇，女，1987年生，新疆维吾尔自治区察布查尔锡伯自治县人，锡伯族，新疆医科大学在读硕士，主要从事口腔修复学临床及基础的研究。
基金资助:
新疆维吾尔自治区科技厅科技支疆项目(201291173)

Odontogenesis-related gene expression during in vitro culture of tooth germ cells

Ba Jiao-jiao¹, He Hui-yu¹, Hu Yang¹, Ma Mei², Han Xiang-zhen¹

1Department of Prosthodontics, 2Animal Model Laboratory of Xinjiang, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Received:2013-11-29 Online:2014-01-08 Published:2014-01-08
Contact: He Hui-yu, M.D., Chief physician, Doctoral supervisor, Department of Prosthodontics, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Ba Jiao-jiao,Studying for master’s degree, Department of Prosthodontics, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
Science and Technology Project of Science and Technology Department of Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. 201291173

摘要/Abstract

摘要：

背景：多项实验表明牙胚组织在不同的时间点有不同的基因发挥作用，共同促进牙胚发育。
目的：观察牙本质基质蛋白1、成釉蛋白、Ⅰ型胶原蛋白和同源异型盒基因1在大鼠牙胚细胞体外培养的不同时间的表达。
方法：对体外培养后第1，3，6天的牙胚细胞提取RNA，反转录后采用实时定量PCR的方法检测牙本质基质蛋白1、成釉蛋白、Ⅰ型胶原蛋白和同源异型盒基因1mRNA相对表达水平的变化。
结果与结论：牙胚细胞中牙本质基质蛋白1、成釉蛋白和Ⅰ型胶原蛋白mRNA的表达随培养时间的延长而增加，在培养3 d时达到峰值(P < 0.05)，而同源异型盒基因1 mRNA的表达随培养时间的延长而下降(P < 0.05)。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 组织工程, 口腔组织工程, 牙胚细胞, 培养, 牙本质基质蛋白1, 成釉蛋白, Ⅰ型胶原蛋白, 同源异型盒基因1

Abstract:

BACKGROUND: Some studies have indicated that different genes in tooth germ tissue play a role at different time, contributing to tooth germ development.
OBJECTIVE: To observe the expressions of dentin matrix protein 1, enamel protein, collagen I and homeobox gene 1 at different stage of in vitro culture of tooth germ cells.
METHODS: RNA from tooth germ cells was extracted at days 1, 3, 6 of in vitro culture. After reverse transcription, real-time quantitative PCR detection was adopted to measure relative expression of dentin matrix protein 1, enamel protein, collagen I and homeobox gene 1 mRNA.
RESULTS AND CONCLUSION: Dentin matrix protein 1, enamel protein, and collagen I mRNA expressions increased with culture time, and reached the peak at day 3 (P < 0.05), whereas homeobox gene 1 mRNA decreased with culture time (P < 0.05).

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: cell culture techniques, tooth germ, gene expression, odontogenesis

中图分类号:

R318

巴娇娇，何惠宇，胡杨，马嵋，韩祥祯. 牙胚细胞体外培养过程中成牙基因的表达[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(2): 193-198.

Ba Jiao-jiao, He Hui-yu, Hu Yang, Ma Mei, Han Xiang-zhen. Odontogenesis-related gene expression during in vitro culture of tooth germ cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(2): 193-198.

图/表（结果） 4

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引言

牙本质基质蛋白1作为重要的成骨因子，参与了牙胚的形成与分化^[1]，并且是在牙本质矿化中起着重要的作用^[2]。成釉蛋白可以促进釉质基质矿化^[3]。Ⅰ型胶原是骨有机质的主要成分，在骨的增殖与分化、骨质的形成和吸收、骨质钙化等过程中起着非常重要的作用^[4]。同源异型盒基因1一般表达于磨牙区，并且调控间充质细胞向成牙方向分化，进一步调控牙齿的形态^[5]。

近些年关于牙胚组织分化或组织工程牙的研究的热点在于揭示牙胚细胞分化过程中的基因表达时空模式，探究成牙信号网络的表达机制，那么，体外培养牙胚细胞，研究牙胚细胞中牙本质基质蛋白1、成釉蛋白、Ⅰ型胶原蛋白和同源异型盒基因1等这些基因的表达量，可评估其成牙功能，为构建组织工程牙提供良好的种子细胞。如Young等^[6]将酶消化的牙胚细胞悬液，接种到聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架上，培养一段时间后获得牙齿结构有序排列的磨牙牙冠，表明牙胚细胞可以作为牙组织工程的种子细胞，与基质支架相互作用，最终生成牙齿。

汪平等^[7]研究表明牙胚的较长期体外培养则导致牙乳头细胞变性、坏死。Thesleff^[8]从17 d龄胎鼠取第一磨牙牙乳头，成功进行了单层培养，并与分化的牙龈间充质和未分化的下颌间充质细胞进行了形态比较，牙乳头细胞较大而扁平，胞浆突起多。而如何获得比较多的牙胚细胞并且进行体外培养后研究其相关基因的报道未见。

实验重点研究牙胚细胞体外培养后不同天数的牙本质基质蛋白1、成釉蛋白、Ⅰ型胶原蛋白和同源异型盒基因1的表达特性，为进一步将其作为组织工程牙的种子细胞奠定基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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材料方法

设计：观察性实验。

时间及地点：细胞培养实验于2012年7月至2013年5月在新疆医科大学第一附属医院医学研究中心细胞生物学实验室完成，其余实验于2013年5至8月在新疆医科大学第一附属医院医学研究中心生物学实验室完成。

材料：

实验动物：取出生后4 d的SD乳鼠12只，由新疆医科大学医学实验动物中心提供，实验动物生产许可证编号为SCXK(新)2003-0001。动物饲养在室温18-24℃，湿度40%-60%的环境中，昼夜规律光照，实验符合动物伦理学要求。

方法：

大鼠牙胚组织的获得：取乳鼠12只，脊椎脱臼法处死后在无菌条件下用眼科剪分离下颌骨，提取牙胚组织放入有4 mL全培养基的15 mL离心管中，共3管。

大鼠牙胚细胞的培养：将牙胚组织倒入3个60 mm的培养皿中，用眼科剪剪碎牙胚组织合并稀释后为0.25%胰蛋白酶进行消化，以3 000 r/min离心5 min去除胰蛋白酶，加入完全培养基(含有低糖DMEM培养基，体积分数10%胎牛血清，1%青链霉素混合液)重悬细胞，接种于3个25 cm的培养瓶中，之后每3 d换液1次，用倒置显微镜观察待细胞长到80%-90%时提取培养后第1，3，6天牙胚细胞的RNA。

牙胚细胞体外培养及基因分析的主要实验试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
低糖DMEM培养基，胎牛血清，0.25%胰蛋白酶，DPBS	美国HyClone公司
青链霉素混合液	北京索莱宝科技有限公司
TRIzol^®试剂	美国Invitrogen公司
氯仿，异丙醇，体积分数75%乙醇，Taq DNA聚合酶，RevertAid™第一链cDNA合成试剂	美国Fermentas公司
SYBR Premix Ex Taq(Perfect Real Time)试剂盒，PMD19-T载体	中国TaKaRa 公司
回收琼脂糖凝胶DNA试剂盒	美国Omega 公司
质粒小提试剂盒，DH5α感受态细胞	天根生化科技北京有限公司
生物安全操作柜，Multifuge X1R离心机，ND-1000型微量紫外分光光度计	德国Thermo公司
DYY-7C型电泳仪	上海沪粤明科学仪器有限公司
Gel Doc XR+型电泳凝胶成像仪，C1000型梯度聚合酶连反应仪	美国Bio-RAD公司
HZD-C型空气浴振荡器	哈尔滨东联电子技术开发有限公司
1×71倒置荧光显微镜	日本Olympus公司

实时定量反转录PCR检测大鼠牙胚细胞中牙本质基质蛋白1、成釉蛋白、Ⅰ型胶原蛋白和同源异型盒基因1mRNA的表达：用Trizol法提取RNA，经紫外分光光度计测定RNA浓度及凝胶电泳检测RNA的完整性(图1)。

两步法RT-PCR反应进行分析。参照Genebank中的基因序列，设计相关基因的引物，所有引物由TaKaRa公司合成。

引物序列：

引物	序列	扩增片段长度(bp)	对应的基因序列在Genebank中的网址
牙本质基质蛋白1	正向引物：5'-ACC ACA ATA CTG AAT CTG AAA GCT C-3' 反向引物：5'-TGC TGT CCG TGT GGT CAC TA-3'	141	http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_016779.2?report=GenBank
成釉蛋白	正向引物：5'-ATC ATC AGG CCT GGG AGC A-3' 反向引物：5'-TCA CTA GGG ACA GGA ACA GGA TCA-3'	89	http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_009664.1?report=GenBank
Ⅰ型胶原蛋白	正向引物：5'-TGC TTG CAG TAA CTT CGT GCC TA-3' 反向引物：5'-CAT GGG ACC ATC AAC ACC ATC-3'	143	http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_007743.2?report=GenBank
同源异型盒基因1	正向引物：5'-AGT TTG CAG TTG CAG GCT TTG-3' 反向引物：5'-GAA CTT GGA GCG TTT GTT CTG G-3'	141	http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_010053.1?report=GenBank
β-actin	正向引物：5'-CAT CCG TAA AGA CCT CTA TGC CAA C-3' 反向引物：5'-ATG GAG CCA CCG ATC CAC A-3'	171	http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_007393.3?report=GenBank

25 μL的聚合酶链反应体系包括：Premic Ex Taq 7.75 μL，模板cDNA 1.5 μL，正向引物和反向引物各 0.5 μL，ddH₂O 14.75 μL，PCR仪设置为94 ℃预变性 5 min，1个循环；94 ℃ 50 s，55 ℃退火45 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min进行总延伸。在相同的PCR反应条件下，4个基因分别设置大鼠的β-actin引物反应作为内参。纯化PCR产物，每个基因分别参照回收琼脂糖凝胶DNA试剂盒的方法：琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，在紫外灯下迅速切取所需条带，称取凝胶块的重量，按照每1 g凝胶加入1 mL固定缓冲剂，60 ℃水浴至凝胶完全溶解(7-10 min)。每隔2.0-3.0 min振荡1次，这期间可以用柱GPS处理液500 μL处理HiBind DNA柱子，10 000×g离心 1 min。将DNA/凝胶混合液转移至套在2 mL收集管的HiBind DNA柱子中，10 000×g离心1 min，倒去滤液，把柱子装回收集管中(HiBind柱一次能装700 μL溶液，若混合液超过700 μL，每次转移700 μL至柱子中，然后重复收集)。加入300 μL固定缓冲液，按上述条件离心，弃去滤液。把柱子重新装回收集管，加入700 μL SPW冲洗缓冲液，按上述条件离心，弃去滤液。重复1次，弃去滤液，把柱子重新装回收集管，13 000×g离心空柱2 min以甩干柱子基质。把柱子装在干净的1.5 mL离心管上，加入30-50 μL 65 ℃预热的Elution Buffer到柱子基质上，室温静置1 min。 ≥13 000×g离心2 min洗脱出DNA。所得产物连接到PMD19-T载体后，用DH5αcoli转化，后提质粒：向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500 μL的平衡液， 13 400×g离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。取1-5 mL过夜培养的菌液，加入离心管中，13 400×g离心1 min，尽量吸除上清。向留有菌体沉淀的离心管中加入250 μL溶液P1(请先检查是否已加入RNase A)，使用移液器彻底悬浮细菌沉淀。向离心管中加入250 μL溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。向离心管中加入350 μL溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。13 400×g离心10 min。将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)，注意尽量不要吸出沉淀。13 400×g离心60 s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。向吸附柱CP3中加入500 μL去蛋白液，按上述条件离心，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放回收集管中。向吸附柱CP3中加入600 μL漂洗液，按上述条件离心，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。重复上一步操作步骤。将吸附柱CP3放入收集管中，按上述条件离心，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加 50 μL洗脱缓冲液EB，室温放置2 min， 13 400×g离心2 min将质粒溶液收集到离心管中。

将产物样品送至上海生工生物工程有限公司进行测序。后进行实时荧光定量RT-PCR，经条件优化，荧光定量PCR反应体系为25 μL，SYBR Premic Ex Taq 12.5 μL，cDNA1.8 μL，上游引物和下游引物各0.5 μL，ddH₂O 9.7 μL，反应参数设置如下：牙本质基质蛋白1、成釉蛋白、β-actin预变性，95 ℃ 3 min，95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，40个循环；Ⅰ型胶原蛋白、同源异型盒基因1预变性，95 ℃ 3 min，95 ℃ 10 s，56 ℃ 30 s ，40个循环。实验重复3次。得出的数据用excel2003软件进行分析，得到每个基因用内参基因归一化后的数值进行统计学分析，得出相对表达量(2^-^△△^CT)。

主要观察指标：大鼠牙胚细胞中牙本质基质蛋白Ⅰ、成釉蛋白、Ⅰ型胶原蛋白和同源异型盒基因ⅠmRNA的表达变化。

统计学分析：数据均以x(_)±s表示，使用SPSS 17.0统计软件(美国SPSS公司)进行处理，多组间比较用方差分析，进一步两两比较使用LSD检验，检验水准α=0.05。P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

牙本质基质蛋白1是一种主要表达于牙本质和骨等矿化组织的基质蛋白，是一种新的富含丝氨酸的酸性磷酸化蛋白^[9]，被George等^[10-11]第一次克隆并证明是骨细胞和成牙本质细胞，在成骨及成牙中都有作用。牙本质基质蛋白1主要表达于分泌成熟的成牙本质细胞、成釉细胞、成骨细胞和成牙骨质细胞^[12]。华芳等^[13]认为牙本质基质蛋白1参与了根方牙槽骨的形成，促进牙齿萌出。逄键梁等^[14]研究结果为牙本质基质蛋白1主要表达于牙胚钟状晚期成熟的分泌型成牙本质细胞中，在牙乳头细胞中有弱表达，提示其可能行使细胞信号作用。George等^[15]发现大鼠牙本质基质蛋白1 mRNA只在牙齿中表达，皮肤、肝脏、颅骨、脑等组织中未见表达，仅表达于成熟分泌的成牙本质细胞，而前成牙本质细胞和牙髓细胞中不表达。Septier等^[16]利用免疫组化的方法发现牙本质基质蛋白1在体外培养的小鼠牙胚中主要表达于成牙本质细胞。综上所述，牙本质基质蛋白1参与了成牙与成骨，在成牙时主要表达于成牙本质细胞，可以提示牙本质基质蛋白1作为一种信号分子促使牙本质的形成及矿化。实验结果认为在培养后第3天是成牙本质细胞增殖较多时期。

成釉蛋白是釉质基质非釉原蛋白中含量最多的一种，最先是由Fukae等^[17]在发育中的牛牙釉质基质中发现，在1996年由Krebsback等^[18]克隆并测序。同年Lee等^[19]对大鼠成釉蛋白的分布进行免疫定位，发现在成釉细胞分泌前期、分泌期和成熟期均出现阳性表达，1998年Begue-Kirn等^[20]用原位杂交的方法发现成釉蛋白 mRNA在小鼠牙胚组织釉细胞、前成牙本质细胞、正在极化的成牙本质细胞及牙尖部的未分化牙髓细胞中都有表达，而在成牙本质中不表达。MacDoungall等^[21]对人成釉蛋白表达进行免疫组化研究时发现，人牙胚分泌期成釉细胞呈阳性表达，在发育中的成牙本质细胞和前期牙本质中呈弱阳性表达。2003年郭鹏等^[22]研究结果表明成釉蛋白在牙胚发育中参与釉质基质形成和矿化过程，影响胶原纤维和牙本质基质的合成，促进成釉细胞对蛋白质的合成和釉质基质蛋白降解。2006年王丽珍等^[3]对昆明小鼠头颅切片进行免疫组化发现成釉蛋白在钟状晚期，釉质成熟期较恒定表达，推测其可促进釉质基质矿化，并维持晶体形状和大小。从上可以推测成釉蛋白可以促进釉质基质矿化。综上所述成釉蛋白在成釉细胞、成牙本质细胞中表达较多，在前成牙本质细胞、前期牙本质中都有表达。实验得出的结果为成釉蛋白在牙胚细胞培养后第3天表达最多，与牙本质基质蛋白1基因一样，可推测培养后第3天时成釉细胞及成牙本质细胞增殖都较多，那么是否可以提示在牙胚细胞发育中牙本质基质蛋白1与成釉蛋白同时在这一阶段起着协同的作用，待今后研究进一步完善也许可以得到结果。

Ⅰ型胶原蛋白以胶原纤维的形式发挥作用，主要功能是作为组织支持物，与细胞的生长分化、增生、组织损伤的修复以及炎症反应、硬化、纤维化等均密切相关^[4]。有研究发现，高水平的Ⅰ型胶原 mRNA 表达反映了成骨细胞的大量形成^[23]。夏欣一等^[24]研究发现Ⅰ型胶原的存在多少影响着骨的韧性，进而会影响到骨的强度，Ⅰ型胶原合成减少会导致骨组织发育不全。综上所述Ⅰ型胶原蛋白对骨质的形成有着重要的作用，并且是作为组织支持物。

实验得出的结果为Ⅰ型胶原蛋白在培养后第3天表达最多，是否可以提示在牙胚细胞发育中Ⅰ型胶原蛋白和牙本质基质蛋白1与成釉蛋白同时在这一阶段起着协同的作用，共同使牙胚发育成为牙齿，待今后研究进一步完善也许可以得到结果。

同源异型盒基因家族属于同源异型盒基因大家族中的歧异同源盒基因，首先在果蝇中被发现，被称为Dista1-Less基因，主要参与果蝇的腿、触角和嘴等附属器的发育^[25]。同源异型盒基因通过严格控制局限模式传递形态发育信息，在牙胚的形态发育过程的调控扮演重要角色^[26]。同源异型盒基因1和同源异型盒基因2基因敲出的转基因小鼠，其上颌磨牙区域的外胚间充质细胞不向成牙细胞方向分化，而向成牙骨细胞方向分化，最终取代磨牙的出现而生成软骨组织，提示其是磨牙发生所必须基因。实验得出的结果为同源异型盒基因1在培养后第1天的相对表达量检测高于培养后第3和6天。是否提示本实验提取的牙胚组织本就为磨牙区，所以培养一开始同源异型盒基因1的表达量就强，到培养后期相对表达量的降低是否与体外培养的环境因素有关有待进一步研究。

综上，在体外条件下，以出生后4 d SD乳鼠牙胚细胞采用消化培养法可以维持其典型的细胞形态。在牙胚细胞体外培养时牙本质基质蛋白1、成釉蛋白、Ⅰ型胶原蛋白在第3天中表达最多，是否这一时期是牙胚细胞增殖和分化较好的时期，也是成釉细胞和成牙本质细胞增殖功能较好的时期，对于它们是否有相互促进或影响的关系，需要进一步探究。通过实验得到最有价值的就是在牙胚细胞体外培养后第3天是一些重要基因表达最强的时期，那么可以通过体外培养牙胚细胞的方式得到这些基因表达最多的时期来进行组织工程牙的探究，这又是一个得到种子细胞的方式。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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