2.1  CHFs/CC复合水凝胶的形貌及红外光谱表征  图2A是CC和CHFs/CC水凝胶样品的宏观形貌，直径均约为    14 mm，高约5 mm，且随着加入CHFs比例的增加，水凝胶由纯白色向淡黄色转变。从横截面观察，CC和CHFs/CC水凝胶均显示出三维互连多孔形貌和纤维成分的掺入使孔壁表面变得粗糙(图2B)，这种互连多孔结构将有利于细胞的渗透、营养物质的运输和代谢废物的清除。进一步对孔径进行分析可知，CC水凝胶的孔径大小为(158.0±37.0) μm，但随着CHFs含量从1∶1增加到2∶1，CHFs/CC复合水凝胶的孔径则由(102.1±26.7) μm减小到(93.5±14.8) μm，使得孔结构变得有些致密。

图2C为CHFs、CC和CHFs/CC样品的红外光谱图。可知，CC水凝胶具有壳聚糖和柠檬酸的特征峰，如波数在     3 100-3 400 cm^-1之间较宽的吸收带为壳聚糖分子内及分子间-OH键和-NH键的伸缩振动峰在同一处叠加的结果，波数在1 557，1 375，894 cm^-1分别为壳聚糖的酰胺Ⅰ、酰胺Ⅲ谱带和β-构型糖苷键的特征峰^[42]；波数在1 716 cm^-1处的吸收特征峰则为柠檬酸的C=O的伸缩振动峰；此外，CC水凝胶在1 557 cm^-1左右产生一个新的特征吸收峰，这主要归结于壳聚糖的氨基与柠檬酸的羧基发生离子交联反应后形成了离子键^[36]。CHFs的红外光谱与CC存在较高的相似性，但CHFs/CC复合水凝胶在波数2 876 cm^-1处出现较尖的峰，而CC水凝胶内未出现，并且在波数约为3 330 cm^-1处的峰强度有所增加，说明在CHFs的-OH基团和壳聚糖的-NH基团间存在氢键作用。

2.2  CHFs/CC复合水凝胶的孔隙率、溶胀性能  由图3A可知，CC水凝胶的孔隙率为81.92%，随着CHFs的添加，CHFs/CC(1∶1)复合水凝胶的孔隙率减少到79.98%，CHFs/CC(2∶1)复合水凝胶的孔隙率进一步降低到67.90%，这与图2B中扫描电镜观察到的结果基本一致。   图3B是CC、CHFs/CC(1∶1)和CHFs/CC(2∶1)水凝胶在PBS中的溶胀动力学。这些水凝胶均在1 min后基本达到最大吸水率，CHFs/CC复合水凝胶的吸水容量低于CC水凝胶，但CHFs/CC(1∶1)复合水凝胶仍表现出较好的吸水溶胀性能，4 h后达到溶胀平衡；由图3C可以发现与CC水凝胶相比，CHFs/CC复合水凝胶的平衡溶胀率下降(P < 0.01)。

2.3  CHFs/CC复合水凝胶的压缩力学性能  湿态和干态下各水凝胶的抗压强度和杨氏模量，见图4A，B。如图所示，CC水凝胶在湿态和干态下的抗压强度分别为3.97，9.08 kPa，添加CHFs之后的两种复合水凝胶均表现出更高的抗压强度，湿态下达到CC水凝胶的两三倍，干态下则达到六七倍，且抗压强度随着CHFs复合量的增加而增加(P < 0.01)。CHFs/CC复合水凝胶的杨氏模量也表现出类似的增强效果，与CC水凝胶相比，CHFs/CC(1∶1)复合水凝胶湿态下的杨氏模量增加1倍(P < 0.01)；当CHFs在CHFs/CC复合水凝胶中的添加比例从1∶1增加到2∶1时，湿态下的杨氏模量从19.04 kPa增加至23.54 kPa，干态下的杨氏模量从573.06 kPa增加至798.56 kPa(P < 0.01)。

在恒定应变(60%)下进行循环压缩-回复实验，以了解CHFs/CC复合水凝胶的能量耗散状况。图4C显示了CC、CHFs/CC(1∶1)和CHFs/CC(2∶1)复合水凝胶的第1次和第10次压缩-回复曲线。滞后回线显示压缩-回复测试期间的能量耗散状况，所有水凝胶都显著地耗散能量，但各组水凝胶的抗压强度均未发生显著下降。通过计算应力-应变曲线下的面积来分析支架的韧性^[33]，结果表明CHFs的添加明显增强了CC水凝胶的韧性。经过一个循环，CC、CHFs/ CC(1∶1)和CHFs/CC(2∶1)复合水凝胶的能量损耗分别达到了54.50%，53.47%和52.22%；第10次循环压缩后，能量损耗则分别下降到了29.45%，24.28%，24.02%，这种下降是由于水凝胶在第10次压缩进行前水凝胶已有一定程度的变形。

2.4  CHFs/CC复合水凝胶的体外降解性能  溶菌酶可破坏壳聚糖中的β-1，4糖苷键并破坏水凝胶的网络结构^[24，43]，通过测量含有10⁵ U/mL溶菌酶的PBS中水凝胶的质量变化来评估CHFs/CC复合水凝胶的降解性质，同时比较各组水凝胶的酶促降解和在PBS中的降解。结果显示，各组水凝胶在6 h内都发生了较大幅度的质量损失，但随着时间增加降解速度明显变缓，并且在含溶菌酶的溶液中的降解速度大于在PBS中的降解速度，见图5A。无论是在PBS中还是酶溶液中，CHFs/CC复合水凝胶的降解速度均低于CC水凝胶。通过测量降解液的pH值，由图5B可知，在整个降解过程中降解液的pH均保持在6.0-7.0，无酸性降解问题。

2.5  CHFs/CC复合水凝胶的细胞相容性评价  图6A为软骨细胞在CC、CHFs/CC(1∶1)和CHFs/CC(2∶1)水凝胶支架中培养7 d后活(绿色)、死(红色)细胞的荧光图像。可知，细胞在各组水凝胶中都呈现相对均匀分布的状态，并且仅观察到微量死细胞。增殖实验表明，所有支架上细胞数量均随着培养时间的延长而增加，但CHFs/CC复合水凝胶上的细胞增殖低于CC水凝胶(P < 0.01)，见图6B。图6C为软骨细胞-水凝胶支架复合物在第4，7天的扫描电镜形貌图，CC水凝胶上的软骨细胞保持椭圆形，并且为单个、稀疏地分布在水凝胶片层的表面，视野内几乎没有观察到铺展状态的细胞；相反，软骨细胞在CHFs/CC复合水凝胶上大都呈现完全铺展的形貌，因此猜想CHFs的掺入使水凝胶孔结构的表面有纤维组分裸露，使支架表面特性发生改变，引起软骨细胞由球状向完全铺展的形貌转变(图6D)。此外，经过几天的细胞培养，水凝胶表面的多孔结构开始模糊，孔与孔之间难以发现明显的界线。

2.6  胶原免疫荧光染色及生化组成分析  软骨细胞可表达多种胶原蛋白，其中透明软骨细胞主要表达Ⅱ型胶原。对于Ⅰ、Ⅱ型胶原的免疫荧光染色，细胞核发出蓝色荧光，Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白发出红色荧光。经过28 d的培养，各组水凝胶上的软骨细胞均呈现多个细胞聚集团簇的形态，胶原主要集中表达于细胞膜、细胞质和核膜，见图7A。从荧光强度上进行比较，Ⅱ型胶原的荧光强度大于Ⅰ型胶原，即细胞在各水凝胶上表达的Ⅱ型胶原更多，并且随着CHFs添加量的增加而上升，见图7B。除此之外，对糖胺聚糖进行定量检测，以测定软骨细胞外基质的分泌情况。图7C为糖胺聚糖的定量测定结果，CC水凝胶中含量最高，为240.2 mg/L，CHFs/CC (1∶1)复合水凝胶次之，为232.4 mg/L，CHFs/CC(2∶1)复合水凝胶最少，为229.1 mg/L，但各组之间均无明显差异。

水凝胶是一类具有三维网络结构的高亲水性高分子材料^[1]，可以吸收大量的水或者生物流体而不溶解，适合用于软骨组织工程支架^[2-4]。天然软骨细胞外基质是一种富含水成分的三维网络结构组织，主要由80%的水和20%的固体成分(如胶原蛋白、蛋白多糖等^[5-6])组成^[6-7]。水凝胶作为软骨支架构建材料已被证实可在支持营养物质和代谢物运输的情况下，将细胞均匀地悬浮在其3D环境中维持诱导软骨细胞表型的圆形形态，并可对所包封的细胞施加受控的力刺激作用^[6]。但是，天然软骨中细胞的柱状取向和胶原纤维排列的各向异性赋予软骨独特的力学性质^[8-9]，这使得常规水凝胶无论在力学性能还是结构特点上均无法满足软骨再生的应用要求^[10]。如何增强水凝胶的力学性能已成为软骨组织工程领域的一个研究热点。

纤维增强是一种方便有效的水凝胶力学性能改进方法，其可通过改变纤维在水凝胶中的负载分数、排列方式等实现^[11]。目前用于增强水凝胶的纤维主要有合成纤维和天然纤维。由电纺丝方法制备的合成纤维如聚乳酸^[12-13]、聚己内酯^[14-15]、聚乙醇酸等具有高比表面积、高强度、结构仿生等优势^[16-19]，但这些合成纤维材料普遍存在的生物活性差、降解产物酸性、表面无活性官能团等问题，促使天然源纤维材料成为研究热点。近年来，天然纤维如亚麻、黄麻、大麻、菠萝和剑麻等因其良好的生物相容性、资源充足可再生、无酸性降解等优势已引起关注^[20]。其中，从农业废弃物玉米壳中提取的纤维素纤维(corn husk fibers，CHFs)是一种尚未被开发利用的纤维材料，具有成本低、产量大、纤维质硬、强度大的优点^[21]。目前已有研究者成功从玉米壳中获得玉米外壳纤维，并对其拉伸性能进行了评估测试^[22]。因此，采用玉米外壳来源的天然纤维增强水凝胶，用于软骨组织再生将是一种新的力学性能改进策略，但相关研究工作还鲜有报道。

壳聚糖是一种由几丁质脱乙酰化制得的阳离子多糖^[23]，其分子结构类似于关节软骨细胞外基质中透明质酸和糖胺聚糖的重复单元^[24-25]，可以诱导关节软骨细胞的功能表达(如Ⅱ型胶原^[26])，因此，壳聚糖基水凝胶可以在某种程度上模拟关节软骨细胞外基质，促进软骨组织形成^[27]。然而，壳聚糖基水凝胶同样存在较差的湿态力学强度^[28]，需要通过化学交联或物理交联方法进行改性增强^[29-35]。课题组先前已研究了多元有机酸柠檬酸对壳聚糖改性的效果，基于柠檬酸羧基与壳聚糖氨基之间发生的离子交联反应，实现了水凝胶在湿态下拉伸力学和压缩力学的显著增强，发现当壳聚糖与柠檬酸的质量比为7∶3时可使柠檬酸改性壳聚糖(citric acid modified chitosan，CC)水凝胶的压缩强度和杨氏模量分别提升3倍和2倍^[36]。基于以上研究基础，将天然纤维作为增强材料引入到CC水凝胶中，同时仿生胶原纤维在天然软骨组织中间区域的杂乱分布，不仅可以进一步改善CC水凝胶的力学性能，还可以实现天然软骨组织成分和结构的仿生。

实验的目的是探究玉米壳来源的CHFs增强壳聚糖基水凝胶用于软骨组织工程支架的可行性。为此，首先从普通的农业废物玉米壳中通过碱煮的方法提取CHFs，然后通过冷冻-解冻法将其引入到CC水凝胶中，并系统地对比了复合不同含量纤维对CC水凝胶形貌、孔隙率、溶胀性能、力学性能、降解性能的影响；最后，在CHFs/CC复合水凝胶上培养兔软骨细胞，评价其细胞相容性及胶原、糖胺聚糖的分泌情况，初步评估该复合水凝胶支架用于软骨组织工程的潜力。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

1.1  设计  体外观察性实验。

1.2  时间及地点  实验于2018年3月至2019年3月在东华大学生物所仿生材料与再生医学研究室完成。

1.3  材料  玉米壳(河南商丘)；壳聚糖，脱乙酰度为86.32%，M_w=9.0×10⁵，浙江金壳生物化学有限公司，见表1。

1.3.1  实验用主要试剂  柠檬酸(优级纯，国药集团化学试剂有限公司)；渗透剂(江苏海安石油化工厂)；无水碳酸钠(Na₂CO₃，上海凌峰化学试剂有限公司)；硫酸(H₂SO₄)、氢氧化钠(NaOH)、无水乙醇(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；硅酸钠(Na₂SiO₃·9H₂O，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；无水亚硫酸钠(Na₂SO₃)、焦磷酸钠(Na₄P₂O₇·10H₂O)、三聚磷酸钠(Na₅P₃O₁₀)(上海麦克林生化科技有限公司)；溶菌酶(20 000 U/mg，北京索莱宝科技有限公司)；PBS(pH=7.4，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)；DMEM/High Glucose培养基(杭州吉诺生物医药技术公司)；胎牛血清、青霉素-链霉素双抗(美国Gibco公司)；胰蛋白酶(上海迈基生物)；CCK-8试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；活/死细胞染色试剂盒(赛默飞世尔科技公司)；Ⅰ、Ⅱ型胶原一抗、Cy3-山羊抗兔二抗、DAPI染料、荧光淬灭封固剂(武汉赛维尔生物科技有限公司)；兔羟脯氨酸ELISA试剂盒(上海凡科维公司)，细胞糖胺多糖总含量二甲基亚甲基蓝比色法定量检测试剂盒(江莱生物科技有限公司)。

1.3.2  实验用主要仪器  FA1004型电子天平(上海舜宇恒平科技有限公司)；Phenom XL型扫描电子显微镜(上海复纳科学仪器有限公司)；NICOLET is10型傅里叶红外光谱仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)；PB100型手持式组织匀浆机(英国PRIMA公司)；KQ3200DE型超声仪(昆山市超声仪有限公司)；Lab-1C-80型冻干机(北京博医康实验仪器有限公司)；H5K-S型万能材料测试仪(英国Hounsfield公司)；SHA-C水浴恒温振荡器(天津塞得利斯实验分析仪器制造厂)；PHSJ-4A型pH测定仪(上海精密科学仪器有限公司)；MULTISKAN MK3型酶标仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)；NIKON TI-S型倒置荧光显微镜(日本Nikon公司)；NIKON ECLIPSE C1型正置荧光显微镜(日本Nikon公司)。

1.4  实验方法

1.4.1  CHFs的制备  首先，将洗净的玉米壳在55 ℃下烘干至衡质量，室温下浸泡于10 g/L渗透剂中处理72 h，以提高玉米壳纤维素的渗透能力；随后用去离子水反复洗涤至完全除去残留渗透剂，并在80 ℃水浴条件下浸泡30 min。然后，将晾干的玉米壳试样在室温下浸于3 g/L硫酸溶液中2 h，以去除半纤维素和果胶等杂质，用去离子水去除残留的酸溶液。最后，为进一步去除半纤维素、木质素、果胶及纤维间质(叶绿素等)，采用表2所示的煮炼工艺对玉米壳进行化学处理^[37]，碱煮Ⅰ、Ⅱ均在100 ℃下保持60 min，最后通过超声分散获得CHFs。制备过程中玉米壳试样与溶液的质量/体积比皆为1 g∶50 mL。

1.4.2  CHFs/CC复合水凝胶的制备 图1为制备CHFs/CC复合水凝胶的工艺流程。步骤如下：室温下将壳聚糖粉末溶解于冰醋酸水溶液配制得到3 g/L的壳聚糖溶液，随后称取一定量的柠檬酸(m_壳聚糖∶m_柠檬酸=7∶3)加入到壳聚糖溶液中搅拌4 h得到CC溶液^[36]。然后，称取一定量的CHFs(CC与CHFs的质量比为1∶1、1∶2)加入到CC溶液中。用手持式组织匀浆机将CHFs分散在CC溶液中得到均匀的悬浮液，并在超声仪中超声30 min除去悬浮液中的气泡。随后移取1 mL悬浮液到24孔板中并置于-7 ℃冰箱冷冻3 d，取出样品在其表面加入适量NaOH溶液(0.5 mol/L)解冻4 h，待样品与孔壁剥离后快速取出，充分浸泡在NaOH溶液中继续解冻1 h，用大量去离子水冲洗样品至中性，获得CHFs/CC复合水凝胶。最后，使用冻干机将CHFs/CC复合水凝胶样品冻干。同样方法制备不含CHFs的CC水凝胶用于对照。

1.4.3  CHFs/CC复合水凝胶的结构及性能表征

形貌观察：用光学照相机拍摄水凝胶整体形貌。用扫描电镜观察水凝胶截面形貌，方法为将冷冻干燥后的CC、CHFs/CC水凝胶样品用液氮脆断成适当大小，然后用导电胶固定在样品台上，使用扫描电镜在10 kV加速电压下进行观察。

红外光谱测试：使用傅里叶红外光谱仪在室温下记录CC、CHFs及CHFs/CC水凝胶样品的傅里叶红外光谱，扫描分辨率为0.4 cm^-1，扫描次数为32次，扫描波数为      4 000-500 cm^-1。

孔隙率测试：基于液体置换法采用无水乙醇测定CC、CHFs/CC(1∶1和2∶1)水凝胶样品的孔隙率^[36]。步骤如下：称量干态下的样品质量，记为m；将样品完全浸泡在无水乙醇中2 h，取出样品并称量样品质量，记为m’；按公式(1)确定样品的孔隙率。每组3个平行样。

其中，ρ是乙醇在20 ℃下的密度(0.789 g/mL)，V是样品体积。

溶胀性能测试：采用常规称重法测定CC、CHFs/CC(1∶1和2∶1)水凝胶样品的溶胀性能^[36]，以间接反映水凝胶植入体内后从周围环境中吸收组织液质量和速率快慢情况。将冷冻干燥后的样品称质量，记为m₀；随后，将样品完全浸没入PBS(pH=7.4)中，保持在37 ℃水浴中，分别在1，2，3，4，5 min和4 h时取出样品进行称量，记为m_t(t=1，2，3，4，5 min和4 h)，按公式(2)计算各时间点下的样品吸水率和4 h时的溶胀率。每组3个平行样。

压缩力学性能测试：使用万能材料测试仪测定CC、CHFs/CC(1∶1和2∶1)水凝胶样品的压缩力学性能和循环压缩力学性能。对于干态测试，将冻干的水凝胶样品压缩至自身形变60%时观察其受力情况，压缩速率为5 mm/min，力传感器50 N。对于湿态测试，实验前将水凝胶样品完全浸泡在PBS中4 h，其他测试参数与干态下一致；对于湿态循环压缩力学性能测试，将浸泡在PBS中4 h后的样品压缩至自身形变的60%，如此做10次循环压缩，观察水凝胶的力学性能变化。每组8个平行样。

降解性能测试：使用溶菌酶研究CC、CHFs/CC(1∶1和2∶1)水凝胶样品的体外降解情况^[38]。根据文献[39]，将水凝胶样品在PBS中平衡1 h，随后取出水凝胶样品并称质量，记为m₀。将样品分成2组，第一组的各水凝胶样品浸泡于5 mL的PBS(pH=7.4)中，第二组的各水凝胶样品浸泡于5 mL的溶菌酶/PBS(10⁵ U/mL，pH=7.2)中，保持在37 ℃恒温水浴中，100 r/min分别震荡6 h、12 h、24 h、3 d、     7 d，每个时间点取出样品并称质量，记为m_e。根据公式(3)计算水凝胶的降解率。与此同时，使用pH测定仪测量各时间点下降解液的pH值。每组3个平行样。

1.4.4  CHFs/CC复合水凝胶的细胞相容性评价

细胞种板及增殖检测：在含体积分数10%胎牛血清、1%双抗的DMEM高糖培养基中培养新西兰兔关节软骨细胞(由上海市第九人民医院提供)。将水凝胶紫外灭菌过夜，体积分数75%乙醇浸泡2 h，PBS清洗后加入培养液，在37 ℃下预培养8 h以上。随后，将20 μL兔软骨细胞悬浮液(含5×10⁴个细胞)种植到CC、CHFs/CC水凝胶样品的顶部，培养2 h后补充500 μL培养基进行细胞培养，隔天更换培养基。使用CCK-8试剂盒检测在1，4，7 d时软骨细胞的增殖情况。

细胞活死染色：为确定细胞的活力及培养7 d后细胞在CC、CHFs/CC(1∶1和2∶1)水凝胶支架内的生长状况，使用活/死细胞染色试剂盒进行染色。在PBS(pH=7.4)中准备工作染色溶液，钙黄绿素-AM能将活细胞染成绿色，碘化丙啶(PI)能将死细胞染成红色。将细胞-支架复合物在工作溶液中于20-25 ℃温育15 min，然后在倒置荧光显微镜下使用450-490 nm的荧光激发进行成像，成像前用PBS洗涤样品。

细胞形貌观察：为评估软骨细胞在CC、CHFs/CC  (1∶1和2∶1)水凝胶支架内的附着/增殖情况，将接种4，7 d后的细胞-支架复合物用PBS(pH=7.4)清洗2次，以除去未黏附的细胞，随后用40 g/L多聚甲醛固定1 h，并使用乙醇梯度脱水，然后将样品冻干并用金溅射后通过扫描电镜观察。

1.4.5  免疫荧光染色及生化组成分析

Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫染色：按1.4.4的方法将软骨细胞分别接种于CC、CHFs/CC(1∶1和2∶1)水凝胶样品的顶部。培养28 d后，将软骨细胞-水凝胶复合物用40 g/L多聚甲醛固定后进行石蜡包埋、切片处理。然后，在爬片中加入破膜工作液以破碎细胞膜，室温孵育30 min，清洗干净之后再滴加牛血清蛋白封闭30 min。随后，轻轻甩掉封闭液，加入一抗并在4 ℃下孵育过夜。第2天，洗涤玻片并甩干，加入二抗覆盖，室温下避光孵育50 min，再次洗涤、甩干后加入DAPI染液，室温下避光孵育10 min。最后，洗去残留的二抗，稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封固，在正置荧光显微镜下观察并采集图像。DAPI染出来的细胞核在紫外激发下为蓝色，红色即为表达的Ⅰ或Ⅱ型胶原，利用ImageJ软件进行荧光定量。

生化组成分析：按1.4.4的方法将软骨细胞分别接种于CC、CHFs/CC(1∶1和2∶1)水凝胶样品的顶部，培养28 d，对软骨细胞-水凝胶复合物样品进行生化分析，定量测定糖胺聚糖含量^[40-41]。在1.5 mL离心管中加入待测样品和染色液，涡旋震荡15 s；随后室温下避光孵育30 min，期间隔   5 min涡旋震荡15 s，出现紫色或粉红色沉淀时即刻放进微型台式离心机离心10 min，速度为13 000 r/min，弃上清；然后加入解离液，再次涡旋震荡15 s，室温下避光孵育    5 min；最后用酶标仪检测630 nm波长下的吸光度；在标准曲线上计算得到待测样品的浓度。

1.5  主要观察指标  各组水凝胶的结构、力学性能、细胞相容性与促软骨细胞功能表达的能力。

1.6  统计学分析  所有数据以x(_)±s表示，采用Origin 8.0软件对实验数据进行分析，以单因素方差分析(One way ANOVA)分析数据间是否有显著性差异。当P < 0.05时认为差异有显著性意义，P < 0.01时认为差异有非常显著性意义。

天然软骨是一种具有极高力学性能的组织，常规的水凝胶无论在力学性能还是结构特点上均无法满足软骨再生的应用要求。壳聚糖基水凝胶可以在某种程度上模拟关节软骨细胞外基质，促进软骨组织形成，但由于湿态下力学性能较差，使壳聚糖在软骨组织工程中的应用受限。纤维增强是一种方便有效的水凝胶力学性能改进方法，天然的玉米外壳具有较强的纵向抗拉强度，然而关于玉米壳纤维增强水凝胶力学性能的相关研究尚未见报道。因此，实验重点探究了玉米壳来源的CHFs增强壳聚糖基水凝胶的增强效果和用于软骨组织工程支架的可行性。

通过冷冻-解冻法制备CHFs/CC复合水凝胶，随着CHFs复合比例的增加，水凝胶由纯白色向淡黄色转变，这种颜色的变化可能是由于解冻过程中氢氧化钠渗透至凝胶内部与CHFs发生化学反应^[44]。扫描电镜结果显示CHFs嵌入凝胶内部并均匀分散，由于具有更多交联网络的水凝胶倾向于形成更小的孔径，因而观察到CHFs/CC复合水凝胶内部的孔径有所下降。傅里叶红外光谱显示，CHFs/CC与CHFs的谱带存在较高的相似性，这主要是由于壳聚糖与纤维素的分子结构具有相似性，但在CHFs/CC复合水凝胶中观察到3 330 cm^-1处峰强度的增加，由此说明壳聚糖和CHFs间有分子间相互作用，即分子间氢键作用增强^[45]。水凝胶的孔隙率在细胞附着、增殖和基质沉积中起关键作用，溶胀性能可以说明水凝胶与外界进行物质交换能力的强弱。与CC水凝胶相比，CHFs/CC复合水凝胶的孔隙率和溶胀性能发生下降，这主要是因为疏水性CHFs内嵌在亲水性水凝胶基质中会影响水凝胶的亲水性。另外，CHFs在水凝胶内部交联缠结形成的网络也导致水凝胶内部更高的交联密度，减缓水分子的渗透作用。虽然目前对用于细胞生长和物质运输的多孔支架内部的最佳孔径尚无共识，但通常建议软骨支架具有高度互连的孔隙，孔隙率高于70%，孔径在100-300 μm之间的支架能更好地促进细胞向内生长^[46]。此外，以上3种水凝胶均可在短时间内达到较高的吸水率，可以确保支架从培养基中吸收营养物质，从而为细胞的存活和增殖提供营养。因此，实验中所设计的纤维复合水凝胶可以满足软骨组织工程支架的要求。

CHFs通过其纤维填充增强作用及壳聚糖和CHFs分子间的氢键作用，对CC水凝胶体系存在明显的力学增强作用，无论是在湿态环境中或是干态环境中，CHFs/CC都表现出比CC自身的杨氏模量和抗压强度高出一两倍的增强效果。同时，在循环压缩中发现随着CHFs添加量的增加，能量损耗略减小，这可能是由于CHFs/CC复合水凝胶中的CHFs在CC内部的互相缠结及与CC界面间的牵掣作用，使得刚性CHFs比柔性CC聚合物链移动得慢，进而导致非常有限的能量耗散。当前，许多组织工程支架的构建材料会选择聚酯类纤维材料，但这类材料的降解方式主要为水解酯键，其产生的酸性降解产物(如：乳酸、乙醇酸等)会引起不利的生物学反应，如无菌炎症反应^[47-49]。同时，组织工程化构建体在体液中的降解动力学决定了支架在再生过程中的力学和结构稳定性。因此，在设计和制备水凝胶支架时也应考虑其降解特性。理想的组织替代物应表现出与新组织再生速率相匹配的降解速率，确保结构支撑与适应新组织生长的协调性^[34]。水凝胶的降解性能取决于其交联程度，交联越密则降解越慢。溶菌酶破坏了壳聚糖的β-1，4糖苷键，使交联网络脱节，即水凝胶内部β-1，4的糖苷键越多，水凝胶降解速率越快。CHFs与壳聚糖之间为分子间氢键作用，不受溶菌酶的降解影响，则CHFs/CC复合水凝胶体系中的β-1，4糖苷键浓度低于CC水凝胶体系，即在相同酶浓度环境下CHFs/CC复合水凝胶体系中被溶菌酶降解的交联网络相对较少，因此掺入CHFs能在一定程度上提高水凝胶的稳定性，这种结构稳定性有利于为软骨组织再生提供相对较为长期的结构支撑。

CHFs作为一种植物纤维可以改善壳聚糖不利于细胞黏附的缺点，同时提高水凝胶支架的生物相容性。细胞活/死染色结果中未见大量死细胞，说明CC、CHFs/CC水凝胶支架上的软骨细胞增殖良好，即CHFs对软骨细胞没有明显的细胞毒性。CHFs/CC(2∶1)复合水凝胶上的软骨细胞增殖能力略低于CC、CHFs/CC(1∶1)水凝胶，猜测这可能与CHFs的引入更利于细胞铺展有关，软骨细胞沿纤维铺展后，纤维复合水凝胶内部供细胞生长、增殖的孔隙进一步减小，例如，CHFs/CC(2∶1)复合水凝胶细胞增殖量小于另外2组，这可能是由于细胞长入的空间有限导致细胞增殖减弱。随着培养时间增加，细胞开始分泌出细胞外基质，覆盖在水凝胶孔洞之间。软骨细胞在体外培养前期主要产生Ⅱ型胶原，随着培养时间以及细胞代数增加，软骨表达Ⅱ型胶原的能力下降，同时Ⅰ型胶原开始出现^[50]。将软骨细胞在CC、CHFs/CC (1∶1)以及CHFs/CC(2∶1)水凝胶体系中分别培养4周，对细胞-支架复合物进行Ⅰ型、Ⅱ型胶原染色以及荧光定量分析，结果发现CHFs/CC复合水凝胶产生Ⅰ型胶原的能力弱于CC水凝胶，而产生Ⅱ型胶原的能力不低于CC水凝胶，说明CHFs的引入提高了水凝胶表达Ⅱ型胶原的能力。此外，软骨细胞在CHFs/CC复合水凝胶上分泌糖胺聚糖的能力也并不低于CC水凝胶，说明CHFs对软骨细胞分泌细胞外基质无有害影响。

总之，实验从农业废弃物玉米外壳提取CHFs，随后通过冷冻-解冻法成功制备了CHFs增强的CC水凝胶支架。发现CHFs纤维的引入对CC水凝胶的力学性能有显著增强效果，并且增强效果与纤维添加量呈正相关。CHFs纤维的引入可使水凝胶的孔径和孔隙率降低，而溶胀及降解性能增强(无酸性降解问题)。生物学实验表明在CHFs/CC复合水凝胶上种植的软骨细胞生长状态良好，说明其具有良好的细胞相容性；Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫荧光染色和糖胺聚糖定量结果显示，CHFs/CC复合水凝胶相比于CC水凝胶对软骨细胞表达细胞外基质无有害影响。这些结果证实了CHFs/CC复合水凝胶作为软骨组织工程支架的潜力。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

文题释义：

纤维素纤维：在天然单子叶植物叶脉中存在的一种叶子纤维，是由纤维素与各种营养物质结合生成的丝状或絮状物，对于植物具有支撑、连接、包裹、充填等作用。纤维素纤维具有极大的抗拉强度和耐腐蚀性，从天然植物中提取纤维素纤维，将其嵌入基质材料中作为增强纤维并形成一种绿色生物复合材料，能显著增强基质材料的力学性能。

糖胺聚糖：是重复二糖单位构成的线性无分支长链多糖，其中二糖重复单元由糖苷键连接的氨基已糖和糖醛酸组成。糖胺聚糖是软骨细胞外基质糖类成分的总称，常见的糖胺聚糖包括透明质酸、硫酸皮肤素、硫酸角质素、硫酸软骨素等。糖胺聚糖上的羧酸和硫酸酯基团会使细胞外基质形成固定的负电荷密度，因此与滑液相互作用时产生渗透压。这种液体的滞留和溶胀作用，以及整齐排列的胶原纤维对糖胺聚糖施加的结构限制(即限制其位移并使其紧密堆积)是软骨组织具有极高力学强度的原因。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

壳聚糖基水凝胶可以模拟软骨细胞外基质的多糖成分，但用于软骨组织工程支架时其湿态下的力学性能较差，同时单纯的壳聚糖水凝胶也不能仿生天然软骨的纤维复合结构。为解决这些问题，研究提出用天然玉米壳纤维素纤维增强的设想。这类纤维来源丰富、力学性能优良、生物相容性良好，与柠檬酸改性的壳聚糖复合后，可显著提高壳聚糖基水凝胶的力学性能，同时保持该水凝胶原有的高吸水性与细胞相容性，为制备壳聚糖基软骨组织工程支架提供了新的思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程